This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.

1. להכין מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי מלח חם פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השינוי של Dulbecco החם של נשרים בינוניים (DMEM) והמינימאלי חיוני בינוני (MEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 100 IU / פניצילין מיליליטר, ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: אלה מייצגים רגיל צמיחת מדיה (NGM) לתאי RAW והלה בהתאמה. </li></ol> 2. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 264.7 תאי RAW לconfluency 70-90% בNGM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי הלה לconfluency 70-90% בNGM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני האיסוף, לשטוף monolayer תא פעם אחת עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים טרום-ומחוברות בצינור חרוטי סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד תאי RAWעם שוטר גומי בPBS, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאי הלה עם 0.25% פתרון טריפסין עד בדיקה חזותית מציגה ניתוק ממשטח התרבות. לדוגמא, השתמש 2-3 מיליליטר לבקבוק T-75. להתאים את עוצמת קול בהתאם כדי להבטיח פתרון טריפסין מכסה שטח גידול כולו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תגובת ניתוק עם NGM המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לפחות פעמיים הנפח של NGM לטריפסין, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend באותו נפח כפתרון טריפסין / להרוות באמצעות PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מונה חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בנפח מספק של PBS ל5.5 x 10 x 6 6.0 10 6 תאים / מיליליטר. הערה: לדוגמא, T-75 בקבוק אחד יניב approximately 7.5 x 10 6 תאים 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור השעיה תא על קרח עד electroporation. </li></ol> 3. הכנה לElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cuvettes טרום צמרמורת electroporation (פער של 0.4 סנטימטרים) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מנגנון electroporation ולהגדיר את המתח 0.3 וולט. הערה: קיבוליות והתנגדות לא היו הגדרות להתאמה על electroporator שלנו (על 10 μF ו -600 Ω על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צלחות התאוששות עם NGM ולאזן באווירת CO אוויר / 5% humidified 95% 2 ב 37 ° C. </li></ol> 4. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 400 μl של השעיה תא קובט טרום צונן ולהוסיף 20 מיקרוגרם של חלבון שנבחר לקובט (50 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובט פליק בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ללא פגיעה בתאים. הערה: קובט גם יכול להיות הפוך מספר פעמים ולמערבב היטב, אבל לא pipet למעלה ולמטה או מערבולת כדי למנוע נזק לתאים. </li><li&gt; מחוץ יבש של קובט עם מגבת נייר או מגב אחר כדי למנוע קשתית חשמלי בelectroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם electroporate על 0.3 קילו וולט עבור 1.5-1.7 msec. הערה: זה היה אופייני למחקר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר קובט הקפיצי electroporation בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות. </li></ol> 5. ציפוי של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובט חנות עם תאי electroporated על קרח עד מוכן למקום בצלחות התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רוב הניתוחים במורד הזרם, לשטוף תאי 1X עם NGM מראש חימם כדי להסיר חלבון מפעיל זר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים לניתוח ולהשעות ב3-5 מיליליטר של NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בנפח מספק של NGM לגודל רצוי צלחת (למשל 2 מיליליטר למנה 35 מ&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כמות מתאימה של תאים לניתוח במורד הזרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמא 1: צלחת לתוך מנות תחתית כוס לניתוח מיקרוסקופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמא 2: int צלחתo פלסטיק תרבית תאים לניתוח חלבונים כגון purifications זיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים להתאושש בצלחות equilibrated באווירת CO אוויר / 5% -95% humidified 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. </li></ol> 6. מיקרוסקופית ניתוח 6.1) קיבוע / Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי 1X עם PBS סטרילי לאחר תקופת החלמה 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים במתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש מספיק כדי לכסות את תאי מתנול (למשל 2 מיליליטר במשך 35 צלחת מ&quot;מ) לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים עם 0.4% Triton X-100 ב PBS במשך 15 דקות. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אורך של permeabilization וכוחו של טריטון X-100 על פי epitope ומיקום חלבון המטרה של. הערה: התוצאות הטובות ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל יעד, אולם התנאים הנ&quot;ל צריכים להיות מספיק עבור רוב גמטרות ytosolic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום עם 5% הסרום אלבומין שור (BSA) בPBS עבור שעה 1 ב RT. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדן ראשוני בפתרון מחייב נוגדנים (0.1% Triton X-100 ו 1% BSA PBS) הלילה ב 4 &#160; ° C עם נדנדה עדינה. לדוגמא, השתמש 0.5 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר המלצות יצרן לדילול נוגדן. הערה: לדוגמא, נוגדן תג פפטיד מחייב streptavidin (SBP-תג) שימש בשעה 1: 1,000 דילול, ואילו נוגדני PKN1 שימשו בשעה 1: 200 דילול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 4x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים מתאימים fluorescently מצומדות משניים בפתרון מחייב נוגדן עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, השתמש Alexa 488 או 647 Alexa עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר המלצות יצרן לנמלהדילול ibody. (למשל על 1: 1,000 למחקר זה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כתמים אחרים לפי צורך, למשל, agglutinnin נבט חיטה 5 מיקרומטר (WGA) מוצמד לAlexa 647 או DAPI בהתאם להמלצת יצרן, עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5x עם PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור עד מוכן לתמונה. </li></ol> 6.2) ניתוח תמונת Confocal מיקרוסקופית ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה במיקרוסקופ confocal הפוכה באמצעות מטרת 63x טבילת שמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוץ תמונה ירוק באמצעות השורה של 488nm לייזר ארגון, עם פליטת רוחב פס בין 492-542 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוץ תמונה אדום באמצעות לייזר דיודה 633 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 640-718 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוץ תמונה כחול באמצעות לייזר דיודה 405 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 407-453 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא ערוץ מרובה Z- ערימות לכסות את מכלול הנפח הסלולרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות תהליך עם תוכנת עיבוד תמונה מתאימה. </li></ol> טיהור 7. זיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאי electroporated פעמיים עם 4 ° C PBS לאחר תקופת החלמה 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse עם ~ 1.0 מיליליטר של חיץ תמוגה (1% Triton X-100 עם מעכבי פרוטאז קוקטייל ומעכב phosphatase בPBS) על קרח. השתמש במעכבים בהתאם להוראות יצרן. הערה: לדוגמא, שני מעכבי פרוטאז phosphatase ושמשו במחקר זה סופקו ב100x, אבל ניסוחים אחרים צריכים לעבוד באותה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לגרד תאים עם שוטר גומי ולאסוף לתוך צינורות חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse ידי vortexing וsonication הנמרצים. הערה: שיטות תמוגה אחרות יכולות לעבוד באותה המידה גם, אבל יעילות תצטרך להיקבע באופן אמפירי לגבי ההתאמה של דרישות assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate 3 x 30 שניות עם vortexing לסירוגין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לאסוףפסולת סלולרית ואגרגטים מסיסים; להציל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב כמויות שווה (~ 1.0 מיליליטר) של lysate תא electroporated עם 50 μl של השעיה שרף agarose streptavidin על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה הסוף-על-קצה. הערה: שרף זה לוכד את חלבון electroporated (ומתחמים כלולים) באמצעות תג זיקתה מחייב streptavidin פפטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2500 XG למשך 2 דקות וזורקי supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם 40 כרכי מיטה (~ 1 מיליליטר) PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl חיץ טעינת 4x LDS (141 מ&quot;מ טריס בסיס, 2% LDS, גליצרול 10%, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ&quot;מ Serva Blue G, פנול 0.175 מ&quot;מ אדום, pH 8.5), 20 μl diH 2 O, ו1 μl של phosphine 0.5 M טריס (2-carboxyethyl) (TCEP), המאפשר לכמה נפח להישאר בחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין&gt; 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים שימו לב: הואמחדש, משמש נוגדן ראשוני אנטי-PKN1. </li></ol>

