Name: using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish
Uploaded: 2016-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish at JoVE.com

We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).

1. Assay תגובת מגע עורר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 2 DPF עוברים Assay תגובה מגע עורר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את השעה ביום שבה הבדיקה נעשית עולה בקנה אחד בין הניסויים כי הפעילות יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך היום 17,18. הערה: הניסוי צריכה להתבצע עיוור ואת סדר הבדיקות באקראי למזער חפצים הניסיונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצה את הדגים זנים מספר, אשר אינו ידוע הפרט בביצוע הניסוי. בעקבות זאת, באמצעות כלים מקוונים זמינים באופן חופשי ליצור רשימה אקראית המכתיבה את סדר הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות שעה אחת לפני הבדיקה, עוברים dechorionate ידי קורעת חור סיסית ואת משיכתו בעדינות סיסית בנפרד באמצעות פינצטה בסדר. הסר את כל פסולת מצלחת פטרי לפני החזרה אל האינקובטור C 28 °. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע Assay תגובת מגע עורר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> STA חוםGE ל -28 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות לפני תחילת הבדיקה. הערה: שלב זה נשלט על טמפרטורה יישאר 28 &#160; ° C למשך של בדיקות. טמפרטורה תשפיע פעילות ועל כן חשוב לשמור על טמפרטורה קבועה. אם במה מחוממת אינה זמינה אז הטמפרטורה של המים צריכה להיות במעקב כל הניסויים צריכים להתנהל באותה הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי מלאות בינוני העובר (5 mM NaCl, KCl 0.17mM, 0.33 מ&quot;מ 2 CaCl, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4 במים) על גבי הבמה המוארת ולעגן את המצלמה במהירות גבוהה מעל צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת צריבה מצלמת וידאו (כגון זרם Pix 5, המתוארת כאן) ו תחת לשונית &quot;סביבת העבודה&quot; ובחר 1,000 מסגרת לכל שניות (1,000 fps) כמהירות הלכידה מנת להבטיח כי פעולת שחייה מהירה של הדג נרשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה עם עובר אחד בכל פעם, למקם את העובר middle של צלחת פטרי עם דג הזברה נראית בבירור את שדה הראיה. הערה: אם עובר שוחה משם לפני תחילת הניסוי ולהחליף אותה באחרת, כמו לתפוס מחדש ומיצוב של העובר עלול לגרום לכך שרשת desensitized לגירוי ותגובות פרץ חזר עשוי לקדם חולשת שרירים בחלק מדגמי מחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הקלטה על ידי לחיצה על כפתור &quot;הקלט&quot; ו, לספק גירוי mechanosensory לעובר על ידי נגיעה בו בעדינות עם מחט קהה על החלק העליון של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את ההקלטה לאחר שהעובר שחתה מחוץ לשדה הראייה או חזר לנוח. הערה: פסגות האצה בתוך 0.2 השניות הראשונות של תגובת בריחת הפרץ בעקבות הגירוי המכאני. לכן, להבטיח כי לפחות במהלך 0.2 השניות הראשונות של תגובת בריחת הקלטת הדג נמצא בשדה הראייה. השימוש בתוכנה כמתואר בשלב 1.2.3, הנתונים באופן אוטומטי יישמרוכקובץ וידאו .avi. תוכנה ללכידת וידאו אלטרנטיבית כגון חינם לכידת וידאו או Softonic, אשר שניהם זמינים באופן חופשי להורדה, יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיר את העובר בצלחת פטרי חדש ובחר עובר אחר לבדיקה. תבצע את הבדיקות על מינימום של 15 דגים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות התנהגות שחייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את התנהגות שהחייה, להפעיל את התוכנה ובחר את &quot;תנועת הזחלים היחידה ללא רקע חיסור&quot; מודול כדי לפתוח את קובץ וידאו נשמר .אבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הכלי &quot;ביד חופשית&quot; או &quot;פוליגון&quot; מאזורי בחר שורת התפריטים של הסרט כדי לשמש לניתוח. ודא כי האזור המקיף הוא את המיקום המקורי של הדגים באזור שהדגים ישחו לתוך. ודא כי הבדיקה נשללת מהאזור להיות מנותח. התוכנה אוטומטית יהיה לעקוב אחר מסלולו של דגים בתוך האזור הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע tהוא ניתוח, לחץ על &quot;ניסוי&quot; משורת התפריטים ובחר &quot;הוצאה להורג&quot;. כאשר יתבקש לשמור את קובץ ניתוח נתונים הגולמי (.phr פורמט) במיקום הרצוי. לאחר השמירה, לחץ על &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את הניתוח. בסופו של הניתוח על ידי לחיצה על &quot;עצור&quot; תחת &quot;הניסוי&quot; לתפריט נשלף. חלון המכיל את התוצאות יוצג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלול ימינה כדי לקבל את הערך &quot;האצה מקסימלית&quot;. אם תרצו, לייצא נתונים אלו על ידי סגירת חלון התוצאות והלחיצה על הכפתור &quot;תוצאות היצוא מיידיות&quot; תחת &quot;התוצאות&quot; לתפריט נשלף. בחר בקובץ ניתוח נתונים הגולמי המתאים ולחץ על פתוח. קובץ טקסט שניתן לפתוח בתוכנית גיליון אלקטרוני יישמרו בתיקיית היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור כל דג פרט ממוצע להשיג האצה מקסימלית הממוצעת עבור כל זן (ראה איור 1). הערה: כחלופה using התוכנה המתוארת כאן, חבילות דומות כגון תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי וניתן להשתמש בו כדי לחלץ את הנתונים הרלוונטיים תנועה. תוסף Tracker חלקיקי 3D ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר מסלולי שחייה. </li></ol></li></ol> 2. Assay תנועה - 10 דק &#39;מבחן שחו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 6 DPF עוברים לניתוח שחייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, מעין עובר הגנוטיפ הנדרש, למשל על ידי בחינת ביטוי של חלבון פלואורסצנטי או על ידי הפנוטיפ, והמקום לתוך צלחת פטרי נפרדת (25-30 עובר לכל צלחת). לחלופין, הגנוטיפ יכול להיקבע לאחר השלמת assay תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעת 3 DPF, בחינה מחדש בצלחות פטרי ולהסיר כל עוברים שלא נולדו ופסולת. חזור בצלחות פטרי עד 28 ° C חממה עד 6 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבצע את הבדיקות של כל זני 09:00-12:00, וזה הזמן שבו זחלי דג זברה הם פעילים ביותר. קבע סדר אקראי בדיקות ומצבה של pמאוחר של wildtype דגימות מוטציה כדי למזער את ההשפעות של בדלי יממה והטיית ניסיוניים אחרים. הערה: חשוב כי זמן בדיקה עקבית בין הניסויים כי הפעילות יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות 30 דקות לפני בדיקה, זחלי מקום לתוך צלחת 48-היטב עם זחל אחד לכל טוב. לאחר ההעברה, למלא את בארות כך פני המים הוא ממש מתחת העליון של הבאר, הבטחת אין בועות. חזור צלחות עד 28 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צלחות מתוך האינקובטור להתאקלם לאור במשך חמש דקות לפני הבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע Assay תנועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 48-היטב לתוך תא ההקלטה, אשר מצויד במצלמה דיגיטלית אינפרא אדום, לכידת עד 60 מסגרות / שנייה, כך הזחלים כי ניתן לאתר בחושך. בדוק שכל הבארות ממוקמות בתוך הרשת המעגלית על תוכנות נידות ושכל הזחלים הם CLEקארלי לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה ובחר את מודול &quot;מעקב&quot;. תחת &quot;קובץ&quot; לחץ על &quot;ליצור פרוטוקול חדש&quot; ולערוך את מספר בארות המשמשים לניסוי. גדר היא את משך הניסוי ותקופת האינטגרציה עד 10 דקות על ידי לחיצה על &quot;הפרמטרים&quot; לתפריט נשלף ובחירה &quot;פרמטרי הפרוטוקול&quot;, ובהמשך על הכרטיסייה &quot;הזמן&quot;. באותו &quot;פרמטרי פרוטוקול&quot; תיבה דו שיח לחץ על הלשונית &quot;אפשרויות&quot; וודא כי תיבת הסימון &quot;Numeriscope&quot; לוחצת שבעקבותיה, התיבה &quot;פרמטרי פרוטוקול&quot; הדיאלוג יכולה להיות סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את אזורי ההקלטה להדגיש את הרשת כולה ולחץ לחיצה כפולה על אחת הבארות. לחץ על הכפתור &quot;לצייר אזורים&quot; ולצייר סביב בפינה השמאלית העליונה, בפינה הימנית עליונה, ובארות שמאליות תחתונות ולחץ על &quot;לבנות&quot;, אשר מאפשרת לתוכנה לקבוע את המיקום באופן אוטומטי של כל טוב. כמו כן לצייר בקנה מידההבר ולחץ על &quot;חלים לקבוצה&quot;. בסיום, לחץ על הכפתור &quot;לצייר אזורים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית לקבוע את סף זיהוי על ידי ההחלקה &quot;סף זיהוי&quot; בר לרמה שבה רק תנועות הדגים מודגשות ללא אותות רקע. ההערה: סף זיהוי ינוע בין זנים ובכך הספים צריכים להיקבע בכל פעם נבחן זן חדש. בנתוני הנציג הציגו סף זיהוי של 25 מ&quot;מ / sec היה בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת בדיקות להיכנס ספי תנועה לגילוי של חוסר פעילות, ותנועות קטנות וגדולות. הערה: הנתונים נציג הציגה סף חוסר פעילות של 6 מ&quot;מ / sec ו סף פעילות פרץ של 30 מ&quot;מ / sec היה בשימוש. הספים לקבוע את התנועה המינימלית כדי להיחשב פעיל ושל רמת הביטחון הנדרשת כדי להיחשב פעילות פרץ ולאפשר סיווג הפעילות לתוך קטן (פעיל אך מתחת פעילויותיו פרץספי ty) וגדולים (גבוה מסף פעילות פרץ) תנועות. הספים ניתן לשנות בהתאם לפעילות של זני דגים בפרט מנותחים. הערה: למרות assay ניתן לבצע אחד משני מצבים בהירים או כהים, זחלי דג זברה הוכחו להיות יותר פעילים ב -18 כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עוצמת האור בתוך החדר להיות ב 0% על ידי לחיצה על &quot;הגדרות נהיגה אור&quot; כפתור תחת &quot;פרמטרים&quot; לתפריט הנשלף. בתיבת הדו-שיח שתופיע, להוסיף את ההגדרות האור הנדרשת. הערה: עוצמת האור בתוך החדר יכולה להיות מופעלת כדי להפעיל ולכבות בזמן הבדיקות כדי לעורר פעילות זחל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הדלת של חדר ההקלטה להתחיל הקלטת וידאו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות התנהגות שחייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי הושלם, לחץ על &quot;עצור&quot; תחת &quot;הניסוי&quot; לתפריט נשלף. Bo דיאלוגx עם כל התוצאות יוצג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לגשת לתוצאות אלה ב- Excel לחץ על &quot;לפתוח המכיל תיקייה&quot; ולפתוח את קובץ Excel שמופיע בתיקייה שהתקבלה. הפרמטרים החשובים הם &quot;smlct&quot; (ספירת תנועה קטנה), &quot;larct&quot; (ספירת תנועה גדולה), &quot;smldist&quot; (מרחק הכולל מכוסה על ידי הדגים בתנועות קטנות) ואת &quot;lardist&quot; (מרחק הכולל מכוסה על ידי הדגים בתנועות גדולות ). הערה: בעקבות ההקלטה, התוכנה גם מחזירה שני קבצי פלט נוספים בצורת קובץ avi (שמכילה סרטון וידאו של קלטת 10 דקות) קובץ תמונת .png (המכיל ייצוג חזותי של התנועה במהלך 10- ניסוי דק, ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערכי התנועה מחושבים, חזור על קבצי AVI ו- png לסקור אם ערכי התנועה מחושבים מתארים במדויק את תנועות השחייה של הדג (ראה איור3). הערה: כחלופה באמצעות התוכנה המתוארת כאן, חבילות כגון תוכנת ImageJ זמין באופן חופשי וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר התנהגות locomotory. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splice+site+mutation+in+laminin-&#945;2+results+in+a+severe+muscular+dystrophy+and+growth+abnormalities+in+zebrafish.">A splice site mutation in laminin-&#945;2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).</li><li>Gupta, V., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model &amp; Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li><li>Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+BAG3+myofibrillar+myopathy+suggest+a+toxic+gain+of+function+leading+to+BAG3+insufficiency.">Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).</li><li>Sztal, T. E., Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+nemaline+myopathy+reveal+a+spectrum+of+nemaline+bodies+contributing+to+reduced+muscle+function.">Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function.</a> Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).</li><li>Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+discovery+and+global+gene+expression+analysis+in+zebrafish.">Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish.</a> Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).</li><li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation.">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).</li><li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown.">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. , (2005).</li><li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays.">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. (82), e50925 (2013).</li><li>Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+measurement+during+contraction+to+assess+muscle+function+in+zebrafish+larvae.">Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li><li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+6-minute+walk+test+as+a+new+outcome+measure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).</li><li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+6-minute+walk+test+and+other+clinical+endpoints+in+duchenne+muscular+dystrophy:+reliability,+concurrent+validity,+and+minimal+clinically+important+differences+from+a+multicenter+study.">The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study.</a> Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).</li><li>Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+locomotor+activity+in+zebrafish.">Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).</li><li>MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+in+larval+zebrafish:+Influence+of+time+of+day,+lighting+and+ethanol.">Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+dominant+ACTA1+disease+recapitulate+human+disease+and+provide+insight+into+therapies.">Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies.</a> Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).</li><li>Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ACTA1+mutation+resulting+in+a+severe+congenital+myopathy+with+nemaline+bodies,+intranuclear+rods+and+type+I+fibre+predominance.">A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance.</a> Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).</li><li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish.">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).</li><li>Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+of+larval+zebrafish:+ontogeny+of+body+waves+and+implications+for+locomotory+development.">Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development.</a> J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).</li><li>Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonia+congenita-associated+mutations+in+chloride+channel-1+affect+zebrafish+body+wave+swimming+kinematics.">Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics.</a> PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).</li><li>Moggio, M., Colombo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disease+heterogeneity:+a+prognostic+challenge.">Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge.</a> Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

