The authors have no acknowledgements.

1. פוליאוריתן (PU) ספוג הכנה כתבנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בספוגי פו לייצר תבניות hydroxyapatite מכילות נקבוביות מקשרים. השתמש בכל ספוג לספק trabeculae העיקרי להיווצרות של תבנית התמוכות כמו גם ההיווצרות של מיקרו-ערוצים בתוך trabeculae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור ולקצץ 80 ppi (נקבוביות לאינץ &#39;) ספוגים לגשר-2 צורות עם ממדים של 3.5 סנטימטר בגובה X 5 ס&quot;מ אורך x 1.5 ס&quot;מ רוחב. הערה: ניתן לבחור המידות וצורות על פי הגודל הנקבובית העיקרי הרצוי: 100 ppi, 80 ppi, ו -60 ppi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך של 4% 100 מיליליטר (w / v) פתרון NaOH באמצעות כוס 150 מיליליטר; אז לטבול ולסחוט עד ספוגים מוכנים הם ספוגים לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההשריה, להניח את הכוס עם ספוגים בultrasonicator (42 קילוהרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultrasonically מראש לטפל בספוגי פו במשך 15-20 דקות ללא חום לשנות את מאפייני פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים מזוקקיםמים למשך 5-10 דקות. בעוד השטיפה, לסחוט ספוגים ולאפשר להם להרחיב את 5 עד 7 פעמים כדי להסיר את NaOH השייר בתוך ספוגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט ספוגים עם מגבות נייר כדי להסיר את עודפי מים; לאחר מכן לייבש אותם בתנור על 60-80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. Hydroxyapatite (HA) Slurry הכנה לציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע slurry HA, למדוד את המשקל של כוס עם בר ומערבבים מגנטי. מדידה זו תשמש לחישוב יחס אבקה / נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 10 גרם של אבקת HA בגודל ננו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של מים מזוקקים לתוך כוס 50 מיליליטר. חום ל120-140 מעלות צלזיוס ומערבבים בעזרת בוחש מגנטי חמה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.3 גרם (3% w / w) של אלכוהול פוליוויניל (PVA) (89,000-98,000 MW) לאבקה במים מזוקקים תוך ערבוב ב300-400 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עד PVA נמס לגמרי. הפתרון צריך להיות ברור לאחר פירוקה של PVA מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל off האש ומוסיפה 0.1 גרם (1% w / w) של תאית carboxymethyl נתרן (CMC) (צמיגות נמוכה במיוחד) לאבקה תוך ערבוב ב400-500 סל&quot;ד. הפתרון צריך להיות ברור לאחר פירוקה של PVA מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עד CMC נמס לגמרי ולהתקרר לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.3 גרם (3% w / w) של פיזור polyacrylate אמוניום לאבקה תוך ערבוב ב300-400 סל&quot;ד. מערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 גרם (2% w / w) של גליצרין לאבקה תוך ערבוב ב300-400 סל&quot;ד. מערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לפזר את אבקת HA לפתרון תוך ערבוב ב600-900 סל&quot;ד וממשיך לערבב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate במשך 5 דקות באמצעות ultrasonicator כדי להבטיח פיזור של כל מסכת של אבקת HA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5 מיליליטר נוסף של מים מזוקקים לתוך התערובת תוך ערבוב ב600-900 סל&quot;ד וחום ב90-100 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיך לערבב את התערובת באמצעות stirrer מגנטי ב600-800 סל&quot;ד ב90-100 מעלות צלזיוס בORDאה להתאדות תוכן המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את כל המשקל כולל הכוס ותערובת מהעת לעת עד יחס אבקה / נוזל של 1.75-1.8 מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב יחס אבקה / נוזל, לחלק את המשקל של האבקה על ידי המשקל הכולל של התערובת (2.14), כולל האבקה, חומרים כימיים, ומים, בניכוי המשקל של הכוס והבוחש (2.1), ובניכוי אבקת HA (2.2). הערה: לדוגמא: אם (תערובת כולה כוללים אבקה, חומרים כימיים, ומים) היא 49.05 G, B (כוס עם בוחש) היא 33.5 גר &#39;, ולאחר מכן C (אבקת HA) הוא 10 גרם. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר slurry להתקרר לRT לפני השימוש לציפוי. </li></ol> 3. HA ציפוי, ייבוש, וSintering <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל ספוגים פו מוכנים עם תרחיף ציפוי HA בעזרת מרית נירוסטה עד slurry מופץ ברחבי homogenously ספוג PU על צלחת זכוכית. הערה: לאחר הסרת ההשמצה העודפתר&quot;י, חלק מהנקבוביות עדיין עשוי להיות סתום עם תרחיף בגלל צמיגות slurry הגבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח קישוריות, אחידות, ונקבוביים פתוחים, מעט לפוצץ את תבניות HA המצופים באמצעות מדחס אוויר. תהליך זה מבטיח כי התבניות מצופות הומוגנית הן על המשטחים הפנימיים וחיצוניים של ספוג PU. הערה: אם ציפוי הומוגנית לא יושג, התבניות המצופים HA יקרסו במהלך תהליך sintering וגם עלולה להיסדק בזמן הטיפול בשל חוזק מכאני נמוך. בנוסף, הציפוי הומוגנית הוא קריטי ביצירת מיקרו-ערוצים בתוך trabeculae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את תבניות HA המצופים למינימום של 5 שעות בתנאי קירור (20-25 מעלות צלזיוס) עם זרימת אוויר עדינה. עם זאת, להאריך את זמן הייבוש מבוסס על הגודל של תבנית. הערה: לאחר ייבוש, תבניות HA המצופים תהיה בדרך כלל לכווץ כ 8% עד 10% בכל ממד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תהליך הייבוש, למקם את HAתבניות מצופים בכור היתוך אלומינה. לאחר מכן, למקם אותם בתנור בטמפרטורה גבוה ולהשתמש בפרופיל sintering שלב 8 הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 2 מעלות צלזיוס / דקה עד 230 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 1 ° C / דקה עד 280 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 0.5 מעלות צלזיוס / דקה עד 400 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 3 מעלות צלזיוס / דקה עד 600 מעלות צלזיוס. שמור ב 600 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 5 מעלות צלזיוס / דקה עד 1,230 מעלות צלזיוס. שמור 1,230 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C / דקת 5 מעלות מגניב RT. הערה: Sintering יתכווץ עוד יותר את התבניות הספוג HA המצופה בכ 22% - 25% בכל ממד. </li></ol></li></ol> 4. Ingress וInhabitancy של תאים לתוך תבנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים טרום osteoblastic MC3T3 בתקשורת הלא-osteogenic בהיקף של α-ממ, בתוספת אנטיביוטיקה 10% שור עוברי סרום (FBS) ו -1% (סטרפטומיצין ופניצילין) על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטרשל השעיה תא ב 2 x 10 6 צפיפות תאים לתוך באר בודד בתוך צלחת 6-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית בצורת גשר 3 סנטימטרים X 4 סנטימטרים X 1 סנטימטר אנכי לתוך הצלחת 6 היטב. הנח רגל אחת של התבנית לצלחת המכילה את ההשעיה התא, והרגל השנייה ולריק סמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את התבנית לספוג ההשעיה התא במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של תקשורת לאחר מכן לטוב שהיה מלא במקור עם ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדש הבינוני בשתי הבארות כל 2 או 3 ימים עד 7 ימים חלפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את היעילות של ניידות תא על ידי hematoxylin ו eosin מכתים 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים והפיגום על ידי הטבילה בEtOH 100% במשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם Hematoxylin במשך 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים במשך 1-2 דקות לפעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש על ידי טבילה ב- 70%, אז 95%, ולאחר מכן 100% EtOH במשך 1-2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם Eosin במשך 20-30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים מזוקקים במשך 12 דקות לפעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש על ידי טבילה ב- 70%, 80%, 90%, ו -100% EtOH במשך 1-2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הפיגום בשרף אקרילי עבור חתך והדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כדאיות תא עם 3 [4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.] ברומיד assay -2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) כדאיות תא וassay חיים / המת (ערכת מכתים תא חי / מת MPTP) זמן נקודות יום 3 ו -7 11. הערה: ערכה של פרוטוקולי ייצור תבנית כמו עצם מיוצג במושב &quot;נציגי תוצאות&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Petrie Aronin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+scaffold+pore+size,+pore+volume,+and+total+void+volume+on+cranial+bone+healing+patterns+using+microsphere-based+scaffolds.">Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).