המחברים מבקשים להודות לחברים במעבדה דאולינג (אהרון Reifler, טרנט וו, אנג&#39;לה באסטה, וויליאם טלפר) שתרמו לפיתוח של הטכניקה ולייצור של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מכון טאובמן, המחלקה לרפואת הילדים באוניברסיטת מישיגן, ובחלק ממענקים מניוון השרירים האגודה (JJD MDA186999) והמכונים הלאומיים לבריאות (JJD 1K08AR054835).

1. Coverslips הכנת פולי-L-ליזין מצופה (זמן: 1 שעות) coverslips הציפוי מאפשר ליישוב myofiber מהיר והידבקות. זה עשוי להתבצע במהלך שלב הניתוק של בידוד myofiber (שלב 2 להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור ולמקם Parafilm על החלק התחתון של צלחת פטרי 60 מ&quot;מ (מותג כלשהו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו תלושי לכסות מיקרוסקופ זכוכית (בקוטר מ&quot;מ 12) על Parafilm בצלחת תרבית רקמת 60 מ&quot;מ או למקם אותם באופן אישי בבארות בודדות של 24 גם צלחות. </li></ol> הערה 1: coverslips העגול הקטן אלה מסייעים להתרכז מספרי myofiber ולצמצם את השימוש בנוגדנים עודף. הערה 2: coverslips גודל אחר יעבוד, עם זאת, הכמויות של חומרים כימיים ועוברים המשמשים צריכים להיות בהתאם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50-200 μl של פתרון poly-L-ליזין (0.01%) על כל מכסה זכוכית בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את coverslips לשבת לפחות אחד הוur ב 37 ° C. incubations יותר לא להשפיע לרעה על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר-L-ליזין פולי פתרון ממכסה הזכוכית ולשטוף פעמיים עם מינימום של 100 PBS μl 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר coverslips לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips מוכן לmyofibers עכשיו. </li></ol> הערה 3: כדי להבטיח סטריליות, ציפוי יכול להיעשות במכסת מנוע ועל coverslips autoclaved. הערה 4: שמור על צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם Parafilm בתחתית. התקנה זו תשמש במהלך ציפוי myofiber וimmunolabeling (מאוחר יותר צעדים). 1 אלטרנטיבי: במקום coverslips הציפוי מייד לפני השימוש, ניתן להשתמש בם מניית coverslip מצופה. צלחת 60 מ&quot;מ פטרי המכילה מינימום של 2 מיליליטר פולי-L-ליזין יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס המכילה coverslips רב. עם חלופה זו מתחילה בצעד 1.5 לעבד את coverslips לmyofibers. חלופה 2: אנחנו גם coverslips מעיל בפולי-L-ornithine. Tשלו הוא יותר עבודה אינטנסיבית, אבל הוא שימושי עבור culturing לטווח ארוך יותר, כי coverslips מצופה פולי-L-ornithine יכול להיות UV שטופל. עם טיפול UV וטכניקה סטרילית זהירה בדרך כלל יכול להישמר myofibers החי בתרבות מן 4-7 ימים. 2. דיסוציאציה של עוברי דג הזברה וציפוי של myofibers (זמן: 1 עד 3 שעות) הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי הטוב ביותר חל עד 3 DPF (לאחר ימי הפריה) עוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי דג הזברה לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר סטנדרטי ולהסיר כמה שיותר מים דגים עודפים ככל האפשר. בדרך כלל, ניתן להשתמש בם 10-20 עובר לכל צינור, אם כי פחות. באמצעות יותר מ 20-25 עוברים לעתים קרובות תוצאות בהכנה של צפיפות יתר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר chorions לפני הניתוק, באופן ידני באמצעות # 5 מלקחיים. לחלופין, ההסרה סיסית כימי מושגת עם טיפול Pronase 10-15 דקות. בדרך כלל, ההסרה הקודמת של סיסית נחוצה רק כאשר אישור מראש של mutפנוטיפ או מורפולוגיה נמלה נדרש, או בעת שימוש בשלבים שבו עוברים הם בקעו באופן טבעי מהסיסי שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 900 μl של CO 2 תקשורת עצמאית לצינור המכיל את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של collagenase הסוג השני 100 μl, ריכוז 3.125 מ&quot;ג / מיליליטר סופי (פתרון collagenase המלאי ב31.25 מ&quot;ג / מיליליטר מדולל ב 1x PBS) להתחיל דיסוציאציה. גם Collagenase IV יכול לשמש לדיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב עוברים על שייקר מסלולית, וtriturate כל 30 דקות ב RT באמצעות Pipetman P1000 לטחינה הדקה. </li></ol> הערה 2: לפקח על ניתוק עובר בזהירות; מעל או מתחת לניתוק (בעיקר יותר) הן הסיבות הנפוצות ביותר לכישלון פרוטוקול. פעמים לעיכול משתנות בהתאם לעוצמת טחינה דקה, מספר עוברים לכל צינור, וגיל העוברים. כמו כן, לעתים קרובות פחות (בהשוואה לסוגים פראיים) לעוברים ממוטציות שרירי שלד. פתק3: זמן עיכול הממוצע לגיל עובר: DPF 1 = 1 שעות, 2 DPF = 1.5 שעות, 3 DPF = 2 שעות, וDPF 4 = 2-2.5 שעה. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול כאשר לא כל עוברים גלויים, עדיין חתיכות מוצקות עדיין גלויות - זה חיוני כדי למנוע overdigestion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות עם עוברים ניתק ב0.8-2.3 XG במשך 3-5 דקות לתאי גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתאי pelleted ולשטוף 2x עם CO 2 תקשורת עצמאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת CO הטרי 2 תקשורת עצמאית לresuspend תאים. 1 מיליליטר משמש בדרך כלל לpreps של 10-20 עוברים. הנפח וניתן לשנותם מבוסס על מספר עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000, עובר השעיה עובר דרך מסנן 70 מיקרומטר. זה מסייע להסיר פסולת לא רצויה מההכנה. </li></ol> הערה 4: השעיה עובר יכולה להיות מסוננת בפעם שנייה דרך מסנן 40 מיקרומטר כדי להסיר פסולת לא רצויה נוסף. מסינון כפול, התאוששות היא approximately 800 μl מנפח התחלתי של 1 מיליליטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 50-100 μl של ההשעיה myofiber לכל coverslip מצופה פולי-L-ליזין. </li></ol> הערה 5: ביצוע שלב 2.9 בצלחות פטרי עם Parafilm על הקרקעית, שהוכן קודם לכן. Parafilm שומר ההשעיה myofiber את ההפעלה מcoverslips המצופה. שמור על צלחות פטרי מכוסות כדי למנוע אידוי. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר myofibers ליישב כ 1 שעות על coverslips המצופה בטמפרטורת חדר. </li></ol> הערה 6: myofibers יתחיל להתיישב בתוך 5-10 דקות. עם זאת, עבור קובץ מצורף myofiber טוב, מינימום של 1 שעות (1-2 hr) מומלץ. מאפשר myofibers להסתפק עוד לא יפגע בהכנה. לincubations יותר (כולל בלילה), ניתן להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת. עם אנטיביוטיקה וטכניקה סטרילית בדרך כלל יכולות להישמר תרבויות חיות עבור 1-2 ימים. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ &#39;בשידור חיyofibers ניתן לצפות בשלב זה. Myofibers מעוברים 2 DPF ומאוחר יותר יהיה לראות כתאים מפוספסים ומוארכים (איור 1). בשלב זה, myofibers מוכן לניתוח בשידור חי או לimmunolabeling עכשיו. </li></ol> באור 7: שריר שלד מ1 DPF עוברים אינו צלחת סיבים מוארכים וכברור מפוספסים. במקום זאת, myoballs הגדול גלוי. בנוסף, במהלך לאחר ניתוק שלב pelleting (שלב 2.6), 1 DPF myoballs צריך להיות centrifuged למינימום של 8 דקות בXG 5,000 להשיג גלולה. לניתוח של עוברים בשלב זה, מומלץ להשתמש בקו המהונדס להביע EGFP במיוחד בשרירי שלד 23. זה יאפשר זיהוי של תאים ממקור שריר לעומת מקורות אחרים. 3. הקרינה Immunostaining של myofibers דג הזברה הניתק (זמן: כ יום 1) 3.1. Immunolabeling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חלק שלתקשורת מmyofibers דבק coverslip המצופה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים באמצעות paraformaldehyde 4% או מתנול. לPFA, להסיר ½ נפח התקשורת ולהחליף עם אותה הכמות של PFA. תקן עבור 10 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר נפח כולל, להחליף עם 50-100 μl של PFA, ולתקן עבור נוספת 10 דקות. לקיבעון אלכוהול, מתנול קר כקרח או אצטון יכול להיות מיושם על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או 5 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף myofibers לפחות 3-5x עם 1x PBS או 1x PBS בתוספת Tween .0.1%. ממוצע לשטוף נפח 50-100 μl לכל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חסימת פתרון לmyofibers (עובד מלאי) ודגירה 20-60 דקות בטמפרטורת חדר. פתרון חסימה משתנות בהתאם לנוגדנים הראשוניים ומשניים. שני הנפוצים ביותר בשימוש במעבדה הם (1) 1x PBS, 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, 1% בסרום כבשים, 0.25% טריטון סופיים X-100 ו (2) X-100, 2 מ&quot;ג / מיליליטר טריטון 0.2% (0.2 % BSA) ו -5% בסרום כבשים / עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חסימת פתרון ולהוסיף נוגדנים עיקריים מדוללים או בנעילת פתרון או PBS. דגירה myofibers הלילה בשעה 4 ° C. הקפד גם Parafilm או לעטוף בניילון נצמד את צלחת פטרי המכילה coverslips טעון myofiber מצופה בנוגדן. חתיכות קטנות של מגבת נייר טבולה ניתן להוסיף ליצירת תא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן ראשוני מcoverslips ולשטוף coverslips 3-5x למשך 5 דקות עם PBS או פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים משני בריכוז מתאים בדילול מלא ב1x PBS או פתרון חסימה ל1-2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדנים משני ולשטוף myofibers 3-5x בPBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. </li></ol> 3.2. coverslips הרכבה <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1-2 טיפות של מגיב antifade לשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בזהירות את coverslip המצופה וimmunolabled באמצעות מלקחיים ומקום (myofibers למטה) coverslip על מגיב antifade בשקופית מיקרוסקופ. </li></ol> הערה 1: שימו לב לכיוון של גcoverslip oated הוא קריטי. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1-2 Kimwipes על משטח מוצק קשה. במהירות להפוך את השקופיות עם coverslips המצופה נח על מגיב antifade ולמקם אותו (coverslip למטה) על Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ אור לפינות של שקופית מיקרוסקופ כדי להסיר antifade העודף וליצור חותם חזק בין השקופיות וcoverslip </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לantifade שנותר לו להתייבש במשך 5-10 דקות ב RT, אז myofibers מוכן לתמונה (2A דמויות ו-B) או בחנות ב 4 ° C. </li></ol> 4. סידן הדמיה של תא חי באמצעות GCaMP3 ניתן לבצע ניסויי תא חיים בmyofibers לפני הקיבוע (בעקבות צעד 2.10). הפרוטוקול הבא מתאר הדמיה לחיות בmyofibers להביע 24 GCaMP3, מחוון סידן מקודדים גנטי, המתבטא על ידי האמרגן שרירי שלד הספציפי דג הזברה α-אקטין (pSKM) 23. לחלופין,בטכניקה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש צבעי מחוון סידן כגון פורע-2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עובר עם pSKM: GCaMP3 לבנות בשלב 1-2 התאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב3 DPF, לאסוף זחלים ולהכין myofibers כמפורט בסעיפים 1 ו -2. לאפשר myofibers לדבוק למינימום של 1 שעה. לטכניקה זו, coverslips מכין במנות 24 גם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל תקשורת עודפת, ולהוסיף 300 μl של תקשורת העצמאית הטרי CO 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. myofibers החיובי GCaMP3 צריך להיות גלוי תחת הקרינה ירוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המצלמה להקלטה, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון קפאין 30 מ&quot;מ בCO 2 תקשורת עצמאית. כדי לעורר את התאים, בעדינות פיפטה 300 μl של פתרון קפאין לתוך הבאר בהגדלה. בתוך 5-10 שניות, myofibers החיובי GCaMP צריך להגיב לקפאין עם גידול מהיר בקרינה (איור 3). MyofibERS עשוי גם להתכווץ. ראוי לציין, קפאין גורם לשחרור סידן מחנויות reticulum sarcoplasmic 25. סוכנים אחרים, כגון KCl 26 וryanodine 4, יכולים לשמש כדי לחקור שחרור סידן מתנהלת. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li><li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+myoplasmic+gap:+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li><li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction.">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li><li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors:+structure,+expression,+molecular+details,+and+function+in+calcium+release.">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity:+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan:+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease.">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey.">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li><li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy.">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Zebrafish+system.">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li><li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle.">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling,+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy.">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li><li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit.">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene,+CACNB1,+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants.">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li><li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles.">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=accordion,+a+zebrafish+behavioral+mutant,+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2++pump+SERCA1.">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים.

דג הזברה הוא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח שרירים ובתפקוד ב25,27,28 vivo. גם הם צמחו כנכס בעל ערך לדוגמנות מחלות שריר אנושי 14,15,20,29. אמנם ננקטו צעדים גדולים כדי לקדם את השימוש ויישום של דג הזברה לחקר תפקוד שרירים ומחלות שריר, יש צורך קריטי מת...