<ol>
	<li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+injection+kit:+type+III+secretion+systems.">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li><li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+secretion+machines:+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells.">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li><li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants.">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li><li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems.">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li><li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria.">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li><li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection.">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li><li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disabling+surveillance:+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity.">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li><li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+GEFs:+a+common+theme+for+bacterial+pathogens.">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li><li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors.">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li><li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+ex+vivo/in+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+(AAV1-9)+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype.">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74 (2013).</li><li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+effector+protein,+VopQ,+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux.">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus.">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li><li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells).">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li><li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly(ADP-ribose)+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori.">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li><li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells.">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li><li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells.">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li><li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease:+electroporation+experiments.">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li><li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+antibodies,+DNA,+and+other+macromolecules+into+cells:+a+highly+efficient+method.">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li><li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery.">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li><li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements.">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li><li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation.">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li><li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake.">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li><li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells.">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li><li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+Basic+principles,+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology.">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li><li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+electroporation:+A+review.">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms.">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li><li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+techniques.">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li><li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GtgE,+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li><li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants.">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li><li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella.">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li><li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+PKN1.">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images.">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li><li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

effectors מופרש מחיידקים פתוגניים התפתחה כדי לתפקד בסביבת התא המארח, ולכן כדאי ללמוד אותם באתרו בתוך הפונדקאי. מבוא של effectors הספציפי של עניין לתאי מארח מאפשר אינטראקציות הפתוגן-המארח הרלוונטי כדי להיחקר בבידוד ללא הפרעות מחלבונים חיידק אחרים. המטרה הייתה לחקור electrop...

חיידקים גראם-שלילי רבים להעסיק מערכות הפרשה מיוחדות להזריק חלבונים הקשורים לאלימות (המכונים מפעילים) ישירות לתוך תאי מארח 1-5. יש לי effectors אלה מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים כוללים: דיכוי חסינות מארח, שינויי cytoskeletal, שינוי של סחר תאיים ואיתות, שינויי תעתיק, ושינויי פרוטאזום מארח 6-9. הפונקציות של כמה effectors ידועות, עם זאת מטרות המארח ופעולה הביוכימית (ים) של רבים אחרים עדיין לא נקבעו. תוך השוואת wild-type וזיהומים חיידקיים רקומביננטי היא גישה תקפה ללמוד מנגנוני אלימות מפעיל תאיים, הוא לעתים קרובות יתרון להציג מפעיל בודד לתוך התא המארח. לפיכך, שיטות פשוטות להצגה ואפיון חלבוני מפעיל חיידקים בהקשר של תאי מארח רצויה מאוד. פישוט wi הניתוח הניסיוניה מפעיל יחיד הוא קריטי כפי שאולי יש effectors אחרת פונקציות יריבה או מיותרות. כדי להשיג פישוט זה, חוקרים הציגו בעבר מקרו-מולקולות לתוך תאים על ידי שיטות רבות ושונות, כוללים התמרה ויראלית 10, microinjection 11, לגרד טעינת 12,13, איחוי תאים עם microinjection המושרה כימי 14, ריאגנטים חלבון קניינית &quot;transfection&quot; 15, משקעי סידן זרחה 16, וelectroporation 17-20. המולקולות הציגו נעות בין חומצות גרעין כוללים מיני DNA, RNA, וRNAi לחלבונים, צבעי תא-חדיר, ונוגדנים למטרות תאיות 21,22. יש כמה שיטות מגבלות כוללים הסוג של פולימר שיכול להיות מוצג, וניתוחים במורד הזרם מסוימים עשויים להיות מוגבלים בשל רעילות גבוהה סלולרית, מנגנונים מזיקים של פעולה, יעילות נמוכה, או יעילות מבוא. Transfection, often שימוש בשיטה לביטוי גנים של חיידקים בתאי יונקים, סובל גם המגבלה שכמה סוגי תאי מארח רלוונטיים, כגון מקרופאגים ותאים ראשוניים, הם עמידים במיוחד לקראת transfection. מעבר לכך, קשה לשלוט ברמות של חלבון חיידקים המיוצר על כניסתה של דנ&quot;א זר. יש הרבה עבודה שהוקמה electroporation של חומצות גרעין לשני תאי החיידקים ויונקים כטכניקת מעבדה משותפת; עם זאת, יש מחקר מתמשך לשיטות הטובות ביותר לאספקת חלבונים לתאים בתנאים פיסיולוגיים. דיווחים על transfection חלבון מבטיחים, אך דורשים חומרים כימיים ואופטימיזציה יקרים. הרצון להציג effectors חיידקים שעלולים להיות רעיל למגוון רחב של יעדי תא עם עלות מינימאלית הוביל אותנו לשקול electroporation כשיטה ללימוד חלבונים אלה in vivo. electroporation החלבון 23-25 ​​הוא נפגשהוד להציג חלבונים לתאים חיים באמצעות electropermeabilization, הידוע גם באלקטרו-transfection או אלקטרו-הזרקת 26. טכניקה זו משתמשת פולסים חשמליים בעוצמה גבוהה כדי ליצור נקבוביות בקרום תא. נקבוביות הפיכים אלה מאפשרים מקרומולקולות כי הם בדרך כלל לא נכללו מהחלל תאית להיכנס לתא. לאחר ההסרה של השדה החשמלי החיצוני, הקרום יכול לחתום מחדש, המאפשר לתא כדי לשמור על מולקולות שעברו דרך הנקבוביות 27,28. Electroporator סטנדרטי שימש במחקר זה כדי להציג באופן עקבי effectors חיידקים לשני תאים כמו מקרופאג-עכבר ותאי האפיתל אנושיים. השיטה היא מהירה, יעילה, ולא יקר, ללא ירידה משמעותית בכדאיות סלולרית. ניתן דמיינו חלבונים הציגו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence או משמשים למבחנים פונקציונליים. זה הודגם באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסטנדרט שאינו רעיל, כמו גםשני חלבוני סלמונלה מפעיל, SspH1 וGtgE. אנו מציעים electroporation חלבון ככלי נוסף ברפרטואר לחקר חלבוני ארסיות חיידקים ואת תפקידיהם בתאי מארח אוקריוטים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">Material or Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-050-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Methanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Culture Plastic</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>E. coli Pulser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent confocal microscope&#160;</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Model&#160; LSM 710&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Dishes for Microscopy</td>
			<td>Wilco Wells</td>
			<td>HBSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HALT Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">78430</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HeLa Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDS 4X Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (MEM)&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Against Target of Interest</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Chill to 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Agarose Resin Suspension&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">646547</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8585</td>
			<td>Irritant, Toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of functional bacterial effectors into mammalian cells