</li><li>Guzm&#225;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+scaffolds+containing+calcium+phosphate+salts+and+rhBMP-2:+in+vitro+and+in+vivo+testing+for+bone+tissue+regeneration.">Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration.</a> PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).</li><li>Cha, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+augmentation+using+BMP-2+in+a+bovine+hydroxyapatite/collagen+carrier+in+dogs.">Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs.</a> J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).</li><li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+recent+innovations+and+the+transition+to+translation.">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+Sheep+Using+Acropora+Coral,+a+Natural+Resorbable+Scaffold,+and+Autologous+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).</li><li>Reichert, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue+engineering+solution+for+segmental+defect+regeneration+in+load-bearing+long+bones.">A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).</li><li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+The+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+The+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds.">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).</li><li>Woodard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+and+osteoconductivity+of+hydroxyapatite+bone+scaffolds+with+multi-scale+porosity.">The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity.</a> Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).</li><li>Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+and+osteogenesis+of+biomimetic+nano-hydroxyapatite/polyamide+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).</li><li>Oh, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+absorption+and+retention+properties+of+engineered+scaffolds+with+micro-channels+and+nano-pores+for+tissue+engineering:+a+proof+of+concept.">Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept.</a> Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).</li><li>Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+action:+enrichment+of+retention+and+habitation+of+cells+via+micro-channeled+scaffolds+for+massive+bone+defect+regeneration.J.">Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J.</a> Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).</li><li>Volkmer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+static+and+dynamic+3D+culture+systems+for+tissue+engineering+of+bone.">Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).</li><li>Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+hypoxia+in+the+in+vitro+engineering+of+tissues.">The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues.</a> Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).</li><li>Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+HA/TCP+scaffolds+with+a+graded+and+porous+structure+using+a+camphene-based+freeze-casting+method.">Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method.</a> Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).