עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות המענקים HL44485 וHL28607.

הצהרת אתיקה: כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. 1. ייצור ראשוני של Micropipettes, Restrainers, וחוסמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה צינורות נימי הזכוכית בורוסיליקט נקיים במחצית באמצעות חולץ אלקטרוני מותאם כך, כאשר משכו, החלק המתוח של הצינור הוא כ 1 ס&quot;מ האורך ושני חצאים הם סימטריים במידה מסוימת. ודא שלהתחדד עולה בקנה אחד עם הממדים באיור 1. השתמש בשני חצאים לmicropipettes, restrainers וחוסמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוע micropipettes באמצעות גלגל שחיקה אוויר מונע 30 עם 0.5 מיקרומטר נייר מחוספס רחץ במים. הגדר את הזווית של בעל micropipette כך שזה בערך 30 מעלות מאופקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף ולייבש את micropipettes באמצעות יניקה למשוך אצטון הנקי באמצעות הקצה ועד הפיר. בדוק את micropipettes (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ זקוף קטן עם 4 × 40 × מטרות מצוידות בבעל micropipette קליפ התנין וreticle עינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipettes בחר עם פתיחת טיפ כ -50 מיקרומטר ארוכים עם שיפוע שאורכו / רוחב יחס הוא בין 3.1 ו -3.5 ועם נקודה בחדות מחודדת אשר מסייעת לחדור את סיבי הקולגן הקשים בלפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן 15-20 micropipettes בגדלים שונים מעט בתיבה נטולת אבק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך restrainers באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימי זכוכית משך זמן קצר ליד microflame כדי ליצור קצה קהה (איור 1). אחסן כמה בקופסא ללא אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך microoccluders באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימים משך תחת microflame ועדינות לכופף (באמצעות מתאם צינור, למשל., 23G) טיפ הנאה (כ 4 מ&quot;מ מקצה) כדי להפוך את הזווית של קרוב ל 120 מעלות לפיר ( <sטרונג&gt; איור 1 ג). הפוך ולאחסן כמה. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זכר (350-450 גר &#39;) או Sprague-Dawley חולדות נקבות (200-300 גרם) עם נתרן pentobarbital (80-100 מ&quot;ג / קילוגרם, סיגמא אולדריץ, P3761) באמצעות הזרקה תת עורית; להגן לפדר על ידי לא באמצעות זריקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוניים, לשמור על הרדמה על ידי זריקות משלימות (30 מ&quot;ג / קילוגרם) לפי צורך. לקבוע עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן או קרני. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, להרדים את העכברוש באמצעות מנת יתר של pentobarbital או הזרקה תוך לב של אשלגן כלורי רווי בהרדמה. </li></ol> 3. להכין פתרונות ואריתרוציטים לשימוש כסמני זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של רינגר היונקים לsuperfusate ופתרון perfusate השליטה (בדרך כלל הפתרון של רינגר המכיל 10 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת שומן יונקיםאלבומין החופשי שור בסרום, BSA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> perfusate סינון באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים זעירים שעלולה לחסום את קצה micropipette; לסנן לתוך מיכל נקי קטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אריתרוציטים על ידי ציור על 0.2 מיליליטר דם מוריד הזנב של העכברוש הרדים למחט 20G במזרק קטן המכיל 0.05 מיליליטר הפרין (1000 U / ml) ולהעביר לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות המכיל כ -14 פתרון של רינגר יונקים מ&quot;ל פתרון . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לארוז בעדינות תאים אדומים (כ 200 גרם × מקסימום 7 דקות). לצייר את supernatant מחדש להשעות את התאים האדומים בפתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה והסרת שלוש פעמים supernatant לעזוב את התאים אדומים ארוזים בחלק התחתון של הצינור לשימוש מאוחר יותר. שים לב שהליך זה מפחית טסיות perfusates הסופי פחות מ -0.1% מרמות נורמליות 31. </li></ol></li></ol> 4. מסדרים את רקמות בבעלי החייםמגש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן של החולדה הרדים ממתחת לטבור לתהליך xiphoid. ודא שהאזור המגולח משתרע סביב הצד הימני (לעכברוש הניח בצד ימין), כך ששיער אינו מהווה פתיל לצייר superfusate מתוך הרקמה היטב. להסיר שערות חתך עם תחבושת רטובה או רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את העור עם מלקחיים משוננים בוטים ולעשות חתך מרכז-קו (ארוך 2-3 סנטימטר) דרך העור באמצעות מספריים חסון. באמצעות קנס מספריים (איריס) לעשות חתך דומה באמצעות alba Linea, הרמת דופן הבטן עם מלקחיים משוננים כדי למנוע נזק למעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם בעלי החיים בצד השני שלה על המגש של בעלי החיים, משוך בעדינות את הבטן מחלל הבטן באמצעות החלת כותנה שקצה (עץ מקל) ספוגה בתמיסת רינגר ומלקחיים משוננים בוטים. מסדרים את הבטן ברקמה כל כך טוב שלפדרו מונח על העמוד לצפייה מבעד למיקרוסקופ לטפל כדי למנוע נגיעה לפדר (potentially נזק microvessels) עם או מלקחיים או כותנה. הערה: מגש בעלי החיים (איור 2 א) ניתן לבנות מפלסטיק ודורשת רקמות היטב (למשל, קוורץ המלוטש בערך 2 סנטימטרים קוטר 5 מ&quot;מ וגבוה.) (כ -3 מ&quot;מ עמוק), עמוד ברור אופטי, וכרית חימום הותאם כדי לשמור על הטמפרטורה של בעל החיים. העובי של העמוד לא יעלה על מרחק העבודה של המטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את מגש בעלי החיים על הבמה מיקרוסקופ כדי שלפדר גלוי דרך העיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם קו טפטוף כובד-הפד Superfuse לפדר עם הפתרון של רינגר היונקים שמרו על 35-37 מעלות צלזיוס ברציפות. השתמש פדה גזה להחזיק הבטן במקום, לעזור לשמור על לחות, ופתיל הפתרון של רינגר העודף מעל פני השטח. התאם את הזרימה ולשאוב את השפכים כדי לשמור על עובי superfusate עקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות microvessels venular היעד, שהםמגזרי unbranched במורד הזרם של זרימה מתכנס, ענפים אחד או שניים דיסטלי לנימים האמיתיות. מצא את כלי unbranched (באופן אידיאלי, 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך) שיש זרימת דם מהירה וחופשית של תאים לבנים דבק על קיר הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את כלי-דם קטנים מבחן במרכז שדה מיקרוסקופ ולעבור עוצר לעמדה בסמוך לאתר cannulation בחר. </li></ol> 5. מילוי micropipette והר במחזיק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני cannulating, להשעות את התאים האדומים בperfusate. להוסיף 7 μl של תאים אדומים ארוזים 0.5 מיליליטר perfusate במבחנה ורוסיליקט נקייה. הערה: Hematocrits של 1-3% יכול לשמש, אבל המטוקריט עקבי יביא לריכוזי perfusate עקביים של כל חומרים שוחררו מהתאים האדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים מזרק 1 מיליליטר עם מתאם צינור 23G וצינורות PE 50 (אורך סנטימטר 5-15). צייר את תערובת perfusate / אדום התא לתוך המזרק. הפוך מזרק לערבב ולגרש את כל הבועות מצינורות ומתאם. להתייעלות, צינורות לנכון כמה מזרקים לפני תחילת הניסוי ולשמור אותם בקופסא ללא אבק או שקית ניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipette על ידי קידום צינורות לתוך הסוף הגדול של micropipette עד שנוגע באזור המחודד. החל לדחוף מהיר עדין על בוכנת המזרק כדי למלא את קצה micropipette. הערה: זרם או טיפה זעיר צריך להיות גלוי בקצה לראיות מילוי מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך את צינורות תוך דחיפה קלה על הבוכנה כדי למלא את החלק הרחב יותר של פיר micropipette. הסר בועות קטנות בפיר הרחב על ידי מצליף פיר micropipette בזהירות. הערה: הליך דומה כבר מאויר 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את micropipette לבעל פיפטה עם יציאת צד המאפשר חיבור רציף לנוזל מד לחץ מים. ודא שבעל, שמצורף לדיסק הידראולי משמש לשליטה קידום יפה מאוד של micropipette, הוא בזווית קלה (15-25 מעלות)לאופקי כך שהקצה של להתחדד micropipette לא פגע בבטן או מגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הכונן ההידראולי על micromanipulator ניד, שבו יש x, y, z וכוננים כדי לאפשר קרוב יישור לכלי