המחקר של אינטראקציות חלבון בהקשר של תאי חיים יכול ליצור מידע קריטי על לוקליזציה, דינמיקה, ושותפים באינטראקציה. מידע זה הוא בעל ערך במיוחד בהקשר של אינטראקציות מארח הפתוגן. חלבוני הפתוגן רבים לתפקד בתוך תאי מארח במגוון רחב של דרך כגון, מה שמאפשר התחמקות ממערכת החיסון המארחת וההישרדות בסביבה תאית. ללמוד אינטראקציות מארח תאי הפתוגן-חלבון אלה, מספר גישות נמצאות בשימוש נפוץ, ובם: בזיהום vivo עם זן לבטא חלבון מתויג או מוטציה, או הקדמה של גני הפתוגן באמצעות transfection או התמרה. לכל אחת מהגישות הללו יש יתרונות וחסרונות. חפשנו אמצעי להציג ישירות חלבונים אקסוגניים לתאים. Electroporation משמשת בדרך כלל כדי להציג חומצות גרעין לתאים, אך הוחל חלבונים לעתים רחוקות יותר אם כי בסיס biophysical הוא בדיוק אותו הדבר.Electroporator סטנדרטי שימש להציג effectors חיידקי זיקה מתויגת לתאי יונקים. תאי אפיתל מקרופאג ועכבר אנושיים היו בתרבית בשיטות מסורתיות, מנותקים, והניחו בcuvettes electroporation פער 0.4 סנטימטר עם חלבון אקסוגני חיידקים פתוגנים של עניין (למשל סלמונלה Typhimurium GtgE). לאחר electroporation (0.3 קילו וולט) ותקופת החלמה (4 שעות) קצרה, חלבון תאיים אומת על ידי fluorescently תיוג החלבון באמצעות תג זיקתה ובחינת חלוקת מרחב ובזמן על ידי מיקרוסקופ confocal. חלבון electroporated הוצג גם להיות פונקציונלי בתוך התא ומסוגל סחר subcellular נכון ואינטראקציה בין חלבונים. בעוד החלבונים אקסוגניים נטו לצבור על פני השטח של התאים, היו לי דגימות electroporated עליות גדולות ביחסי ריכוז מפעיל תאיים לדגירה לבד. הפרוטוקול הוא פשוט ומהיר מספיק כדי להיעשות בapאופנת arallel, המאפשרת לאפיון תפוקה גבוה של חלבונים בתאי מארח הפתוגן כוללים מיקוד ותפקוד של חלבוני ארסיות subcellular.

כהוכחה ראשונית של מושג, חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר הוצג בהצלחה בתאים יונקים באמצעות electroporation. GFP, 27 KD משוער חלבון משקל מולקולרי הוא הציג בדרך כלל לתאי יונקים (בדרך כלל באו לידי ביטוי מפלסמיד דנ&quot;א) ככלי ביולוגיה מולקולרי ללא רעילות תאית משמעותית. תאי הלה הודגרו <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells at JoVE.com

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Views.  Pacific Northwest National Laboratory. Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells. 

Video: Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...