המחבר מבקש להודות לכל סטודנט לתואר ראשון שלי עצמאי תלמידי מחקר ואת כל הסטודנטים לתואר השני מיקרוביאלית הפיסיולוגיה שלי שנבדקו רעיונות mutagenesis transposon במהלך הסמסטרים אביב 2010-2014. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה למדעי ביולוגיה באוניברסיטת מדינת יאנגסטאון.

1. Electroporation של תאים מוסמכות 5,11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל O / תרבות N LB של sp Enterobacter. YSU 1/20 ל -50 מיליליטר של מדיום LB הטרי ולגדול עם רועד ב120 סל&quot;ד ו -30 ° C עד OD (600 ננומטר) בין 0.4 ו -0.6. לחלופין, לגדול זני חיידקים אחרים בטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל התאים על קרח למשך 5 דקות ו צנטריפוגות ב 4 ° C ו -7,000 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend תאי 50 מיליליטר של מים סטריליים קרח קרים ו צנטריפוגות ב 4 ° C ו -7,000 XG למשך 5 דקות. חזור על פעולה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend התאים בנפח מים קרים כקרח שווים לגלולת נפח תא. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של קרח קר 10% (v / v) גליצרול, גלול בשווה גלולה נפח של קרח קר 10% (v / v) גליצרול, חנות ב -80 מעלות צלזיוס, והפשרה על קרח לפני electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של transposome 40 μl שלתאים. פתרון transposome זמין המסחרית מסופק בריכוז ה- DNA של 0.33 מיקרוגרם / μl. למרות 0.33 מיקרוגרם מומלץ, 0.165 מיקרוגרם DNA מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת התא / transposome בקרח קר, 0.2 מ&quot;מ, קובט electroporation ולהקיש על התערובת לתחתית של קובט. לזעזע את התאים ב 25 μF, 200 Ω, ו -2.5 קילו וולט. כדי להבטיח שהתאים נשארים מקוררים, לאחסן cuvettes electroporation במקפיא C -20 ° לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד, להוסיף 960 μl של מסנן מעוקר מרק סופר אופטימלי עם דיכוי catabolite בינוני (SOC). מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר את תאי צינור microfuge סטרילי 1.5 מיליליטר. הערה: התאים מתחילים למות לאחר ההלם, אבל מלח במדיום SOC מאפשר להם להתאושש. כדי לחסוך, אין זה הכרחי להוסיף transposome או לזעזע את תאי בקרה השליליים. רק להוסיף 960 μl בינוני SOC סטרילי אליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס ואו דקות 45-60 עם רועד ב120 סל&quot;ד. זה מספק זמן לtransposome ללהשתלב מחדש עם גנום המארח ולתאים להביע התנגדות kanamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות של תאים 100 μl על צלחת אגר LB-קאן ודגירת O הצלחת / N ב 30 מעלות צלזיוס. אחסן את תערובת הטרנספורמציה שנותרה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. מורחים סכומים נוספים במועד מאוחר יותר עד 2 שבועות לאחר electroporation הראשוני במידת צורך. </li></ol> 2. gridding של transformants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרט רשת למכסה של צלחת פטרי מ&quot;מ ריקה 100 x 15. העתק רשת מ&quot; ​​קורס קצר בקטריאלי הגנטיקה &quot;12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתוח קו על החלק התחתון של צלחת אגר LB-קאן. השתמש בפיסה קטנה של סרט לעגן אותו למכסה gridded כך שהרשת היא גלויה לעין דרך אגר. ודא שהשורה על החלק התחתון של הצלחת מיושרת עם החלק העליון, מרכז הרשת. עיגון הצלחת עם קלטת שומר עליו מפני החלקה, ומאפשר לאף gridding. הקו מאפשר זיהוי מושבה לאחר ציפוי העתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר transformant יחיד עם קיסם סטרילי ולהבחין בו במרכזה של כיכר ברשת. רק לגעת במושבה והמקום. לא לחפור הקיסם לתוך אגר. כדי למנוע זיהום הצלחת, להתמודד עם הקיסם רק בקצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט transformant נוסף בכיכר סמוכה כמו בשלב 2.3. כאשר הצלחת מלאה, דגירה אותו O / N ב 30 מעלות צלזיוס. זה צלחת האדון. </li></ol> 3. Replica ציפוי לקביעת Auxotroph הפנוטיפ 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת שgridded, להפוך את ערימה של שלוש צלחות טריות אגר ממוספרות אחד עד שלוש: אחד לLB-קאן, שני לM-9-קאן