בדיקה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הלחץ ההידרוסטטי להחיל את הנוזל בmicropipette באמצעות מזרק או הנורה גומי מלא מים כדי לשנות את גובה נוזל בעמודת המים של מד הלחץ לכ -40 CMH 2 O מעל לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate כלי-דם קטנים בהקדם האפשרי לאחר מילוי פיפטה; תאים אדומים ליישב לתחתית של פיפטה, כך שלאחר כ -40 דקות מעט מאוד תאים אדומים יזרמו לתוך הכלי. </li></ol> 6. מדידת לחץ Microcannulation וכלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מיצוב micropipette המלא תחת מיקרוסקופ, לחץ בעדינות על עוצר את הרקמה ליד כלי-דם קטנים הפעלת כוח מספיק כדי אחיזת הרקמה. צייר אתעוצר בחזרה, מעט מתיחת הרקמה בקנה אחד עם כלי-דם קטנים, כך שהלחצים בסיבי קולגן mesenteric מיושרים עם הכלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את micropipette עם הכלי ולהוריד אותו לעין דרך העיני. הנח את הקצה רק במעלה הזרם של אתר cannulation נבחר ומוריד אותה אל הרקמה, כך שהוא חוסם באופן חלקי זרימה בתוך הכלי, אבל לא לחסום אותו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate הכלי על ידי הנהיגה קצה פיפטה לאט לתוך לום הכלי באמצעות הכונן ההידראולי. היזהר שלא לדחוף דרך הצד התחתון של כלי השיט. הערה: כmicropipette נכנס ללום, perfusate מהירות שוטף את הדם בכלי מחוץ ללום וperfusate חופשיות זורם לתוך דיסטלי מחזור של בעלי החיים לכלי-הדם הקטן מבחן, עקירת חלק מזלוף הדם הנורמלי בכלי מורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את לחץ זלוף על ידי התאמת מד הלחץ עד הדם (כפי שמצויןעל ידי התאים האדומים של בעלי החיים) נמשך בחזרה למגזר perfused; זה קובע את לחץ האיזון שבו התאים האדומים בעדינות להתנדנד בלומן הכלי ומודד את הלחץ ההידרוסטטי כלי-דם קטנים (P ג) בקצה הדיסטלי של מגזר כלי-דם קטנים. לשמור זלוף כלי בכל הלחצים מעל לחץ איזון זה. </li></ol> 7. Microocclusion ואיסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לפני השימוש במייקרו-occluder לחסום את הכלי, לחץ עליו לתוך הרקמה באזור בשימוש שאינו של לפדר רחוק מכל כלי, כך שהקצה מצטבר כרית קנס של רקמה שמגנה על הכלי הניסיוני במהלך מייקר חזר חסימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החוסם מעל כלי perfused ליד הקצה התחתון של שדה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הבא עם וידאו ואודיו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילולי להקליט את מיקומו של האתר ולחסום קצה המסך נמוך יותר כפי שניתן לראות בreticle העינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טיפשל החוסם ממוקם בדיוק מעל כלי-דם קטנים, להשתמש בשליטת z הקנס של micromanipulator להוריד בעדינות את החוסם עד הזרימה בכלי הוא יחסום. שים לב ללחץ מד הלחץ (P ג) באודיו. החל חסימה בדרך כלל עבור 3-10 שניות, ולאחר מכן שחרר, שחזור זלוף החופשי. הזז את האתר לחסום את כלי לעבר קצה פיפטה ב5-10 מיקרומטר צעדים המבוססים על זמן (&gt; 5 דקות אחרי בלוק ראשוני באתר), מספר החסימות (3-5), כדי למנוע נזק קיר כלי באתר הבלוק . </li></ol></li></ol> 8. ניתוח של נתונים ומדידה של p L (חדירות מים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הפעלת וידאו, לקבוע את המרחק הראשוני (ℓ 0) מתא אדום סמן לאתר החסימה על ידי שימוש בתמונה של מיקרומטר במה והעמדות הידועות על התמונות. לקבוע את המהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של תא הסמן מתפקידו בכמה מסגרות בשנייה 3-10 של תמונות שתועדו. להרתיעשלי רדיוס הכלי (r) מהתמונות שצולמו במהלך חסימה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב J נ / S עבור כל חסימה כ× (dℓ / DT) (1 / ℓ 0) × (R / 2). חישוב p L בלחץ מתמיד כ( v J / S) מחולק בלחץ הנהיגה (לחץ כלי-דם קטנים - לחץ האוסמוטי קולואיד יעיל; ראה דיון). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרטים של חישובי p L. למרות שתנועת נוזל transvascular מתרחשת בזמן שהספינה היא perfused בחופשיות, משא ומתן כזה הוא קטן מכדי להימדד בזלוף החופשי משום שהוא בדרך כלל פחות מ 0.01% משיעור זלוף הכלי. עם זאת, כאשר זלוף הוא נעצר על ידי הגורם לחסימה זמני כלי-דם קטנים, זרימת transvascular (...