שריר שלד הוא רקמה מאוד מיוחדת אחראית ליצירת כוחות ההתכווצות הכרחיים לתנועתיות. התכווצות היא יזם באמצעות תהליך המכונה צימוד עירור והתכווצות (EC) שממיר את אותות חשמליים לשחרור סידן מחנויות תאית 1,2. שחרור סידן תוך תאי מפעיל את sarcomere לקצר וליצור כוח. הרכיבים ספציפיים הרבים של המכונות מולקולריות האחראים לתיווך צומת neuromuscular שידור 3, צימוד EC 4,5, והתכווצויות תלויות יקטין שרירן 6 ימשיכו להיות הנושא המתמשך של מחקר אינטנסיבי. בנוסף, חלבונים שמייצבים את קרום השריר במהלך 7,8 ההתכווצות לתווך שאיתות בין myofiber והמטריצה ​​תאית 7,9 זוהו ונחקרו בפירוט רב. מוטציות במספר גנים חשובים למבנה שרירפונקצית nd זוהה כגורמים למחלות שריר שלד אנושיים <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">(http://www.musclegenetable.org/).</a> מחלות אלו, מסווגים רחב כmyopathies שלד וניוון שרירים המבוססים על מאפיינים קליניים וhistopathologic, קשורות לחולשת שרירים, נכות לכל החיים, ו10,11 תמותה המוקדם. דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מצטיינת לדוגמנות ולומד מחלות שריר שלד אנושיות 8,12,13. זה כבר מועסק כדי לאמת את המוטציות גנטיות חדשות 8, מגדיר את ההיבטים חדשים של הפתופיזיולוגיה המחלה 14,15, ולזהות גישות טיפוליות חדשות 15,16. כוחו של דג הזברה לחקר מחלת שריר אדם מתייחס למספר רב של צאצאים, ההתפתחות המהירה של מבנה שריר ותפקוד, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה, ואת הקלות של מניפולציה גנטית ותרופתית של הזברה מתפתחתדגים 17. אנו ואחרים 12,18,19 לאחרונה פיתחנו טכניקה פשוטה לבידוד המהיר ויעיל של myofibers מדג הזברה מתפתחת. מתודולוגיה זו אפשרה הבחינה של myofibers בפירוט רב יותר מאשר יכול להיות מסופק על ידי ניתוח עובר שלם. הטכניקה נוצלה לאפיון של לוקליזציה subcellular חלבון 20 כמו גם לזיהוי מאפייני histopathologic חשובים כחלק ממחקרי אימות במודלים של מחלה חדשה שפותחו 21. יתר על כן, myofibers המבודד יכול בנוסף לשמש הדמיה חיות וללימודי אלקטרו 22, טכניקות שתאפשרנה החקירה של היבטים מרכזיים של תפקוד שרירים. הפרוטוקול הספציפי לבידוד myofiber, יחד עם שתי דוגמאות של ניסויים האנליטי שלאחר מכן, הוא מפורט בחלקים הנותרים של כתב היד הזה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>70011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independent medium</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>18045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004186</td>
			<td>Lot 41H12764</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>L5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-545-82 12CIR-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RYR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>34C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מודל יקרת ערך לחקר תפקוד שרירי שלד ולחקר מחלות שריר אנושיים. למרות יתרונות רבים המוצעים על ידי ניתוח vivo של שרירי שלד בדג הזברה, לדמיין את סביבת החלבון המורכבת והמחוטב האחראי על תפקוד שרירים, במיוחד בכל עוברים, יכול להיות בעייתי. הפרעה זו נובעת מגודלו הקטן של שרירים שלד דג הזברה (60 מיקרומטר) ואת הגודל קטן עוד יותר של sarcomere. כאן אנו מתארים ולהדגים שיטה פשוטה ומהירה לבידוד myofibers שלד מעוברים וזחלי דג הזברה. אנו גם פרוטוקולים הממחישים טכניקות הכנת הודעה שימושיות לניתוח מבנה שרירים ובתפקוד. באופן ספציפי, אנחנו פירוט הלוקליזציה הבאה immunocytochemical של חלבוני שריר שלד והניתוח איכותני של שחרור סידן מגורה באמצעות הדמיה סידן תא חי. בסך הכל, בסרטון וידאו זהמאמר מספק שיטה ישר קדימה ויעילה לבידוד והאפיון של myofibers שלד דג הזברה, טכניקה המספקת צינור ללימודים שלאחר מכן מספר עצום של מבנה שריר ותפקוד.

immunolabeling ניאון של myofibers (איור 2) תמונות מראים דפוס ניאון תיוג צפוי מmyofibers immunostained לאחר בידוד וציפוי מוצלחים. Myofibers סומן בתווית עם או קולט אנטי ryanodine (1:100) (איור 2 א) או אנטי-α-actinin (1:100) (איור 2) נוגדנים, ולחש?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations at JoVE.com

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcellular חלבון, ופיזיולוגיה של שרירים.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  University of Michigan.  דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcell...

Video: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.