ושלושה לLB-קאן. ייבש את הצלחות הפוכות, O / N, על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר קו בחלק העליון של כל צלחת כמו בשלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את כלי ציפוי העתק עם 70% אתנול, למקם את כיכר קטיפה סטרילית על גבי ציפוי ההעתק לol ולצבוט את כיכר הקטיפה. ידיים רוחשת חיידקים גם לאחר שטיפתם. למנוע הכניסה של זיהום חיידקים על ידי הטיפול מרובע הקטיפה בקצה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר קו על צלחת ההורים עם קו משורטט על המהדק ומניח את הצלחת על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מהצלחת לכיכר הקטיפה. היזהר שלא למרוח את החיידקים. הסר את צלחת האב מכיכר הקטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקו שצויר על מספר לוחית אחד עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מכיכר הקטיפה לצלחת. הסר את מספר לוחית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את כיכר הקטיפה לתוך כוס מים ומניח את ריבוע נקי, סטרילי קטיפה על כלי ציפוי העתק כמו בשלב 3.3. פעולה זו מונעת על-חיסון שגורם לצמיחת פריצת דרך ותוצאות חיוביות כוזבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישרקו על מספר לוחית אחד עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה החדשה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים ממספר לוחית אחת לכיכר הקטיפה. הסר את מספר לוחית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקו שצויר על מספר לוחית שתיים עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מכיכר הקטיפה למספר צלחת שתי. הסר את מספר לוחית שתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.8 למספר לוחית שלוש. הצלחת השלישית היא שליטה להעברה מלאה מהצלחת הראשית לשתי צלחות האחרות. מחק את כיכר הקטיפה לתוך כוס של מים. כדי לעשות שימוש חוזר ריבועי הקטיפה, חיטוי הכוס המכילה ריבועי קטיפה המזוהמים, לשטוף אותם, לייבש אותם, לעטוף אותם בנייר אלומיניום ומחדש חיטוי אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות על 30 מעלות CO / N. מושבות הגדלים על שני הצלחות אגר LB-קאן, אבל לא מצליחים לגדול על צלחות M-9-קאן נחשבות auxotrophs ( <stרונג&gt; איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> auxotrophs פס החוצה ממספר לוחית אחת על צלחת אגר LB-קאן טרי, ודגירה את הצלחת על 30 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס החוצה לבידוד 3 מושבות מצלחת הפס בשלב 3.11 על צלחת LB-קאן טרי. דגירה את הצלחת על 30 מעלות CO / N. הדבר מבטיח כי המוטציה היא מבודדת היטב. מחלקים את הצלחת לשלישים ופס את כל מושבה בסעיף אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות ספוט מהמושבות הנמוגות נגזרות מצעד 3.12 על צלחת LB-קאן טרי כדי ליצור רשת כמו בצעדים 2.1-2.4. כל מוטציה היא להיות מחדש נבדקה בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את צלחת שוב כמו בצעדים 3.1-3.10 כדי לאשר את הפנוטיפ auxotroph. </li></ol> 4. ג&#39;ין הצלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 3 O מיליליטר / תרבות N של מושבה מוטציה מבודדת מצעד 3.13 במדיום LB-קאן נוזלי על 30 מעלות צלזיוס. לטהר DNA הגנומי של 1 מיליליטר של התרבות באמצעות ערכת טיהור הדנ&quot;א הגנומי זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת של 0.025 Uendonuclease Bfu CI הגבלה ו -14 μl של 1 מיקרוגרם / הדנ&quot;א הגנומי μl בתגובת 20 μl על קרח. מאז Bfu CI חותך את transposon בעשרה אתרים שונים, זה יכול להיות יעיל יותר להשתמש endonuclease הגבלה, BFA אני או Hae III, אשר חותך את transposon בשניים ושלושה אתרים שונים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות ולאחר מכן ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית את האנזים. ניתוח 3 μl של ה- DNA המעוכל חלקית על ג&#39;ל 0.8% agarose (איור 3). תוצאות מוצלחות חלקיות עיכול במריחה מ 10 kb עד לתחתית של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור 15 μl של הדנ&quot;א הגנומי מעוכל חלקית באמצעות 800 יחידות של האנזים T4 DNA בתגובת μl 500. דגירה C ° O תגובה / N ב 4. גדול