Microperfusion בכלי הדם כרוך בהקמה מבוקרת זרימה של perfusate המלאכותי של הרכב ידוע באמצעות micropipette בכלי דם בדרך כלל פחות מ -40 מיקרומטר קוטר. כלי perfused נשאר בסביבת הרקמות הנורמלית שלה, והוא perfused עם הדם של החיה עד למועד cannulation. הפועל בשיתוף עם מגוון רחב של הדמיה וידאו או טכניקות fluorometric, בmicroperfusion האתר מאפשר מדידה של מים זורמים ומומס פני קירות microvessels בתנאים בהם הכוחות המניעים לזרמים אלה ידועים ותכונות החדירות של כלי דם הקיר יכולות להיות העריך באופן ישיר. יתר על כן, על ידי שליטה על הרכב הנוזלים המקיפים את כלי-דם קטנים ברקמות (perfusate וsuperfusate), הרגולציה של חדירות כלי-דם קטנים ובשערי חליפין יכולה להיחקר על ידי הפעלת תאי האנדותל המרכיבים את קיר כלי-דם קטנים להיחשף למגוון רחב של דוארתנאי xperimental (אגוניסטים, תנאי זלוף שונה, אינדיקטורים ניאון כדי למדוד את הרכב תאיים ואיתות) לתקופות שנמדדו בדיוק זמן (שניות לשעה). בנוסף, הערכות ultrastructural או cytochemical של מבנים מולקולריים תאיים מפתח המסדירים את המחסום יכולות להיחקר באותו microvessels בי חדירות נמדדות ישירות. הגישה ובכך יוצרת גשר בין החקירה של המנגנונים התאיים ומולקולריים לשנות תפקוד מחסום אנדותל בתרבית monolayers אנדותל תא והחקירה בmicrovessels שלמה. ראה את הביקורות להערכה נוספת 1-6 הבאה. הגבלה של microperfusion היא שניתן להשתמש בו רק במיטות כלי דם, כי הם דקים, שקופים ויש לי שלמות מבנית מספיק כדי לאפשר cannulation עם micropipette זכוכית. בעוד חקירות מוקדמות משמשות microvessels צפרדע בלפדר ומטר אנגינה עורית דקuscle 7,8, בהרבה ההכנה הנפוצה ביותר במודלים של יונקים היא לפדר עכברוש 9-15. רוב החקירות התמקדו בשינויים חריפים בחדירות כלי דם למדו על פני תקופות של 1-4 שעות, אבל יותר חקירות האחרונות הורחבו למדידות על כלי פרט 24-72 שעות לאחר זלוף ראשוני 12,16. הטכנולוגיה שפותחה לאחרונה CRISPR, אשר מבטיחה להפוך את המודלים של עכברים מהונדסים גנטי יותר זמינים ללימוד תקנת חדירות כלי דם 17 צריכים לאפשר השיטות שתוארו בתקשורת זה להיות מיושמת בmicrovessels venular של לפדר במודלים של העכברים חדשים החשובים אלה. השיטה דורשת מיקרוסקופ הפוך מצוידים בבמת מיקרוסקופ נבנה מותאם אישית גדולה מספיק כדי להכיל שתי הכנת בעלי החיים ולפחות שלוש micromanipulators משמשת לmicrotools העמדה קרוב לכלי perfused וליישר micropipette זלוף עם הכלילומן. לדוגמא פלטפורמה מותאמת אישית לבמת מיקרוסקופ XY (כ -90 × 60 סנטימטרים) יכולה להיות מפוברקת מפלדה בעובי 1 סנטימטר עם ציפוי חלודה הוכחה. השלב מחובר לשולחן מדד הנדסה או שתי שקופיות יונה-זנב רכובים בזוויות ישרות ונתמכות על עמודי טפלון או העברות כדור לתנועה במישור האופקי. אסדה טיפוסית (ראה איור 2) יש הרבה מן המשותף עם ציוד מיקרוסקופ וmicropositioning משמש למגוון רחב של ניסויי זרימת דם intravital כגון אלה כדי למדוד את זרימת דם חד כלי והמטוקריט, אספקת חמצן מקומית על ידי microvessels דם perfused, רגולציה של חלק בכלי דם טונוס שרירים, והצטברות כלי הדם המקומית של קליעים נותבים ניאון הוזרקו לכל מחזור. 18-26 ההיבט הבסיסי של הטכניקה הוא המדידה של נפח זרימה (J v) על פני שטח מוגדר שטח (S) של קיר כלי-דם קטנים. כדי להשיגזה באמצעות הטכניקה לנדיס שונה שתוארה במסמך זה מיקרוסקופ ההפוך פשוט הוא נאות. מצלמת וידאו קטנה היא רכובה על נמל התמונה ואות וידאו, עם בסיס זמן הוסיף, מוצג על צג וידאו ונרשם גם בצורה דיגיטלית במחשב או כאות דיגיטלית או אנלוגי במצלמת וידאו. ברגע שהכלי-הדם הקטן הוא cannulated החלק מהכלי-הדם הקטן הגלוי למצלמה ניתן לשנות על ידי הזזת הבמה ומניפולטורים כיחידה מבלי לשבש את cannulation. מדידה של תזרימי transvascular יכולה גם להיות משולבת עם חקירות מפורטות יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוחכם עם מסננים מתאימים כגון אסדות המשמשות למדידות של חדירות מומסות, ניטור יחס ניאון של סידן cytoplasmic או מנגנונים תאיים אחרים, והדמיה confocal 6,12,13, 27. יתרון עיקרי של כל גישות microperfusion הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות, על אותו הכלי, תחת שינוי מבוקר של כוח מניע כגון לחצים ההידרוסטטי וoncotic, או שינוי מושרה בתגובות כלי למצבים דלקתיים. העיצוב הנפוץ ביותר הוא השוואה לזווג של מוליכות הידראוליות נמדדו (עמ &#39;יב) באותו כלי עם הכלי perfused הראשון באמצעות micropipette מלא perfusate שליטה והשעית התא האדום להקמת מדינת חדירות תחילת המחקר, ולאחר מכן עם טפטפת שני עם סוכן מבחן נוסף לperfusate. cannulations מרובה אפשרי עם המחזור חזר לאחר reperfusion עם פיפטה השליטה. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את cannulation וmicroperfusion של כלי venular בלפדר עכברוש להקליט והנתיבים מים על פני קיר כלי-דם קטנים ולמדוד את p L של קיר הכלי, מדד שימושי של החדירות של המסלול המשותף למים ומומסים פני שלם מחסום אנדותל. ההליך נקרא techniq נדיס שונהUE כי העיקרון המקורי לנדיס של שימוש בתנועה היחסית של תאים אדומים כמדד להחלפת נוזל transvascular לאחר זלוף חסום נשמרה 28, אבל מגוון של תנאי ניסוי (למשל, הבדלים בלחץ ההידרוסטטי oncotic ואלבומין פני קיר כלי-דם קטנים) זמין לאחר microperfusion הוא הרבה יותר גדול מאשר בmicrovessels דם perfused uncannulated 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>narrow diameter, long working distance objective: example</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&amp;times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td><td>welding shop</td><td></td><td>this should be heavy to reduce vibration</td></tr><tr><td>Unislide x-y table: dove tail slides</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD video camera: example</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (no longer available)</td><td>no color needed</td></tr><tr><td>video capture system with audio--generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small microphone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (no longer available)</td><td></td><td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td></tr><tr><td>hydraulic probe drive, one way</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>need to buy either manual drive or electronic drive</td></tr><tr><td>manual drum drive&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>or hydraulic drive, 3 way</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td><td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td></tr><tr><td>connectors/rods/holders</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>pin vise</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>to hold restrainer</td></tr><tr><td>pipette holder</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>water manometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE TRAY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&amp;nbsp;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td></tr><tr><td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medical adhesive for tissue well</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&quot; L x 2&quot; W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td></tr><tr><td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vertical pipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 with nichrome filament</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td><td></td><td></td><td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; with ceramic sharpening disc</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>use &quot;as is&quot; or attach lapping film</td></tr><tr><td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td><td>3M</td><td>part no. 051144 80827</td><td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