רבי מודלים שונים של בעלי חיים כוללים עכברים, כלבים, דג זברה, זבובים ותולעים תרמו לכיוון הבנתנו את הבסיס הגנטי המולקולרי של מחלות שרירים, וסייעו בפיתוח גישות טיפוליות כדי להילחם בם. דג הזברה מתגאה מספר יתרונות לחקר מחלת שריר. דג הזברה מספקת מערכת manipulable גנטית להעריך דפוסים שרירים מורכבים בסביבה פיזיולוגית מתאימה, הדבר שאינו אפשרי במערכות בתרבות חוץ גופייה. בניגוד למודלים בעלי חיים בעלי חוליות אחרים, המספר הגדול של דגים מיוצרים, יחד עם הבהירות האופטית שלה, הופך לפשוט יותר מהירה, תפוקה גבוהה ב כימי vivo ו סריקות גנטיות. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מבחני תנועת דג זברה לספק תפוקה גבוהה שיטה אוטומטית כדי להעריך את ביצועי שריר במהלך embryogenesis דג הזברה. המבחנים הם יש להודות כי מקצבי יממהגירויים סביבתיים חיצוניים ישפיעו התנהגות שחי דג זברה באופן משמעותי 17,18. בדיקות חוזרות ונשנות של אותו דג הזברה גם תובלנה הרגלה וגרמו לצמצום בתגובת מישוש גירוי 23. לכן, על מנת להשיג תוצאות לשחזור בין ניסויים כל עובר דג זברה צריך להיבדק פעם אחת בלבד, בזמן תנאי היום ותאורה צריך להיות אחיד, וטמפרטורת מים צריך להיות מוסדרת בחוזקה. באמצעות המגע עורר ניתוח ב -2 DPF אנו יכולים למדוד את התאוצה המרבית ישירות תובענה שחי פרץ, אשר עומדת ביחס לכוח שריר. טכניקות קודמות דג זברה בחנו כוח שריר על ידי קשירת שני הקצוות של העוברים באי ציוד ניסיוני אשר התכווצות שרירים מגורה באמצעות שדה חשמלי ואת יכולת כוח המניבה של השריר 14 נמדד. בעוד שיטה זו מודדת את כוח קיבולת ייצור של tהוא שריר הזחל, זה לא למדוד את הכח בפועל שנוצר על ידי שריר הזחל במהלך שחייה. לפיכך, אנו פתחנו שיטה בעקיפין להעריך את הכח שנוצר במהלך תנועת שחי זחל הנורמלית לספק מדד כולל של בריאות שרירים. מערכת הווידאו במהירות גבוהה, מסוגלת להקליט תנועות דג זברה בודדות בשיעור מסגרת של 1,000 מסגרות / שנייה יכולה לשמש כדי לזהות הבדלים קטנים אך משמעותיים בתפקוד שריר, אשר אינם שונים באופן ישיר על ידי עין. זה יהיה עניין לראות איך שדווח בעבר שינויים בכוח-דור גירוי חשמלי לתאם עם שינויים בביצועים שחייה. בנוסף למגע עורר מבחני תגובה יכולים לשמש גם כדי להעריך קינמטיקה שחי, כמו צורה ומהירות גל הגוף במהלך התנועה שחי 24, לתת מדידת כמותית של התנהגות locomotory. בשל התנועה הספונטנית של zebrafהזחלים ish לאחר 3 DPF, לא הצלחנו לבצע את מבחני-לעורר מגע למדוד את תפקוד השרירים. לעומת זאת, מדדנו ביצועים שרירים על פני תקופה ארוכה על ידי קביעה ושח המרחק ידי זחלי דג זברה ב 6 DPF. בדיקה זו, אם כי אמצעי עקיף של תפקוד השרירים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות דגים מוצגות ביצועים שריר לקוי 8 או ניוון מוחיים 25,26. בדיקה זו לא רק מספקת מדידה מקבילה במבחן 6 דקות ההליכה אבל מתאים גם תפוקה גבוהה אוטומטית מסכי סמים או mutagenesis vivo.