נפח התגובה מגדיל את קשירה של שברים יחידים לעצמם וממזער את יחסי גומלין בין שניים או יותר שברי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precipitate DNA ligated על ידי הוספת 50 μl של 3 אצטט M נתרן, pH 5.5, ו 1 מיליליטר של 95% אתנול ו דוגרים אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfuge DNA על 4 מעלות צלזיוס ו13,500 XG במשך 10 דקות, לשטוף את הכדור עם 70% אתנול, לייבש אותו ברכז ואקום צנטריפוגלי, וresuspend אותו 10 μl מים nuclease חינם. לחלופין, ה- DNA יכול להיות אוויר יבש ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 4 μl של ה- DNA resuspended להפוך E. PIR coli ECD100D מתח או pir116 ECD100D ידי electroporation כאמור בסעיף 1. המקור שכפול γ R6k דורש זן חיידקים עם גן PIR לשכפל 6. תוצאות מתח PIR בפלסמידים עותק נמוכים, ומתח pir116 מכיל את גן שעבר מוטציה PIR כי תוצאות בפלסמידים עותק גבוהים. כל transformant מכיל פלסמיד חדש עם transposon ואזור של כרומוזום שהופסק (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Inoculאכלתי 5 מיליליטר של מדיום LB-קאן עם מושבה אחת, לגדל אותו O / N עם רועד ב120 סל&quot;ד ו -37 מעלות צלזיוס, ולטהר את פלסמיד דנ&quot;א מכל O / התרבות N באמצעות ערכה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל 14 μl של פלסמיד באמצעות I. Xho endonuclease ההגבלה ודא הנפח הסופי של התגובה הוא 20 μl. אנזים זה מזהה אתר באמצע transposon בסוף &#39;5 של גן התנגדות kanamycin. לנתח 10 μl של מעוכל ומתעכל פלסמיד על 0.8% agarose ג&#39;ל (איור 3). פלסמיד מורכב מה- DNA מארח transposon kb 2 בתוספת האיגוף. </li></ol> רצף 5. DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף פלסמיד באמצעות מערכת ניתוח רצפי נימי ערכה זמינה מסחרי רצף, פריימרים שהומולוגיים לכל קצה של transposon, ו. לחלופין, פלסמיד ניתן לשלוח למוסד מחוץ לרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש בתקן המשקל המולקולרי (סולם kb 1) בג&#39;ל להעריך את גודלו של פלסמיד. ואז, להעריך את מספר ננוגרם (ng) של פלסמיד הנדרש ל-50 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל של 260 ננומטר (260) ו- 280 ננומטר (280). להבטיח את אורך נתיב האור דרך קובט הוא 1 סנטימטר. קבע את הריכוז על ידי הכפלת הספיגה ב 260 ננומטר ב -50 ng / μl. פלסמיד דנ&quot;א באיכות גבוהה יהיה 260 / יחס 280 בין 1.8 ו -2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנפח של ה- DNA הנדרש לכל תגובת סידור הוא מספר NG נדרש ל-50 fmol מחולק בריכוז של פלסמיד. מערבבים את הנפח של פלסמיד הנדרש במים כדי להביא את הנפח הכולל של עד 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את תערובת פלסמיד דנ&quot;א / מים על 96 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ולאחר מכן לקרר אותו לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של תערובת הורים מערכת הרצף ו -2 μl של 1.6 מיקרומטר של אחד מצבעי יסוד הרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Folנמוך הפרוטוקול מערכת הרצף לתכנית Cycler תרמית וניקוי תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל דגימה באמצעות מערכת ניתוח ה- DNA נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחבילת תוכנה זמינה מסחרי כדי להציג את רצף ה- DNA. חפש את הרצף, &quot;5&#39;-GAGACAG-3&quot;, &quot;שהוא 7 נ&quot;ב האחרון של transposon (איור 4). הרצף לפני סוף &#39;5 של קטע 7 נ&quot;ב זה שייך לtransposon. הרצף אחרי סוף &#39;3 של קטע 7 נ&quot;ב זה שייך לגן שהופסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הפונקציה האפשרית של הגן שהופסק שימוש המקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) 7,8. השתמש הבא link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . הדבק את הרצף של הפסיקהגן ed לתוך תיבת השאילתה, בחר באפשרות &quot;אחר&quot; תחת מסד הנתונים ולחץ על &quot;פיצוץ&quot; בחלק התחתון של הדף. כאשר התוצאה מופיעה, לגלול את הדף למטה כדי להציג את תוצאות היישור (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

המחבר יש מה למסור.