ניסויים כדי למדוד את תכונות חדירות של microvessels perfused בנפרד מספקים גשר בין החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים המסדירים חדירות כלי דם בmonolayers תרבית התא אנדותל ומאפייני תמורה הפונקציונליות של מיטות כלי דם שלמות. שיטה לcannulate וינקב microvessels venular של לפדר עכברוש ולמדוד את המוליכות הידראוליות של קיר microvessel מתוארת. הציוד העיקרי הדרוש כולל מיקרוסקופ intravital עם במה גדולה שונה, התומכת micromanipulators למצב את שלוש microtools שונה: (1) micropipette זכוכית משופעת לcannulate וינקב כלי-דם קטנים; (2) מיקרו-occluder זכוכית לחסום זמנית זלוף ולאפשר מדידה של זרימת מים בתנועת transvascular לחץ ההידרוסטטי נמדד, ו- (3) מוט זכוכית בוטה כדי לייצב את רקמות mesenteric באתר של cannulation. Techniq מיקרו-החסימה שונה לנדיסUE משתמש בתאים אדומים התלויים בperfusate המלאכותי כסמנים של תנועת נוזל transvascular, וגם מאפשר מדידות חוזרות ונשנות של זרמים אלה תנאי ניסוי כמשתנים והבדל לחץ האוסמוטי ההידרוסטטי וקולואיד פני microvessels נשלטות בזהירות. מדידות של מוליכות הידראוליות באמצעות ראשון perfusate שליטה, אז אחרי מחדש cannulation של אותו כלי-דם קטנים עם perfusates הבדיקה מאפשרות לזווג השוואות של תגובת microvessel בתנאים מבוקרים היטב אלה. ניסיונות להאריך את השיטה לmicrovessels בלפדר של עכברים עם שינויים גנטיים צפויים לשנות חדירות כלי דם היו מוגבלים בגלל היעדר microvessels ישר וunbranched הארוך בלפדר עכבר, אבל הזמינות האחרונה של החולדות עם שינויים גנטיים דומים באמצעות הטכנולוגיה / Cas9 CRISPR צפויה לפתוח אזורים חדשים של חקירה שבו ניתן ליישם השיטות שתוארו במסמך זה. </p&gt;