</li><li>Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+porous+hydroxyapatite+scaffolds+intended+for+use+in+bone+tissue+engineering+applications.">3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+proliferation+of+OCT-1+osteoblast-like+cells+on+micro-+and+nano-scale+topography+structured+poly(l-lactide).">Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide).</a> Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).</li><li>Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hierarchical+hybrid+micro/nano-textured+titanium+surface+with+titania+nanotubes+on+osteoblast+functions.">The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions.</a> Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תבנית מרכיב רב כולל תאים, גורמי גדילה, חומרים מזינים, וכו &#39;יש צורך להתחדשות עצם מוצלח ושיקום תפקודי של פגמים קריטי עצם גדולים בגודל. בתוך גורמים אלה, מאפיינים ביולוגיים אנטומית conforming חיוניים. כדי להשיג פונקציונליות ביולוגית, התבנית חייבת להציג התאמה ביולוגית, osteoconductivity, שלמות מכאנית, שטח מספיק, מרקם פני השטח נאות, ואת האמצעים לחמצן וחומרים מזינים תחבורה. ברמה התאית, את התכונות הבאות הן קריטיות במיוחד לשיקום תפקודי של פגמי עצם מסיביים: חדירה הקלה לתוך תבנית (גיוס פעיל), הפצה אחידה בכל התבנית (השימור), התפשטות מואצת וכדאיות גבוהה (מגורים). לבסוף, ההיווצרות הבאה של מטריקס הסלולרי נוסף המשמעותי וליבוי ביטוי גנים הם חיוניים בתהליכים ביולוגיים חיוניים כגון כלי דם מהירOsteogenesis nd. סוגים רבים ושונים של תחליפים סינטטיים הוצעו להחליף / allo- שתלי עצם אוטומטיים. עם זאת, ארגון הפיגום הנוכחי אינו התערוכה מייקרו-סביבה פנימית המכילה מיקרו-ערוצים וננו-נקבוביות, ולכן אינו פעיל להקל חדירת תא, הפצה, וinhabitance עמוק לתוך התחליפים סינטטיים שגודלם עולים על 10 מ&quot;מ. הם לא מספקים רמזים פיזיים לחלוצי תאים ביעילות, במהירות, ואחיד להעביר עמוק לתוך תבנית העצם. במקום זאת, הגיוס הפסיבי המוגבל של תאים יוצר אוכלוסיות תאים מופצות בצורה לא שווה בין האזורים החיצוניים והפנימיים של הפיגום. זה לא רק מחריף את האתגר הראשוני של התאים שהגיעו לליבה הפנימית של התבנית, אלא גם מעכב את הזרימה תזונתית ותקשורת סלולארי עם הקצה השני של התחליף הסינתטי. סוג זה של תוצאות גיוס ואכלוס תא מידתי בד התאeath ועצם שלם צמיחה לאחר הפיגום כבר מושתלת לתוך הגוף 14,15. לפיכך, יש לנו הצגנו את הרעיון של פעולת נימים כאות פיזית העיקרית לטפל במכשולים הללו. יש לנו מהונדס היטב מיקרו-ערוצים בBMT לגרום לפעולת נימים שתבאנה בחשבון את כוח הגרירה העיקרי באחריות לאופן פעיל בגיוס תאים עמוקים לתוך BMT. טכניקת הציפוי הספוג PU מציגה מספר מאפיינים ייחודיים. ראשית, הוא מאפשר להכנה קלה של מבני trabecular נקבוביים מבוקרים היטב, אשר בעצמם תלויים במבני התבנית מוגדר מראש (כלומר, 80 נקבובית לתבנית אינץ &#39;עבור 300-400 מיקרומטר). זה חשוב מאוד לייעול גודל נקבובית לחדירת תא עצם 15. שנית, הטכניקה מאפשרת הבנייה של מיקרו-ערוצים מחוברים, המהווים את התפקיד המשמעותי של אתחול התא רילוקיישן 11. שלישית, אין כמעט מגבלות בעת שימוש בספוג PU במונחים של יצירת צורות מותאמות אישית וגדלים של התבניות. היצרנית יכולה להשתמש מספריים לצורות פשוטות או חיתוך לייזר אפילו שמחושב לגיאומטריות מורכבות. תוך שימוש בטכנולוגיות מבוקרות בדיוק אלה, יצרנו BMT. HA נבחר כחומר מוצא בשל יכולת ההתאמה הביולוגית וosteoconductive 17. במחקר זה, יש כמה שלבים קריטיים שצריך להיות מודגשים. במהלך הכנת תרחיף HA, אם הטמפרטורה גבוהה מדי ומהירות ערבוב היא נמוכה מדי, תרחיף HA יהפוך תקוע בקצה תחתון של הכוס ולהתייבש. לאחר תהליך הציפוי כאשר מכבים את תרחיף HA העודף, גבוה מדי של לחץ אוויר יכול לגרום לסדקים על פני השטח של BMT. חשוב לשמור על לחץ האוויר נמוך יחסית לאוורר כראוי slurry HA העודף בלבד. לבסוף, הצעדים שני והשלישי של תהליך sinteringהם קריטיים ביותר (חום 1 ° C / דקה עד 280 מעלות צלזיוס והחום 0.5 מעלות צלזיוס / דקה עד 400 מעלות צלזיוס). בטווח טמפרטורות זה, ספוג PU ישרוף לחלוטין בזמן HA הופך צפוף. אם פרוטוקול זה לא אחריו מקרוב, BMT יהיה התמוטט או התפורר לאחר sintering. BMT המתואר במחקר זה מציע מספר יתרונות. ראשית, מקרו-הנקבוביות בין מחוברים (300-400 מיקרומטר) לחקות את אלה של עצם trabecular האנושי ומאפשר לזרימת מח עצם חלקה. שנית, התבניות מורכבות ממייקרו-ערוצים (25-50 מיקרומטר) בתוך כל מחיצת trabecular להאיץ את החדירה הראשונית של תאי עצם באמצעות פעולת נימים. כפי שהודגם באמצעות סימולציה חישובית 13, אם התבנית הייתה רק 300 מיקרומטר נקבוביות (נקבוביות ראשוני) ולא microchannels, פעולת הנימים תהיה מספיקה לרוויה המלאה של התבנית עם מח עצם. זה במיוחד יחזיק אמיתי לפגמי גודל גדולים שיחייבו lתבניות גודל arge. תערוכת מיקרומטר בגודל ערוצי קליטת נוזלים יעילה מאוד, ולכן אנו צפויים מיקרו-הערוצים להיות אחראים בעיקר על פעולת נימים במחקר שלנו. שלישית, BMTs במיקום אסטרטגי ננו-נקבוביות. נתונים מהספרות מצביעים על כך שהתאים רגישים במיוחד לננו-תבניות 18,19; לכן, אנו צפויים ננו-נקבוביות על הקירות של מיקרו-הערוצים לשחק תפקיד בהגדלת מצורף תא. נקבוביות בגודל ננו (100-400 ננומטר) על פני השטח של septa trabecular אפשר משותק תאים לעגן. בסך הכל, ההשפעות המשולבות של שלושת מבנים הפנימיים אלה הביאו לגיוס משופר תא והידבקות בכל התבנית. עם זאת, ישנן מספר מגבלות של הפרוטוקול והשלבים הקריטיים לפברק BMT המושלם. לדוגמא, לעתים קרובות יש כמות גדולה של תרחיף HA מוכנה בשל הקושי בשמירת צמיגות הומוגנית ואילו ציפוי. כמו כן קיימת מגבלה בקבלתתבניות של יותר מ -5 סנטימטר 3 בנפח בשל זמן עבודה תוך ציפוי. עובי הציפוי הוא קריטי אשר משתנה בהתאם לטכניקות של היצרנית. ממצאי המחקר שלנו מצביעים על כך שהשתלת מח העצם מסוגל לקלוט ושמירת תאים יציעו יתרונות פוטנציאליים על alloplastic הקונבנציונלי (או סינטטי) פיגומים. מחקר פרוספקטיבי נשקלת כדי לאמת את היתרונות של BMT בOsteogenesis ו / או אנגיוגנזה יחד עם גורמים הקשורים לצמיחת עצם. לכן, אנו טוענים כי הפיגום המומלץ הייחודי שלנו BMT יכול לטפל בחסמים העיקריים של חדירת מח עצם מספיק למבנים סינטטיים והתחדשות עצם שלמה בפגמים גדולים. המטרה הסופית של מחקר זה היא לפשט את הפרדיגמה הנוכחית של ביו-הנדסה בשיקום עצם ושיקום תפקודי בפגמים גרמיים קריטיים בגודל על ידי ביטול צורך סטרומה מח עצם גוזלת זמן / עתיר עבודהתהליכי בידוד תאי L והתרחבות. לבסוף, אנו שואפים לנצל אנטומית העומדים 3D-בונה עם מיקרו-ערוצים וננו-נקבוביות, שגורמים לספיגה מהירה של תאים, חלוקה הומוגנית, וinhabitance לבנייה מחדש של עצם.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

ללא אוכלוסייה פעילה, משגשגת תא שמופצת היטב ויציבות מעוגנת לתבנית הוכנסה, התחדשות עצם חריגה אינה מתרחשת. עם תבניות קונבנציונליות, העדר תוצאות מיקרו-ערוצים פנימיים בחוסר חדירת תא, הפצה, וinhabitance עמוק בתוך התבניות. לפיכך, תבנית נקבובית ביותר ואחיד ביניהם trabecular-כמו עצם במייקרו-ערוצים (תבנית מייקרו-סביבה הביוגניים; BMT) פותחה כדי לטפל במכשולים הללו. BMT הרומן נוצר על ידי מושגים חדשניים (פעולת נימים) ומפוברק עם טכניקת ציפוי ספוג-תבנית. BMT מורכב מכמה רכיבים מבניים: עיקרי-נקבוביות בין מחוברים (300-400 מיקרומטר) המחקים את הנקבוביות בעצמות trabecular, מיקרו-ערוצים (25-70 מיקרומטר) בתוך כל טרבקולה, וnanopores (100-400 ננומטר) ב פני השטח כדי לאפשר לתאים לעגן. יתר על כן, BMT תועד על ידי מחקר בדיקה מכאני שיש SIMתכונות חוזק מכאני ilar לאלה של עצם trabecular האנושי (~ 3.8 MPA) 12. BMT הציג גבוהה קליטה, שימור, ומגורים של תאים בתבניות בצורת הגשר (Π) (גובה 3 סנטימטר ואורך 4 סנטימטרים). התאים שהיו בתחילה זורעים לתוך קצה אחד של התבניות התגייסו מייד לקצה השני (מרחק 10 סנטימטרים) על ידי פעולת נימים של BMT בתקשורת הסלולרי. לאחר 4 שעות, התאים כבושים homogenously כל BMT והציגו התנהגות סלולרית רגילה. פעולת הנימים היוותה החדירה של התאים תלויים בתקשורת וההפצה (הגירה פעילה) ברחבי BMT. לאחר שצפה ביכולות של BMT אלה, אנו צופים כי BMTs יספוג תאי מח עצם, גורמי גדילה, וחומרים מזינים מהפריפריה בתנאים פיסיולוגיים. BMT עשוי לפתור מגבלות הנוכחיות באמצעות חדירה מהירה, הפצה הומוגני וinhabitaNCE של תאים בתבניות גדולות, נפח לתקן פגמי שלד מסיביים.