במהלך דג הזברה בעשור האחרון שמש יותר ויותר ללמוד ביולוגיה של תא שריר ומחלות. הפיתוח החיצוני המהיר של עובר דג הזברה, בשילוב עם הבהירות האופטית שלה, מאפשר הדמיה הישירה של בניית שריר, צמיחה, ותפקוד. תהליך פיתוח שריר שמור ביותר דג זברה וזה אפשר דוגמנות המוצלחת של מגוון רחב של מחלות שרירים כוללים בניוון שרירים ו myopathies המולד 1-8. בחינה מדוקדקת של מודלי דג זברה לא ספקה רק תובנה רומן לתוך pathobiology תנאים אלה, אלא גם מספקת מצע שיאפשר הבדיקה של טיפולים מתאימים 6,9-13. ניתוח מודלי דג זברה של מחלות שריר מסתמך על מבחנים אמינים לשחזור למדוד ביצועי שריר. מחקרים קודמים מדדו את יכולת יצירת כוח בהצלחה של שריר תא המטען דג הזברה בדגים בין 3 ל 7 DPF ידיבגירוי חשמלי התכווצות של דג משותק מחוברת מערכת התמרת כוח 14. זה יכול לספק מדידה מפורטת של כוח אבל הם לא אידיאלי ניסויי תפוקה גבוהים יותר ויש יתרונות למדידת ביצועים שרירים במהלך שחייה. בשעה 2 DPF שריר דג הזברה היא מתפקדת במלואה הדג יכול לעורר תנועות שחייה פרץ בתגובה לגירויים. את assay בתגובה בריחה מגע לעורר משמש למדידת תאוצה במהלך תנועה שחייה פרץ, אשר ניתן להשתמש בהם כאמצעי בכוח התכווצות. אחד המדדים המנוצלים ביותר של תפקוד שרירים בחולי מיופתיה הוא מבחן 6 דקות הליכה, אשר מתעד את המרחק הכולל הלך על משטח שטוח קשה 15,16. יש לנו ליישם מבחן השוואה כדי למדוד את תפקוד שריר 6 DPF זחלי דג זברה, לפיה אנו עוקבים אחר המרחק הכולל ושחה, ואת המספר הכולל של תנועות שנעשו על ידי כל זחל על פני תקופה של 10 דקות. זו מבוצעתבאמצעות מערכת מעקב אוטומטית, אשר מספקת מדידות אמינות תפוקה גבוהה של ביצועי שריר. שתי הבדיקות שרירים הם מאוד לשחזור שימשו לכמת הבדלים בביצועי השריר במודלים מיופתיה דג הזברה 8.