איור 4 מראה את התוצאות מהמדידה במהלך השינויים בעמ L הזמן בחולדת venular microvessel cannulated ברציפות עם ארבע perfusates. 33 עמ &#39;גודל L מחושב בלחץ מתמיד שימש כמדד לשינויים בקיר חדירות כלי-דם קטנים, ראשון במדינה עם שליטת perfusate המכיל 1% אלבומין בסרום שור לאחר מכן ...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Developmental Biology

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medicine

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Immunology and Infection

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

<meta charset="utf8"></head><body>תפקיד PAR1 אנדותלי בהידבקות לויקוציטים והיווצרות רשת במהלך פגיעת I/R

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric vessels, leading to both local and systemic pathologies with a poor prognosis. Both ischemia and reperfusion trigger a series of cellular and molecular responses, with inflammatory cells serving as key regulators of the pathology. These interactions with the ischemic endothelium are mediated by multiple adhesion receptors. Several animal models have been established to mimic this pathology and investigate the involved molecular pathways. In this study, a microsurgical model of I/R injury is combined with intravital microscopy to visualize leukocyte rolling, adhesion, and neutrophil extracellular trap (NET) formation. This model is applied to transgenic mice deficient in endothelial PAR1 (F2r) to assess the impact of PAR1 on leukocyte rolling and NET formation 1 h after ischemia and immediately following reperfusion. In vivo, Acridine Orange leukocyte staining was employed, and NETs were visualized using a nucleic acid stain. Interestingly, reduced leukocyte adhesion and NET formation were observed in mice lacking the endothelial PAR1 receptor. This model enables the in vivo analysis of key regulators involved in I/R injury.

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים בוורידים מזנטריים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני

This protocol presents a method for inducing mesenteric ischemia-reperfusion injury and visualizing neutrophil extracellular traps (NETs) in mesenteric venules using intravital microscopy. Blood flow in the superior mesenteric artery was restricted for 1 h, followed by reperfusion, allowing direct quantification of leukocyte adhesion and NETosis.

הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים בוורידים מזנטריים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...