mutagenesis transposon באמצעות transposome הוא כלי יעיל ליצירת auxotrophs בsp Enterobacter. חיידקים חיוביים YSU וסוגים אחרים של שלילי גרם וגרם 3,4. התהליך נעשה ביוזמת החדרת Tn 5 transposome -derived למארח על ידי electroporation. לזהות מושבות עם מוסיף, מתח יעד untransformed היה צריך להיות רגיש לkanamycin כדי לבחו?...

חיידקי Prototrophic לגדול בM-9 מלחים מינימאליים בינוני המכילים גלוקוז (M-9 בינוניים), המרת גלוקוז דרך מסלולי חילוף חומרים פחמן מרכזיים לייצר מבשרים, כגון חומצות אמינו, חומצות גרעין וויטמינים, לביוסינתזה 1. M-9 בינוניים מכיל אמוניום כלוריד כמקור חנקן, נתרן ופוספט אשלגן כחיץ ומקור זרחן, מגנזיום סולפט כמקור גופרית וגלוקוז כמקור פחמן ואנרגיה. לוריא-Bertani הבינוני (LB) הוא עשיר בחומצות אמינו מtryptone ובויטמינים וגורמי גדילה מתמצית שמרים. הוא תומך בצמיחה של auxotrophs שלא יכול לסנתז חומצות אמינו, ויטמינים וגורמי גדילה אחרים הנדרשים לצמיחה על M-9 בינוניים. כך, prototrophs יגדל בLB ו- M-9 בינוני, ואילו auxotrophs יגדל במדיום LB אבל לא בM-9 בינוניים. על ידי החדרת מוטציות לאוכלוסיית prototrophic של חיידקים וזיהוי גנים שעברו מוטציה שגורמים לפנוטיפים auxotrophic, זה פוssible להשיג הבנה טובה יותר של חילוף החומרים בזן חיידקים. mutagenesis transposon יכול לשמש כדי לזהות רב של גנים הדרושים להתפתחות ברמת הסוכר בM-9 בינוניים. Transposons להכניס את עצמם באופן אקראי לגנום המארח 2. על ידי תצפית transformants transposon על צלחות אגר LB והעתק ציפוים על גבי צלחות אגר M-9 בינוניים, ניתן להקרין לauxotrophs. גנים נקטעו מזוהים דרך הצלת גן. מחקר זה משתמש Tn זמין מסחרי 5 -derived transposome שנשלח כפתרון של קטע DNA transposon יניארי מעורבב עם חלבון transposase. קטע DNA חסר גן transposase אבל מכיל את גן לעמידות kanamycin, המוצא שכפול γ R6K ושני מוטיבים פסיפס שהם רצפי DNA לtransposase מחייבים בכל קצה של הקטע 3,4. מאחר וחלבון transposase מתווסף ישירות ל- DNA, מגזר ה- DNA לבדמוגדר כtransposon, ומורכב חלבון ה- DNA / transposase מוגדר כtransposome. Transposome עובר טרנספורמציה על ידי electroporation 5 למארח רגיש kanamycin (איור 1 א). יש מושבות הגדלים על צלחות אגר LB המכילות kanamycin (LB-קאן) מוסיף transposon (איור 1), וtransformants העתק מצופה שלא מצליח לגדול על M-9 צלחות אגר המכילות בינוני kanamycin (M-9-קאן) הם auxotrophs (Figire 1 ג &#39;). הדנ&quot;א הגנומי של מוטציה הוא מטוהר ומעוכל חלקית עם endonuclease הגבלת חיתוך 4-הבסיס, Bfu CI (1D איור). DNA ligated הופך לזן של Escherichia coli (E. coli) המכיל את גן PIR (איור 1E). גן זה מאפשר לפלסמיד החדש המכיל את transposon ואיגוף אזור כרומוזומליות מארח לשכפל בE. coli 6. גן התנגדות kanamycin משמש כסמן electable לפלסמיד החדש. לבסוף, רצף באמצעות פריימרים משלימים לכל קצה של transposon והיסוד מקומי יישור חיפוש כלי הניתוח (פיצוץ) 7,8 של הרצף וכתוצאה מכך נמצא בשימוש כדי לקבוע את זהותו של גנים נקטעו. אסטרטגית mutagenesis transposome זה מספקת שלושה יתרונות 3. ראשית, מאז חלבון transposase קשור ישירות לtransposon, הכנסה אינה תלויה בביטוי של גן transposase בתוך הפונדקאי. ברגע שtransposon משלב את עצם לתוך הגנום המארח, transposase נפגע, מניעת תנועה נוספת של transposon. עם זאת, לא ניתן למנוע תנועה נוספת אם המארח בעל אלמנט transpositional אנדוגני Tn 5. שנית, כניסתה של transposome ידי electroporation מאפשרת להשתמש בו במגוון רחב של מארחים. זה גם מבטל את הצורך להציג את transposon ידי קוניוגציה או על ידי viזיהום RAL. שני התהליכים דורשים רגישות מארח. שלישית, הכללה של גן התנגדות kanamycin והמוצא שכפול γ R6K בtransposome עושה את זה קל יותר לזהות את הגן שהופסק. ניתן לאחסן אזורי transposon-מופרע ורצף כפלסמידים, ומבטל את הצורך להשתמש בתגובת השרשרת של פולימראז ההפוך טכניקה (PCR) לזיהוי גן. הפרוטוקול שהוצג בסרטון הזה מתאר כל שלב לmutagenesis transposon של sp Enterobacter. 9 YSU באמצעות transposome מהחדרתו לתאי החיידקים לזיהוי של הגן המשוער שזה ייפסק. בנוסף לפרוטוקולים שפורסמו בעבר 3,4,10, שיטות מפורטות לשימוש בציפוי העתק למסך auxotrophs מוצגות. טכניקת mutagenesis זה יכול לשמש לחקר פנוטיפים אחרים, כגון התנגדויות אנטיביוטיות ומתכת, בסוגים שונים של חיידקים, לזיהויifying המספר המינימלי של גנים הדרושים להתפתחות בתנאי תרבות הוגדרו במחקרים בביולוגיה סינטטיים, או להוראת מרכיב מעבדה של גנטיקה או קורס פיזיולוגיה של חיידקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

חיידקי Prototrophic גדלים על M-9 מלחים מינימאליים בינוני בתוספת גלוקוז (בינוני M-9), המשמש כמקור פחמן ואנרגיה. יכול להיות שנוצר Auxotrophs באמצעות transposome. Tn 5 transposome זמין מסחרי, -derived שימוש בפרוטוקול זה מורכב ממקטע ליניארי של ה- DNA המכיל מקור R6K שכפול γ, גן לעמידות kanamycin ושני ברצף הפסיפס מסתיים, המשמש כאתרי transposase מחייבים. Transposome, סיפק כמתחם חלבון ה- DNA / transposase, מוצג על ידי electroporation למתח prototrophic, sp Enterobacter. YSU, ובאופן אקראי משלב את עצם לתוך הגנום של מארח זה. Transformants היא העתק מצופה על לוריא-Bertani צלחות אגר המכילות kanamycin, (LB-קאן) ועל גבי צלחות אגר M-9 מדיום המכילות kanamycin (M-9-קאן). Transformants הגדלים על צלחות LB-קאן, אבל לא על צלחות M-9-קאן נחשב auxotrophs. הגנומי מטוהרDNA מauxotroph מתעכל באופן חלקי, ligated והפך לPIR + Escherichia, מתח (E. coli). מקור שכפול R6Kγ מאפשר פלסמיד לשכפל בPIR + E. coli זנים, וסמן התנגדות kanamycin מאפשרים בחירת פלסמיד. כל transformant בעל פלסמיד חדש המכיל את transposon מוקף אזור כרומוזומליות שהופסק. סנגר רצף והמקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) מציעים זהות משוערת של הגן שהופסק. ישנם שלושה יתרונות לשימוש באסטרטגית mutagenesis transposome זה. ראשית, הוא אינו מסתמך על הביטוי של גן transposase על ידי המארח. שנית, transposome מוחדר מארח היעד על ידי electroporation, ולא על ידי נטיה או על ידי התמרה ולכן הוא יעיל יותר. שלישית, מקור שכפול R6Kγ עושה את זה קל לזהות g המוטציהENE שהוא התאושש באופן חלקי בפלסמיד רקומביננטי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הגנים מעורבים במאפיינים אחרים של sp Enterobacter. YSU או של מגוון רחב יותר של זני חיידקים.

הפיכתו של sp Enterobacter. YSU ידי electroporation עם transposome יזם הכנסת הגנום אקראית לתוך הגנום המארח (איור 1 א, ב &#39;). Electroporation מוצלח הניב כמה אלף transformants שגדלה על צלחות LB-קאן. כדי להשיג 300-400, היטב במרווחי מושבות בכל צלחת, הסכום של התפשטות תערובת הטרנספורמציה על כל צלחת אגר LB...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Views.  Youngstown State University.  sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף. 

Video: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...