<table><tbody><tr><td>21 G x 1&#039; Blunt Needle</td><td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td><td>TE2125</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Sigma</td><td>M8937</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri Dishes</td><td>Pacific Laboratory Products PT</td><td>S90001</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Camera</td><td>Baumer</td><td>HXC20</td><td></td></tr><tr><td>http://www.randomization.com</td><td>N/A</td><td></td><td>Steps 1.1.2, 2.1.3</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TEI-43L</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pipette</td><td>VWR</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>StreamPix5</td><td>NorPix</td><td></td><td>Step 1.2.3</td></tr><tr><td>Temperature Control Unit</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 8</td><td>ProSciTech</td><td>T04-821</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox System</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint</td><td></td><td>Steps 1.3.1, 2.2.1</td></tr></tbody></table>

using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish

פיתוח שרירי דג זברה הוא שמור ביותר עם מערכות יונקות הפיכתם מודל מצוין ללמוד את תפקוד שרירים ומחלות. myopathies רב המשפיע תפקוד שרירי שלד ניתן במהירות להעריך בקלות דג זברה במהלך הימים הראשונים של עובר. ב -24 שעות לאחר ההפריה (hpf), דג הזברה wildtype ספונטני השרירים מתכווצים הזנב שלהם ועל ידי 48 hpf, התנהגויות שחייה מבוקר התערוכה דג הזברה. צמצום תדירות, או שינויים אחרים, תנועות אלה עשויים להצביע על תפקוד לקוי שרירי שלד. כדי לנתח את התנהגות שחייה וכדי להעריך את ביצועי שריר בפיתוח דג זברה מוקדם, אנו מנצלים, הוא בתגובת בריחה עוררת מגע מבחני תנועה. מגע עורר מבחנים בתגובת בריחה יכולים לשמש כדי להעריך את ביצועי שריר במהלך פרקים קצרים פרץ וכתוצאה מהתכווצות של סיבי שריר מהיר עווית. בתגובה לגירוי חיצוני, אשר במקרה זה היא טפיחה עלראש, דג הזברה wildtype ב 2 ימים לאחר ההפריה (DPF) בדרך כלל מפגינים לשחות פרץ חזק, מלווה פניות חדות. השיטה שלנו מכמתת את תפקוד שרירי שלד על ידי מדידת האצה מקסימלית במהלך תנועה שחי פרץ, ההאצה להיות ביחס ישר את הכח הנוצר על ידי התכווצות שרירים. בניגוד לכך, מבחני תנועה במהלך התפתחות זחל דג זברה מוקדם משמשים כדי להעריך את ביצועי שריר בתקופות מתמשכות של פעילות שרירה. באמצעות מערכת מעקב כדי לפקח על התנהגות שחייה, נקבל חישוב אוטומטי של תדירות הפעילות ומרחק דג זברה ישנה ל- 6 ימים, רעיוני של תפקוד שרירי השלד שלהם. מדידות של ביצועי שחייה הן בעלי ערך עבור הערכה פנוטיפי של מודלי מחלות הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות או טיפולים כימיים המשפיעות תפקוד שרירי שלד.