המבנה הכללי של BMT מציג תבנית תלת-ממדית ייחודית עם מבנים פנימיים כמו עצם trabecular. BMT מכיל מאקרו-נקבוביות, מיקרו-ערוצים, וננו-נקבוביות. תצורות ברורות של מקרו-נקבוביות ביניהם באופן מלא (בגודל ממוצע של 320 מיקרומטר), מיקרו-ערוצים (קוטר ממוצע של 50 מיקרומטר), וננו-נקבוביות (גודל ממוצע של 100 ננומטר) אומתו עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (EVO-40; ZEISS), כמו גם באמצעות מיקרו-טומוגרפיה. איור 1 מציג פרוטוקולים מפורטים בשלבים ביצירת BMT. באמצעות שליטה מדויקת של הפרוטוקולים מההכנה של ספוגים פו לתהליך sintering (P1 - P7; איור 1), ניתן להשיג את התכונות הבאות: משטח צפוף וחלק מאוד לאחר ציפוי HA וייבוש; בדיוק בצורה ובגודל 3-D תבנית; רשת מחוברת באופן מלא נקבובית trabecular דומה לזה של עצם trabecular; ושנינות מיקרו-ערוציםהין כל טרבקולה המחקה ערוצים תוך-גרמיים כגון תעלות Haversian והתעלות של פולקמן (איורים 2 ו -3). יתר על כן, חוזק מכאני גבוה יחסית (~ 3.8 MPA) דומה לזו של עצם trabecular אדם נמדד על ידי בדיקת חוזק לחיצה. פרמטרים histomorphometric מאוד דומים לאלה של אדם מותני חוליות עצם trabecular אושרו על ידי ניתוח מיקרו-CT 12. גדלים שונים של פעולת נימים הודגמו באמצעות קטרי נימים שונים באיור 4 באמצעות סימולציה חישובית. באמצעות הדמיות אלה, אנו צפויים כי BMT היה להציג שיעורי ספיגה משתנים בתוך העיקרי-נקבוביות (300-400 מיקרומטר) ומיקרו-ערוצים (25-70 מיקרומטר) המבוסס על הקטרים. נימים קטנות הציגו יכולות קליטה חזקות יותר. הנחה זו אומתה בניסוי זה, כפי שמוצג באיור 5. BMT הציג יעיל מאודקליטת נוזלים ושימור דרך פעולת הנימים של מבני ערוץ מיקרו; הכתם הכחול של stevenel שימש כמדיום נוזל כדי לעקוב אחר הזרימה (איור 5) בקלות. בהתבסס על סימולציה חישובית, BMT עם תצורות אלה ראו לקלוט ולשמר השעיות תא עד 8.5 סנטימטר במרחק כולל בתוך 10 שניות. בשל פעולת נימים חזקה הנגרמת על ידי המבנים הפנימיים, הבינוני המוכתמים הגיע לקצה השני של 3 סנטימטר (גובה) x 4 סנטימטר (אורך) x 1 סנטימטר תבנית (רוחב) בצורת גשר בתוך דקות 1 ו -40 שניות. יתר על כן, גיוס פעיל תא ושילובם בBMT נצפה (איור 6). בהמשך לכך, גיוס התא הומוגנית והקובץ המצורף הביאו שגשוג משופר והיווצרות מטריצה ​​בהיווצרות מופצת באופן שווה. יתר על כן, הגירה למרחקים ארוכים (~ 10 סנטימטרים) של תאים דרך BMT קבלה תוקף מייד לאחר השתלת מח העצם היה רוויה בהשעית התא. Se<html> תאי eded שרדו במגזר התבנית שנחשף לאוויר ולא שקוע במדיום התרבות. בניסוי זה, מדיום התרבות הועמד לתאים על ידי באופן בלעדי בבארות נוגעות רק רגליים של הפיגום. פעולת הנימים הוצגה על ידי microchannels אז אפשרה למדיום חדש כדי להגיע לחלק מהפיגום העליון, הגשר. לאחר 3 ימים של תרבות, התבנית הפכה עסוקה בתאים במהירות מתרבים. לאחר 7 ימים של תרבות, כל טרבקולה הייתה עטופה במטריצות סלולריות נוספות ומשובץ עם תאים 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> איור 1. הפרוטוקול הכולל כמו עצם ייצור תבנית מהטיפול המקדים של ספוג PU (P1) לטיפול הסופי חום (P7). שמירה על פרופיל sintering המדויק לאחר P7 הוא קריטי בהשגת חוזק מכאני טוב.f = יעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . איור 2 מיקרוסקופ סטריאו נציג (AmScope; SM-2TZ-M) תמונות (x4) של ppi 80 גודל ספוג PU (משמאל), HA מצופה ומיובש BMT (באמצע), וBMT sintered (מימין) (מידות: 3. סנטימטר בגובה x 4 סנטימטר באורך x 1 סנטימטר ברוחב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> תמונות איור 3. SEM ומיקרו-CT של תבנית הביוגניים: (א) תמונה כוללת של תבנית הביוגניים, <st<html> Rong&gt; תמונות (B, C, D) למיקרו-ערוצים. על מנת להדגיש מיקרו-ערוצים ברורים בtrabeculae, התבנית הייתה מגורען. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . איור 4. חישוב חישובית של פעולת נימים בקטרים ​​ערוץ שונים באותה תקופת הזמן (0.4 ms), תוך הנימים הגדולות (D = 300 מיקרומטר: מתייחס לעיקרי-נקבובית) נספג בינוני (הכחול) עד 0.16 מ&quot;מ ב גובה, הנימים הקטנות (ד = 30 מיקרומטר: מתייחס לערוץ מיקרו) נספגו הבינוני עד .415 מ&quot;מ הגובה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> NT &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> איור 5. תמונות הראו הבדלים ביכולות קליטה של פעולת נימים המבוססות על גדלים שונים של ראשוני-נקבוביות ומיקרו-ערוצים (גודל ראשוני נקבובית מתייחס לקוטר הממוצע: 60 ppi ≈ 470 מיקרומטר, 80 ppi ≈ 320 מיקרומטר, ≈ 100 ppi 200 מיקרומטר). הקווים הצהובים מייצגים את פעולת נימים הנגרמת על ידי השילוב של ראשוני-נקבוביות ומיקרו-ערוצים. הקווים האדומים מייצגים את פעולת נימים הנגרמת על ידי בעיקר מיקרו-ערוצים הציגו בכל טרבקולה. כפי שניתן לראות ב( F), תבנית 100 ppi מושרה פעולת נימים החזקה, וכתוצאה מכך הרוויה המלאה של התבנית בתוך 39 שניות. תבניות 80 ppi ו -60 ppi נבדקו לאחר מכן. (ב) 0 שניות, (ג) 0.5 שניות, (ד) 1.5 שניות, (E) 17.0 שניות, (F) 39.0 שניות, (G) 50.0 שניות, ודקות 1 18 שניות לאחר טבילה (H). (ממד תבנית: 1סנטימטר x 1 סנטימטר x 4 סנטימטר בcuboidal גובה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> איור 6. כניסה וההגירה של תאים מהבארות זרע (חלק I) לבארות unseeded (חלק V) באמצעות התבניות הביוגניים הנגרמות על ידי פעולת נימים. תאי זרע בתחילה הגיעו לסוף רגל unseeded (חלק V) מייד לאחר רוויה מלאה. לאחר 3 ימים, נקודת המפגש של התאים היה ברורה לאורך כל התבנית. לאחר 7 ימים, היווצרות מטריצת קולגן spatiotemporal התרחשה בתוך אוכלוסיות תאים (כתם H &amp; E). (ממד תבנית: 3 סנטימטר בגובה x 4 ס&quot;מ אורך x 1 סנטימטר ברוחב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">אנא CL</a>איכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect at JoVE.com

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

תבניות נימי פעולה ייחודית על ידי מיקרו-ערוצים בעצמות כמו-יכולות לשפר את הגיוס של תאים לשיקום גדול גרמי פגם

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Views.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

Video: Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...