מגע עורר assay בתגובה ניתן להשתמש כדי לקבוע את המהירות והתאוצה של תנועות השחייה שהינו מדד יחסי של כוח השריר. בתגובה לגירוי מכאני, כגון ברז קטן על הראש 2 DPF תערוכת דג זברה פראית סוג פעולה שחיה מהר. וידאו נתפס ונותח עבור שני מודלי מיופתיה דג זברה שונים: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), מודל של מיופתיה nemaline כי הוכח יש חולשת שרירים משמעותית, ודגם של ניוון שרירים דושנו שבו פגמי שרירים חמורים תוארו בשעה 5 DPF 19,20. תמונות מתוך וידאו של מגע טיפוסי עורר assay מיוצגים באיור 1 א. האצה של דג הזברה נבדק ונמצא שיא בתוך שניות 0.2 הראשון של התגובה בריחה שחייה פרץ (איור 1B). האצה מקסימלית שיא זו מספקת מדד כי הוא יחסי גרם כוחenerating קיבולת של שרירי השלד. הערכים האצים מקסימלית היו בממוצע על מנת להשיג ערך אצה מקסימלית ממוצע (± סטיית התקן של הממוצע) עבור כל זן: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): ממוצע = 276.0 ± 28.8 m / sec 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכולל 15 דגים בודדים; שליטת wildtype: ממוצע = 500.8 ± 50.28 m / sec 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 15 דגים בודדים; DMD PC2 - / - מוטציה: ממוצע = 249.9 ± 19.1 m / sec 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 12-19 דגים בודדים; DMD PC2 +/- heterozygotes: ממוצע = 235.9 ± 8.7 מ &#39;/ שני 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 16-27 דגים בודדים; DMD PC2 + / + הומוזיגוטים wildtype: ממוצע = 230.9 ± 8.7 מ &#39;/ שני 2, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 8-27 דגים בודדים (איור 1 ג). כצפוי, Tg (D286 ACTA1G -eGFP) דגים נמצאו כבעלי ירידה משמעותית אצת מקסימלית המציין את תפקוד שרירים מופחת, אשר עולה בקנה אחד עם מודלי עכבר ונתוני חולה 8,21,22. PC2 DMD - / - דגים מוטנטים עם זאת, לא הראו הבדל האצה מקסימלית, ב- 2 DPF, עולה בקנה אחד עם לגילוי פגמים שריר מ 3 DPF 20 (1D איור). מבחני תנועה בוצעו 6 DPF לקבוע את ושח הפעילות ומרחק ידי זני דג זברה כאינדיקצית ביצועי שריר. בעקבות בדיקה, ייצוג בתרשים של תנועות שחייה על פני תקופת בדיקות העשר דקות נוצר, עם קווים אדומים וירוקים המייצגים תקופות של תנועה איטית ומהירה בהתאמה וקווים שחורים מייצגי תקופות של חוסר פעילות (איור 2). הצג גבוה פעילות דג הזברה wildtype הפרט ללא תקופות יחסית של חוסר פעילות כמו opposed כדי Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דגים, שהם פחות פעילים תקופת הבדיקה (איור 2 ב). התנהגות שהחייה הייתה לכמת על ידי חישוב ממוצע ערכי הפרט של מספר התנועות ואת ושח המרחק ידי כל דגים (איור 3). שניהם, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דגים (איור 3 א ו 3 ב) ו DMD PC2 - / - דגים מוטנטים (איור 3 ג ו 3D) נמצאו כבעלי ירידה משמעותית במספר הממוצע של תנועות ומרחק שחה לעומת שלהם שולט: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דגים: מתכוונים מספר התנועות = 94.3 ± 13.6, אומר ושח מרחק = 112.9 ± 18.4 מ&quot;מ, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים 45 דגים; שולט סוג בר: מתכוון מספר התנועות = 177.4 ± 14.0, אומר ושח מרחק = 300.2 ± 22.8 מ&quot;מ, n = 3 חד עצמאיניסויים eplicate המהווים 45 דגים; DMD PC2 - / - מוטציה: מתכוון מספר התנועות = 163.3 ± 30.0, אומר ושח מרחק: 298.4 ± 60.37 מ&quot;מ, n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים דגים 12-20; DMD PC2 +/- heterozygotes: ממוצע מספר התנועות = 362.3 ± 38.8, אומר ושח מרחק: 660.3 ± 86.1mm n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים דגים 17-27; DMD PC2 + / + הומוזיגוטים wildtype: מתכוונים מספר התנועות = 341.9 ± 91.6, אומרים ושח מרחק = 574.3 ± 170.9mm n = 3 ניסויים לשכפל עצמאיים הכוללים דג 8-25. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> איור 1:. כימות מגע לעורר assay בתגובה ל -2 DPF עוברי דג הזברה (א) תמונות Snapshot של דג הזברה שליטה במהלך מגע לעורר מבחני ב 2 DPF. (ב) פרופיל האצה עבור sec 0.2 הראשון שלTg (ACTA1 D286G -eGFP) היחיד (אדום) ו שליטה יחידה (כחול) דג זברה לאחר יישום של גירוי המגע. התאוצה המרבית מיוצג על ידי קווים מקווקווים. (C, D) כימות של האצה מקסימלית (m / sec 2) רשמה מבחני בתגובה עורר מגע של (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דג הזברה (ד) PC2 DMD - / - דגים מוטנטים לעומת שליטה דג הזברה 2 DPF. ברי שגיאה לייצג ± SEM עבור 3 ניסויים לשכפל, * p &lt;0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> איור 2:. ייצוג מבחני תנועה עבור עוברי דג הזברה (א) עוברי דג הזברה ממוקמים צלחות 48-היטב תנועה נרשם מלמעלה באמצעות מצלמה דיגיטלית אינפרא אדום. (ב) סכמטי של תנועת דג זברה במהלך תקופת הבדיקה עם קווים אדומים המתארים תנועות מהירות, קווים ירוקים המתארות תנועות איטיות וקווים שחורים המתארים חוסר פעילות (כפי שנקבע על ידי ספי זיהוי נכנסו בתוכנה). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> איור 3:. כימות מבחני תנועה במשך 6 DPF הזחלים דג הזברה כימות (א) מספר התנועות (B) המרחק שעובר Tg (ACTA1 D286G -eGFP) דג הזברה לעומת שליטה דג הזברה ב 6 DPF.כימות של (C) מספר התנועות (ד) המרחק שעובר PC2 DMD - / - דגים מוטנטים לעומת שליטה דג הזברה ב 6 DPF. ברי שגיאה לייצג ± SEM עבור 3 ניסויים לשכפל, * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish at JoVE.com

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

using-touch-evoked-response-locomotion-assays-to-assess-muscle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Views.  Monash University. Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function. 

Video: Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biology

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. Following complete transection of their spinal cord, zebrafish extend glial and axonal bridges across severed tissue, regenerate neurons proximal to the lesion, and regain their swim capacities within 8 weeks of injury. Recovery of swim function is thus a central readout for functional spinal cord repair. Here, we describe a set of behavioral assays to quantify zebrafish motor capacity inside an enclosed swim tunnel. The goal of these methods is to provide quantifiable measurements of swim endurance and swim behavior in adult zebrafish. For swim endurance, zebrafish are subjected to a constantly increasing water current velocity until exhaustion, and time at exhaustion is reported. For swim behavior assessment, zebrafish are subjected to low current velocities and swim videos are captured with a dorsal view of the fish. Percent activity, burst frequency, and time spent against the water current provide quantifiable readouts of swim behavior. We quantified swim endurance and swim behavior in wild-type zebrafish before injury and after spinal cord transection. We found that zebrafish lose swim function after spinal cord transection and gradually regain that capacity between 2 and 6 weeks post-injury. The methods described in this study could be applied to neurobehavioral, musculoskeletal, skeletal muscle regeneration, and neural regeneration studies in adult zebrafish.

Capable of functional recovery after spinal cord injury, adult zebrafish is a premier model system to elucidate innate mechanisms of neural regeneration. Here, we describe swim endurance and swim behavior assays as functional readouts of spinal cord regeneration.

הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. ...

Neuroscience

בדיקת בהלה להערכת רעילות בעובר דג זברה

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

מחבר באור הזרקורים: בדיקת רעילות בתפוקה גבוהה באמצעות בדיקת תגובת בהלה של עובר דג זברה

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה