עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות המענקים HL44485 וHL28607.

הצהרת אתיקה: כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. 1. ייצור ראשוני של Micropipettes, Restrainers, וחוסמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה צינורות נימי הזכוכית בורוסיליקט נקיים במחצית באמצעות חולץ אלקטרוני מותאם כך, כאשר משכו, החלק המתוח של הצינור הוא כ 1 ס&quot;מ האורך ושני חצאים הם סימטריים במידה מסוימת. ודא שלהתחדד עולה בקנה אחד עם הממדים באיור 1. השתמש בשני חצאים לmicropipettes, restrainers וחוסמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוע micropipettes באמצעות גלגל שחיקה אוויר מונע 30 עם 0.5 מיקרומטר נייר מחוספס רחץ במים. הגדר את הזווית של בעל micropipette כך שזה בערך 30 מעלות מאופקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף ולייבש את micropipettes באמצעות יניקה למשוך אצטון הנקי באמצעות הקצה ועד הפיר. בדוק את micropipettes (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ זקוף קטן עם 4 × 40 × מטרות מצוידות בבעל micropipette קליפ התנין וreticle עינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipettes בחר עם פתיחת טיפ כ -50 מיקרומטר ארוכים עם שיפוע שאורכו / רוחב יחס הוא בין 3.1 ו -3.5 ועם נקודה בחדות מחודדת אשר מסייעת לחדור את סיבי הקולגן הקשים בלפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן 15-20 micropipettes בגדלים שונים מעט בתיבה נטולת אבק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך restrainers באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימי זכוכית משך זמן קצר ליד microflame כדי ליצור קצה קהה (איור 1). אחסן כמה בקופסא ללא אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך microoccluders באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימים משך תחת microflame ועדינות לכופף (באמצעות מתאם צינור, למשל., 23G) טיפ הנאה (כ 4 מ&quot;מ מקצה) כדי להפוך את הזווית של קרוב ל 120 מעלות לפיר ( <sטרונג&gt; איור 1 ג). הפוך ולאחסן כמה. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זכר (350-450 גר &#39;) או Sprague-Dawley חולדות נקבות (200-300 גרם) עם נתרן pentobarbital (80-100 מ&quot;ג / קילוגרם, סיגמא אולדריץ, P3761) באמצעות הזרקה תת עורית; להגן לפדר על ידי לא באמצעות זריקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוניים, לשמור על הרדמה על ידי זריקות משלימות (30 מ&quot;ג / קילוגרם) לפי צורך. לקבוע עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן או קרני. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, להרדים את העכברוש באמצעות מנת יתר של pentobarbital או הזרקה תוך לב של אשלגן כלורי רווי בהרדמה. </li></ol> 3. להכין פתרונות ואריתרוציטים לשימוש כסמני זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של רינגר היונקים לsuperfusate ופתרון perfusate השליטה (בדרך כלל הפתרון של רינגר המכיל 10 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת שומן יונקיםאלבומין החופשי שור בסרום, BSA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> perfusate סינון באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים זעירים שעלולה לחסום את קצה micropipette; לסנן לתוך מיכל נקי קטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אריתרוציטים על ידי ציור על 0.2 מיליליטר דם מוריד הזנב של העכברוש הרדים למחט 20G במזרק קטן המכיל 0.05 מיליליטר הפרין (1000 U / ml) ולהעביר לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות המכיל כ -14 פתרון של רינגר יונקים מ&quot;ל פתרון . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לארוז בעדינות תאים אדומים (כ 200 גרם × מקסימום 7 דקות). לצייר את supernatant מחדש להשעות את התאים האדומים בפתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה והסרת שלוש פעמים supernatant לעזוב את התאים אדומים ארוזים בחלק התחתון של הצינור לשימוש מאוחר יותר. שים לב שהליך זה מפחית טסיות perfusates הסופי פחות מ -0.1% מרמות נורמליות 31. </li></ol></li></ol> 4. מסדרים את רקמות בבעלי החייםמגש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן של החולדה הרדים ממתחת לטבור לתהליך xiphoid. ודא שהאזור המגולח משתרע סביב הצד הימני (לעכברוש הניח בצד ימין), כך ששיער אינו מהווה פתיל לצייר superfusate מתוך הרקמה היטב. להסיר שערות חתך עם תחבושת רטובה או רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את העור עם מלקחיים משוננים בוטים ולעשות חתך מרכז-קו (ארוך 2-3 סנטימטר) דרך העור באמצעות מספריים חסון. באמצעות קנס מספריים (איריס) לעשות חתך דומה באמצעות alba Linea, הרמת דופן הבטן עם מלקחיים משוננים כדי למנוע נזק למעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם בעלי החיים בצד השני שלה על המגש של בעלי החיים, משוך בעדינות את הבטן מחלל הבטן באמצעות החלת כותנה שקצה (עץ מקל) ספוגה בתמיסת רינגר ומלקחיים משוננים בוטים. מסדרים את הבטן ברקמה כל כך טוב שלפדרו מונח על העמוד לצפייה מבעד למיקרוסקופ לטפל כדי למנוע נגיעה לפדר (potentially נזק microvessels) עם או מלקחיים או כותנה. הערה: מגש בעלי החיים (איור 2 א) ניתן לבנות מפלסטיק ודורשת רקמות היטב (למשל, קוורץ המלוטש בערך 2 סנטימטרים קוטר 5 מ&quot;מ וגבוה.) (כ -3 מ&quot;מ עמוק), עמוד ברור אופטי, וכרית חימום הותאם כדי לשמור על הטמפרטורה של בעל החיים. העובי של העמוד לא יעלה על מרחק העבודה של המטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את מגש בעלי החיים על הבמה מיקרוסקופ כדי שלפדר גלוי דרך העיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם קו טפטוף כובד-הפד Superfuse לפדר עם הפתרון של רינגר היונקים שמרו על 35-37 מעלות צלזיוס ברציפות. השתמש פדה גזה להחזיק הבטן במקום, לעזור לשמור על לחות, ופתיל הפתרון של רינגר העודף מעל פני השטח. התאם את הזרימה ולשאוב את השפכים כדי לשמור על עובי superfusate עקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות microvessels venular היעד, שהםמגזרי unbranched במורד הזרם של זרימה מתכנס, ענפים אחד או שניים דיסטלי לנימים האמיתיות. מצא את כלי unbranched (באופן אידיאלי, 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך) שיש זרימת דם מהירה וחופשית של תאים לבנים דבק על קיר הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את כלי-דם קטנים מבחן במרכז שדה מיקרוסקופ ולעבור עוצר לעמדה בסמוך לאתר cannulation בחר. </li></ol> 5. מילוי micropipette והר במחזיק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני cannulating, להשעות את התאים האדומים בperfusate. להוסיף 7 μl של תאים אדומים ארוזים 0.5 מיליליטר perfusate במבחנה ורוסיליקט נקייה. הערה: Hematocrits של 1-3% יכול לשמש, אבל המטוקריט עקבי יביא לריכוזי perfusate עקביים של כל חומרים שוחררו מהתאים האדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים מזרק 1 מיליליטר עם מתאם צינור 23G וצינורות PE 50 (אורך סנטימטר 5-15). צייר את תערובת perfusate / אדום התא לתוך המזרק. הפוך מזרק לערבב ולגרש את כל הבועות מצינורות ומתאם. להתייעלות, צינורות לנכון כמה מזרקים לפני תחילת הניסוי ולשמור אותם בקופסא ללא אבק או שקית ניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipette על ידי קידום צינורות לתוך הסוף הגדול של micropipette עד שנוגע באזור המחודד. החל לדחוף מהיר עדין על בוכנת המזרק כדי למלא את קצה micropipette. הערה: זרם או טיפה זעיר צריך להיות גלוי בקצה לראיות מילוי מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך את צינורות תוך דחיפה קלה על הבוכנה כדי למלא את החלק הרחב יותר של פיר micropipette. הסר בועות קטנות בפיר הרחב על ידי מצליף פיר micropipette בזהירות. הערה: הליך דומה כבר מאויר 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את micropipette לבעל פיפטה עם יציאת צד המאפשר חיבור רציף לנוזל מד לחץ מים. ודא שבעל, שמצורף לדיסק הידראולי משמש לשליטה קידום יפה מאוד של micropipette, הוא בזווית קלה (15-25 מעלות)לאופקי כך שהקצה של להתחדד micropipette לא פגע בבטן או מגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הכונן ההידראולי על micromanipulator ניד, שבו יש x, y, z וכוננים כדי לאפשר קרוב יישור לכלי בדיקה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הלחץ ההידרוסטטי להחיל את הנוזל בmicropipette באמצעות מזרק או הנורה גומי מלא מים כדי לשנות את גובה נוזל בעמודת המים של מד הלחץ לכ -40 CMH 2 O מעל לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate כלי-דם קטנים בהקדם האפשרי לאחר מילוי פיפטה; תאים אדומים ליישב לתחתית של פיפטה, כך שלאחר כ -40 דקות מעט מאוד תאים אדומים יזרמו לתוך הכלי. </li></ol> 6. מדידת לחץ Microcannulation וכלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מיצוב micropipette המלא תחת מיקרוסקופ, לחץ בעדינות על עוצר את הרקמה ליד כלי-דם קטנים הפעלת כוח מספיק כדי אחיזת הרקמה. צייר אתעוצר בחזרה, מעט מתיחת הרקמה בקנה אחד עם כלי-דם קטנים, כך שהלחצים בסיבי קולגן mesenteric מיושרים עם הכלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את micropipette עם הכלי ולהוריד אותו לעין דרך העיני. הנח את הקצה רק במעלה הזרם של אתר cannulation נבחר ומוריד אותה אל הרקמה, כך שהוא חוסם באופן חלקי זרימה בתוך הכלי, אבל לא לחסום אותו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate הכלי על ידי הנהיגה קצה פיפטה לאט לתוך לום הכלי באמצעות הכונן ההידראולי. היזהר שלא לדחוף דרך הצד התחתון של כלי השיט. הערה: כmicropipette נכנס ללום, perfusate מהירות שוטף את הדם בכלי מחוץ ללום וperfusate חופשיות זורם לתוך דיסטלי מחזור של בעלי החיים לכלי-הדם הקטן מבחן, עקירת חלק מזלוף הדם הנורמלי בכלי מורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את לחץ זלוף על ידי התאמת מד הלחץ עד הדם (כפי שמצויןעל ידי התאים האדומים של בעלי החיים) נמשך בחזרה למגזר perfused; זה קובע את לחץ האיזון שבו התאים האדומים בעדינות להתנדנד בלומן הכלי ומודד את הלחץ ההידרוסטטי כלי-דם קטנים (P ג) בקצה הדיסטלי של מגזר כלי-דם קטנים. לשמור זלוף כלי בכל הלחצים מעל לחץ איזון זה. </li></ol> 7. Microocclusion ואיסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לפני השימוש במייקרו-occluder לחסום את הכלי, לחץ עליו לתוך הרקמה באזור בשימוש שאינו של לפדר רחוק מכל כלי, כך שהקצה מצטבר כרית קנס של רקמה שמגנה על הכלי הניסיוני במהלך מייקר חזר חסימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החוסם מעל כלי perfused ליד הקצה התחתון של שדה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הבא עם וידאו ואודיו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילולי להקליט את מיקומו של האתר ולחסום קצה המסך נמוך יותר כפי שניתן לראות בreticle העינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טיפשל החוסם ממוקם בדיוק מעל כלי-דם קטנים, להשתמש בשליטת z הקנס של micromanipulator להוריד בעדינות את החוסם עד הזרימה בכלי הוא יחסום. שים לב ללחץ מד הלחץ (P ג) באודיו. החל חסימה בדרך כלל עבור 3-10 שניות, ולאחר מכן שחרר, שחזור זלוף החופשי. הזז את האתר לחסום את כלי לעבר קצה פיפטה ב5-10 מיקרומטר צעדים המבוססים על זמן (&gt; 5 דקות אחרי בלוק ראשוני באתר), מספר החסימות (3-5), כדי למנוע נזק קיר כלי באתר הבלוק . </li></ol></li></ol> 8. ניתוח של נתונים ומדידה של p L (חדירות מים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הפעלת וידאו, לקבוע את המרחק הראשוני (ℓ 0) מתא אדום סמן לאתר החסימה על ידי שימוש בתמונה של מיקרומטר במה והעמדות הידועות על התמונות. לקבוע את המהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של תא הסמן מתפקידו בכמה מסגרות בשנייה 3-10 של תמונות שתועדו. להרתיעשלי רדיוס הכלי (r) מהתמונות שצולמו במהלך חסימה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב J נ / S עבור כל חסימה כ× (dℓ / DT) (1 / ℓ 0) × (R / 2). חישוב p L בלחץ מתמיד כ( v J / S) מחולק בלחץ הנהיגה (לחץ כלי-דם קטנים - לחץ האוסמוטי קולואיד יעיל; ראה דיון). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרטים של חישובי p L. למרות שתנועת נוזל transvascular מתרחשת בזמן שהספינה היא perfused בחופשיות, משא ומתן כזה הוא קטן מכדי להימדד בזלוף החופשי משום שהוא בדרך כלל פחות מ 0.01% משיעור זלוף הכלי. עם זאת, כאשר זלוף הוא נעצר על ידי הגורם לחסימה זמני כלי-דם קטנים, זרימת transvascular (כלומר, סינון) נמדד מהתנועה של תאים אדומים סמן בלומן כטור של נוזל בין תאים אדומים סמן והאתר של חסימה מקצר כפי שמוצג ב איור 3. בהתאם למורכבות ואורכו של פרוטוקול ניסוי כלי unbranched נדרש 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך. כאשר הכלי לא יחסום ולחץ מד הלחץ הוא נוהג זרימה דרך כלי-דם קטנים, הירידה בלחץ על פני קצה פיפטה היא גדולה כל כך שלחץ כלי-דם קטנים בזלוף החופשי הוא בדרך כלל רקכמה CMH 2 0 מעל הלחץ במורד הזרם. לעומת זאת, במהלך חסימת הירידה בלחץ על פני פיפטה היא קטנה מאוד בשל נוזל שנכנס לאט לומן הכלי להחלפת סינון נוזלים מעבר לקיר הכלי. כך במהלך חסימת הלחץ ההידרוסטטי בלומן הכלי (P ג) שווה סט שעל ידי מד הלחץ. לחץ oncotic ברקמת mesenteric הוא זניח, ולכן מייד לאחר חסימה, תנועות נוזל transvascular מתאי סמן אדום נמדדות בי הלחץ ההידרוסטטי ידועה ולחץ oncotic בלומן הכלי שווה לזה שנקבע בperfusate. עם מדידות רצופות של p L, אורך כלי הולך לאיבוד בכל פעם שאתר הבלוק מתקדמת. בנוסף, recannulation רצוף מפחית אורך כלי זמין. זרימת נוזל transvascular ליחידת שטח של קיר כלי (v J / S) מוערכת מהשיעור שאורך מדוד של עמודת מים בmicrovלומן Essel בין תא אדום סמן ואתר החסימה או מקצר (סינון נטו) או מתארך (ספיגה נטו). ההנחה היא שהתאים אדומים ניטראלי קלילים נעו לאורך האמצע של לומן הכלי ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ממוצע המהירות של עמודת המים המקיפה את התא (היחס של מהירות תא אדומה לאומרת מהירות מים קרוב ל -1.8 למיקרומטר 6 תא אדום בכלי 30 מיקרומטר קוטר). 8,14 לכן, אם המהירות של תא סמן (במיקרומטר / sec) לקראת החוסם היא מיקרומטר / sec V במהלך 2-5 שניות הראשונות לאחר חסימה, ואת רדיוס הכלי הוא r, נפח הנוזל המסונן על פני קיר כלי-דם קטנים בין שהתא אדום והאתר של החסימה (v J) הוא πr 2 V מיקרומטר 3 / sec בהנחת כלי-דם קטנים הוא גלילי. נוסף על השטח של כלי-דם קטנים גלילי (S) בין שתא הסמן ואתר החסימה הוא 2πrℓ, בי ℓ הוא המרחק הראשוני בין תא הסמןואתר החסימה. כך הזרימה הממוצעת הראשונית transvascular ליחידת שטח (J v / S) בלחץ שנקבע על ידי מד לחץ המים Vr / (2ℓ). ההערכה הפשוטה של p L הכלי נעשתה אם לחץ oncotic של perfusate נקבע נמוך יחסית ללחץ הדם הקטן (בדרך כלל 3.6 CMH 2 O, לחץ oncotic של אלבומין בסרום שור בריכוז של 10 מ&quot;ג / מיליליטר ונימים לחץ גדול יותר מאשר 30 CMH 2 O). p L מחושב כ( v J / S) / H (P ג -3) סנטימטר / sec / 2 סנטימטר O כי ההשתקפות מקדם אלבומין (σ אלבומין) במדינת השליטה הוא קרוב ל -0.9. עם שינויים מהירים בגישה זו בעמ &#39;L עם רזולוציה של סדר 1 דקות זמן ניתן למדוד על ידי הקמת זרימה חופשית בין צעדים הרצופים של J נ / S בלחץ קבוע, כפי שמוצג בתוצאות הנציג באיור 4. IG הגישה מעלnores שינויים קטנים בלחץ oncotic של אלבומין אשר נופלים על פחות מ 1 CMH 2 O כאשר ההשתקפות מקדם נופל מתחת 0.5, אבל הטעות בהערכה של p L נשארה פחות מ -5%, כאשר P c הוא גדול יותר מ -30 CMH 2 O . כאשר מדידה מדויקת של שני מקדם p L וההשתקפות נדרש, J נ / S נמדד בסדרה של לחצי כלי-דם קטנים מתחת ללחץ oncotic היעיל הצפוי של מקרומולקולה המבחן. השיפוע של הקשר בין J נ / p L S ואמצעי לחץ וליירט על ציר לחץ כאשר זרימה נטו הוא σπ אמצעי אפס (איור 5). ההפגנה שהנצחון של מי קשור באופן ליניארי ללחץ היא גם אימות חשובה של השימוש במדידות לחץ יחידים באמצעות הפרוטוקול הפשוט שתואר לעיל (איור 4) כאשר הבדל לחץ oncotic נמוך יחסית לעיתונות ההידרוסטטייור. מקורות אפשריים של שגיאה. יש כמה בעיות שתתפשרנה מדידה מדויקת. כישלון כדי לחסום כראוי את הכלי או נזק לדופן כלי הדם בתוצאות אתר חסימה בדליפת נוזל עבר אתר החסימה, ותנועה של תאי סמן לכיוון אתר החסימה מהר יותר כי בשל חילופי transvascular. ואילו תאי סמן בדרך כלל לנוע באיטיות לכיוון אתר החסימה, אבל לא להגיע אליו, דליפה מצויינים אם תאי סמן לעקוב אחר כל הדרך לoccluder. מצד שני, אי לאטום את פיפטה לתוך לום כלי-דם קטנים באתר cannulation תוצאות בהערכה נמוכה מדי של J נ / S. דליפת נוזל מפיפטה superfusate או ללומן הכלי במעלה הזרם של אתר cannulation גורמת לירידת לחץ משמעותית על פני קצה פיפטה. כגון דליפה מזוהה כאשר תאים בזרימת קצה micropipette במהירות גבוהה יותר מאלו בlu הכלי במורד הזרםגברים של כלי השיט החסום. מיצוב מחדש זהיר של micropipette בדרך כלל חותם נזילה כזו. נושא אחר שעולה אם p L של קיר הכלי אינו אחיד, בדרך כלל שיש עם אתר אחד או יותר של נזק או דלקת מקומיות. תאי מרקר לעקוב אחר לאתר אם רוב זרימת transvascular מרוכזת שם. תנועת תא אדומה עדיין מודדת זרימת transvascular, אבל v J המדד / S הוא לא נציג של רוב קיר האזור בתוך מגזר המבחן. משמעות של השיטה ביחס לשיטות קיימות. שתי שיטות הנפוצות ביותר לחקור את הרגולציה של חדירות מחסום אנדותל ותמורת transvascular הם (1) במבחנה מדידה של תמורה פני monolayers תא האנדותל בתרבית ו( 2) מדידת ההצטברות נותב ב דגימת רקמה לאחר נותב מוזרקת לוריד לכל בעלי החיים. ניסויים בmonolayers תא אנדותל בתרבית favored כי התפקודים התאיים יכולים להיות שונה באופן ישיר יותר ויש חומר מספיק סלולארי זמין להערכה מפורטת של אירועים מולקולריים בתאי האנדותל. עם זאת ברוב תנאי תרבות תאי האנדותל בדרך כלל לא מהווים את נציג המחסום של חדירות כלי דם בגוף חי. הטכניקה לנדיס שונה שתוארה לעיל הוכחה להיות טכניקה חזקה ואמינה כדי לחקור את הרגולציה של תפקוד מחסום אנדותל בmicrovessels venular שלמה. בידיו של חוקר מנוסה לזווג מדידות של חדירות בתנאי בקרה ובדיקה שבו חלק מהגישות משמשות בתרבית תאים (לדוגמא, הדמיה של מרכיבים תאיים, שינוי של מסלולי איתות) יכול להיות מיושמת. החשיבות של ניסויים בmicrovessels שלמה הודגמה על ידי הצגת הבדלים משמעותיים בין המנגנונים המווסתים את חדירות מחסום בmicrove perfused בנפרדssels ואלה לעתים קרובות מתוארים בmonolayers אנדותל בתרבית. דוגמאות כוללות תגובות לגזירה, חשיפת תרומבין, ותרומה של מנגנוני התכווצות להיווצרות פער דלקתי 2-6,9,16. מדידות של הצטברות נותב במיטת כלי דם שלמה משמרת פונקציה יותר נורמלית פיזיולוגית אבל חקירה ישירה של שינויים אמיתיים בחדירות כלי דם נמצאים בסכנה בגלל הצטברות נותב עשויה להגדיל כתוצאה מטפטוף מוגבר (הגדלת שטח פנים לחליפין) עם או בלי עלייה ב חדירות של הקיר. כך המידה של עליית חדירות ניתן להפריז בחשיבותו כאשר התרחבות מגדילה את מספר כלי perfused ובכך סך צבירה מומסת היא גדולה יותר מזה בשל עלייה בחדירות כלי דם לבד 34. יישומים עתידיים. המגוון הרחב של אפשרויות לשנות מבנה ותפקוד תאיים באותם תנאים כמו חדירות של הזמנה אישיתכלי vidual הוא ישירות נמדדו במהלך microperfusion צפוי להגדיל. יתר על כן צפוי כי היישום של השיטות בלפדר עכברוש מהונדס גנטי עשוי לפתור בעיה לטווח ארוך שקיימת כבר עכברים מהונדסים גנטי. באופן ספציפי, כאשר עכברים מהונדסים גנטי הפכו זמינים זה היה צפוי שmicroperfusion ניתן יהיה להרחיב לחקור microvessels בכלי mesenteric. בעוד כמה ניסויי microperfusion הושלמו בmicrovessels של לפדר עכבר 35, יש לי עכברים בדרך כלל פחות microvessels ברקמת mesenteric מאשר חולדות, והכלים האלה הם בדרך כלל קצרים ומסועפים מאוד, בניגוד ל(&gt; 500 מיקרומטר) כלי ישר יותר מתאימים יותר ש ניתן למצוא בחולדות. כך ניסויים לחקור האפנון של חילופי transvascular בגנטי עכברים יש לסמוך על מבחני כמו מיילס 34 או הניסויים נותב תובעניים מבחינה טכנית, אבל אמין יותר שמידהשינויים בשני כלי דם והצטברות extravascular של ניאון של בדיקות בדיקת radiolabelled 36. שינויים בשיטה. בפרוטוקולים לעיל, שינויים בהרכב perfusate נדרשו שינוי של micropipettes. גישה חלופית היא למלא micropipette באתר באמצעות מנגנון מילוי. הליך זה הושג כמתואר בפירוט 37. המגבלה היא שהזמן לשנות את ההרכב של perfusate בפיפטה הוא לא מהר כמו שהושג על ידי החלפת פיפטה, אבל ההליך הוא שימושי במיוחד אם יש צורך perfuse כלי-דם קטנים לפרקי זמן ארוכים. אותו microperfusion פנה ניתן להאריך למדוד מקדמי חדירות לכותרתו fluorescently מומס 31,38-40. במקרה זה micropipette קנה אחד מוחלף על ידי כפול (תטא) קנה פיפטה 41 והספינה היא perfusedלסירוגין עם מומס ניאון מבחן למדידה יחסי הצטברות רקמות ללומן תוכן, ואותו perfusate ללא מומס הניאון כדי לנקות את הרקמה ומאפשר מדידה חוזרת ונשנית של הצטברות מומסת. כאשר מדידות של מים זורם transvascular הן להיות בשילוב עם מדידות של מקדם חדירות מומס באמצעות מומסים מבחן שכותרתו fluorescently, אינדיקטורים ניאון של הרכב תאיים, או הדמיה confocal של מרכיבים תאיים, נדרש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוקר מחשב מתוחכם יותר. מאז חקירות אלה דורשים בדרך כלל עדשות עם הגדלה גבוהה יותר ומרחק עבודה קצר בהרבה, עמוד קוורץ משמש להחזיק את לפדר הוא הוחלף על ידי להחליק את מכסה זכוכית מודבקת לתמיכת פרספקס בתוך הרקמה היטב על מגש מיקרוסקופ. הזמינות המוגברת של מדפסות 3-D, תאפשר ייצור דיוק גבוה של מגשים מותאמים אישית, אשר עומדים בסובלנות הצרה נדרשה למצב את diamete הגדולעדשות r עם מרחק עבודה קצר יותר ביחס לmicrovessels נבחרה. הזמינות של microvessels שמישה בלפדר משתנה עם גיל, מין, ומתח. לכן, הבחירה של זן של עכברים והשימוש בזכר או נקבה יהיה תלוי בשאלות הספציפיות שפונים. עבור רבים מהמחקרים האחרונים שלנו השתמשנו חולדות זכרי Sprague-Dawley שהתאקלמו במתקן בעלי החיים שלנו בשבוע אחד לפחות לפני השימוש בסביבות גיל 3-4 חודשים שבזמן שאנו מוצאים שיש להם בדרך כלל זמינה microvessels הארוכה, ישר mesenteric. לעומת זאת, עמיתינו השתמשו בהצלחה Sprague-Dawley חולדות נקבות של 2-3 חודשים בגיל 13. התפקיד של התאים האדומים. התפקיד העיקרי של תאים אדומים כפי שתואר לעיל היה לעקוב אחר transvascular תנועת מים בהנחת התא פעל אינרטי כ, ניטראלי אינדיקטורים קלילים של מים זורמים לאחר microvessels הייתה אטומה. בנוסף לתפקיד בסיסי זה, זהעכשיו הוא הכיר בכך שהתאים האדומים תורמים ליציבותו של המכשול על ידי אספקת S1P לperfusate כאשר אלבומין בהווה 31,42,43. ישנן מספר השלכות חשובות של תצפיות אלה. בהיעדרם של תאים אדומים או עם השימוש בזרימת אינרטי סמנים חלופיים חדירות הבסיס עשויה להיות פחות יציב. מומלצת שהמדידות של S1P צריכים להיעשות בכל perfusates משמש בניסויי microperfusion.

Microperfusion בכלי הדם כרוך בהקמה מבוקרת זרימה של perfusate המלאכותי של הרכב ידוע באמצעות micropipette בכלי דם בדרך כלל פחות מ -40 מיקרומטר קוטר. כלי perfused נשאר בסביבת הרקמות הנורמלית שלה, והוא perfused עם הדם של החיה עד למועד cannulation. הפועל בשיתוף עם מגוון רחב של הדמיה וידאו או טכניקות fluorometric, בmicroperfusion האתר מאפשר מדידה של מים זורמים ומומס פני קירות microvessels בתנאים בהם הכוחות המניעים לזרמים אלה ידועים ותכונות החדירות של כלי דם הקיר יכולות להיות העריך באופן ישיר. יתר על כן, על ידי שליטה על הרכב הנוזלים המקיפים את כלי-דם קטנים ברקמות (perfusate וsuperfusate), הרגולציה של חדירות כלי-דם קטנים ובשערי חליפין יכולה להיחקר על ידי הפעלת תאי האנדותל המרכיבים את קיר כלי-דם קטנים להיחשף למגוון רחב של דוארתנאי xperimental (אגוניסטים, תנאי זלוף שונה, אינדיקטורים ניאון כדי למדוד את הרכב תאיים ואיתות) לתקופות שנמדדו בדיוק זמן (שניות לשעה). בנוסף, הערכות ultrastructural או cytochemical של מבנים מולקולריים תאיים מפתח המסדירים את המחסום יכולות להיחקר באותו microvessels בי חדירות נמדדות ישירות. הגישה ובכך יוצרת גשר בין החקירה של המנגנונים התאיים ומולקולריים לשנות תפקוד מחסום אנדותל בתרבית monolayers אנדותל תא והחקירה בmicrovessels שלמה. ראה את הביקורות להערכה נוספת 1-6 הבאה. הגבלה של microperfusion היא שניתן להשתמש בו רק במיטות כלי דם, כי הם דקים, שקופים ויש לי שלמות מבנית מספיק כדי לאפשר cannulation עם micropipette זכוכית. בעוד חקירות מוקדמות משמשות microvessels צפרדע בלפדר ומטר אנגינה עורית דקuscle 7,8, בהרבה ההכנה הנפוצה ביותר במודלים של יונקים היא לפדר עכברוש 9-15. רוב החקירות התמקדו בשינויים חריפים בחדירות כלי דם למדו על פני תקופות של 1-4 שעות, אבל יותר חקירות האחרונות הורחבו למדידות על כלי פרט 24-72 שעות לאחר זלוף ראשוני 12,16. הטכנולוגיה שפותחה לאחרונה CRISPR, אשר מבטיחה להפוך את המודלים של עכברים מהונדסים גנטי יותר זמינים ללימוד תקנת חדירות כלי דם 17 צריכים לאפשר השיטות שתוארו בתקשורת זה להיות מיושמת בmicrovessels venular של לפדר במודלים של העכברים חדשים החשובים אלה. השיטה דורשת מיקרוסקופ הפוך מצוידים בבמת מיקרוסקופ נבנה מותאם אישית גדולה מספיק כדי להכיל שתי הכנת בעלי החיים ולפחות שלוש micromanipulators משמשת לmicrotools העמדה קרוב לכלי perfused וליישר micropipette זלוף עם הכלילומן. לדוגמא פלטפורמה מותאמת אישית לבמת מיקרוסקופ XY (כ -90 × 60 סנטימטרים) יכולה להיות מפוברקת מפלדה בעובי 1 סנטימטר עם ציפוי חלודה הוכחה. השלב מחובר לשולחן מדד הנדסה או שתי שקופיות יונה-זנב רכובים בזוויות ישרות ונתמכות על עמודי טפלון או העברות כדור לתנועה במישור האופקי. אסדה טיפוסית (ראה איור 2) יש הרבה מן המשותף עם ציוד מיקרוסקופ וmicropositioning משמש למגוון רחב של ניסויי זרימת דם intravital כגון אלה כדי למדוד את זרימת דם חד כלי והמטוקריט, אספקת חמצן מקומית על ידי microvessels דם perfused, רגולציה של חלק בכלי דם טונוס שרירים, והצטברות כלי הדם המקומית של קליעים נותבים ניאון הוזרקו לכל מחזור. 18-26 ההיבט הבסיסי של הטכניקה הוא המדידה של נפח זרימה (J v) על פני שטח מוגדר שטח (S) של קיר כלי-דם קטנים. כדי להשיגזה באמצעות הטכניקה לנדיס שונה שתוארה במסמך זה מיקרוסקופ ההפוך פשוט הוא נאות. מצלמת וידאו קטנה היא רכובה על נמל התמונה ואות וידאו, עם בסיס זמן הוסיף, מוצג על צג וידאו ונרשם גם בצורה דיגיטלית במחשב או כאות דיגיטלית או אנלוגי במצלמת וידאו. ברגע שהכלי-הדם הקטן הוא cannulated החלק מהכלי-הדם הקטן הגלוי למצלמה ניתן לשנות על ידי הזזת הבמה ומניפולטורים כיחידה מבלי לשבש את cannulation. מדידה של תזרימי transvascular יכולה גם להיות משולבת עם חקירות מפורטות יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוחכם עם מסננים מתאימים כגון אסדות המשמשות למדידות של חדירות מומסות, ניטור יחס ניאון של סידן cytoplasmic או מנגנונים תאיים אחרים, והדמיה confocal 6,12,13, 27. יתרון עיקרי של כל גישות microperfusion הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות, על אותו הכלי, תחת שינוי מבוקר של כוח מניע כגון לחצים ההידרוסטטי וoncotic, או שינוי מושרה בתגובות כלי למצבים דלקתיים. העיצוב הנפוץ ביותר הוא השוואה לזווג של מוליכות הידראוליות נמדדו (עמ &#39;יב) באותו כלי עם הכלי perfused הראשון באמצעות micropipette מלא perfusate שליטה והשעית התא האדום להקמת מדינת חדירות תחילת המחקר, ולאחר מכן עם טפטפת שני עם סוכן מבחן נוסף לperfusate. cannulations מרובה אפשרי עם המחזור חזר לאחר reperfusion עם פיפטה השליטה. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את cannulation וmicroperfusion של כלי venular בלפדר עכברוש להקליט והנתיבים מים על פני קיר כלי-דם קטנים ולמדוד את p L של קיר הכלי, מדד שימושי של החדירות של המסלול המשותף למים ומומסים פני שלם מחסום אנדותל. ההליך נקרא techniq נדיס שונהUE כי העיקרון המקורי לנדיס של שימוש בתנועה היחסית של תאים אדומים כמדד להחלפת נוזל transvascular לאחר זלוף חסום נשמרה 28, אבל מגוון של תנאי ניסוי (למשל, הבדלים בלחץ ההידרוסטטי oncotic ואלבומין פני קיר כלי-דם קטנים) זמין לאחר microperfusion הוא הרבה יותר גדול מאשר בmicrovessels דם perfused uncannulated 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

ניסויים כדי למדוד את תכונות חדירות של microvessels perfused בנפרד מספקים גשר בין החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים המסדירים חדירות כלי דם בmonolayers תרבית התא אנדותל ומאפייני תמורה הפונקציונליות של מיטות כלי דם שלמות. שיטה לcannulate וינקב microvessels venular של לפדר עכברוש ולמדוד את המוליכות הידראוליות של קיר microvessel מתוארת. הציוד העיקרי הדרוש כולל מיקרוסקופ intravital עם במה גדולה שונה, התומכת micromanipulators למצב את שלוש microtools שונה: (1) micropipette זכוכית משופעת לcannulate וינקב כלי-דם קטנים; (2) מיקרו-occluder זכוכית לחסום זמנית זלוף ולאפשר מדידה של זרימת מים בתנועת transvascular לחץ ההידרוסטטי נמדד, ו- (3) מוט זכוכית בוטה כדי לייצב את רקמות mesenteric באתר של cannulation. Techniq מיקרו-החסימה שונה לנדיסUE משתמש בתאים אדומים התלויים בperfusate המלאכותי כסמנים של תנועת נוזל transvascular, וגם מאפשר מדידות חוזרות ונשנות של זרמים אלה תנאי ניסוי כמשתנים והבדל לחץ האוסמוטי ההידרוסטטי וקולואיד פני microvessels נשלטות בזהירות. מדידות של מוליכות הידראוליות באמצעות ראשון perfusate שליטה, אז אחרי מחדש cannulation של אותו כלי-דם קטנים עם perfusates הבדיקה מאפשרות לזווג השוואות של תגובת microvessel בתנאים מבוקרים היטב אלה. ניסיונות להאריך את השיטה לmicrovessels בלפדר של עכברים עם שינויים גנטיים צפויים לשנות חדירות כלי דם היו מוגבלים בגלל היעדר microvessels ישר וunbranched הארוך בלפדר עכבר, אבל הזמינות האחרונה של החולדות עם שינויים גנטיים דומים באמצעות הטכנולוגיה / Cas9 CRISPR צפויה לפתוח אזורים חדשים של חקירה שבו ניתן ליישם השיטות שתוארו במסמך זה. </p&gt;

איור 4 מראה את התוצאות מהמדידה במהלך השינויים בעמ L הזמן בחולדת venular microvessel cannulated ברציפות עם ארבע perfusates. 33 עמ &#39;גודל L מחושב בלחץ מתמיד שימש כמדד לשינויים בקיר חדירות כלי-דם קטנים, ראשון במדינה עם שליטת perfusate המכיל 1% אלבומין בסרום שור לאחר מכן כאשר כלי נחשפו לברדיקינין הסוכן הדלקתי (BK) באמצעות micropipette שני מכיל 10 ננומטר Bk. ברדיקינין גרם לעלייה חולפת בעמ L שחזרה לכיוון ערך שליטה דקות 10-15 שלאחר מכן. הספינה אז מחדש perfused עם perfusate שליטה למשך 30 דקות כדי להקים מחדש בסיס יציב. כאשר כלי-דם קטנים היה perfused באמצעות micropipette רביעי עם אותו הריכוז של Bk כמו גם 1 מיקרומטר sphingosine-1-phospate (S1P) בperfusate, התגובה לBk הוחלשה באופן משמעותי. מידתהנחתה כאשר Bk וS1P היו perfused באותו הזמן נמצאה דומה לזה שנמדד בניסויים אחרים שבי S1P התווסף לperfusate עד 20 דקות לפני החשיפה לBk. תוצאות אלו מראות את הכח של יכולת לבצע מדידות מרובות של p L בכלי אחד, ולהראות שהפעולה של סוכן כגון S1P לייצב את קיר הכלי בנוכחות סוכן דלקתי יכולה להיפתר לתקופות זמן ב בסדר הגודל של כמה שניות. בכלים נפרדים מחקרי שליטה בוצעו בפרוטוקול דומה בהעדר S1P להראות שההנחתה של תגובת Bk לא הייתה בשל אנפילקסיס. עבור חלק מעיצובים ניסיוניים חשוב להעריך גם את ההשתקפות מקדם המומס למקרומולקולה (σ) ועמ &#39;L. המטרה זו מושגת על ידי מיטב מדידת J v בלחצים מרובים בכל כלי-דם קטנים בודד. איור 5 מראה ניסוי שn ששני p L והלחץ האפקטיבי oncotic של אלבומין 5% בperfusate (π אלבומין = 27 CMH 2 O על 37 מעלות צלזיוס) נאמד בתנאים בם לא היה אלבומין ברקמות המקיפות את כלי-דם קטנים חולדה. באלה נ J ניסויים / S נמדד בשלושה לחצים שונים. P L הוא השיפוע של הקשר בין J נ / S ולחץ, וליירט על ציר הלחץ הוא הבדל לחץ oncotic היעיל על פני קיר הכלי (σΔπ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53210/53210fig1.jpg" /> איור 1. Microtools לטפטוף של microvessels הבודד. () Micropipette לcannulation של microvessels עכברוש עם קצה משופע. (ב) עוצר להחזקת רקמה לפדר יציבה בסמוך למקום cannulation. (ג) </sטרונג&gt; מוט מיסוך, או חוסם, המשמש ללחץ כלפי מטה על לפדר וכלי-הדם הקטן cannulated כדי לחסום את הזרימה בכלי השיט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53210/53210fig2.jpg" /> איור 2. אסדת Intravital לmicroperfusion. שלב מתכת גדול סקירה של מגש חיה עם micromanipulators וmicrotools אוריינטציה על עמוד זכוכית (). (ב) רכוב על שולחן הנדסה ומסבי תמיכה. (ג) מורדם עכברוש עם microtools בעמדה לmicroperfusion של כלי-דם קטנים. נוף לסגור (D) של לפדר במהלך ניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זה</a><html> מחדש. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53210/53210fig3.jpg" /> מדידת איור 3. של קצב סינון ליחידת שטח באמצעות טכניקה לנדיס שונה. סכמטי זה מראה כלי-דם קטנים אחת cannulated עם micropipette ומוט מיסוך ממוקם מעל הכלי. מייד לאחר הגורם לחסימת כלי-דם קטנים, המרחק (ℓ 0) בין הסמן RBC נוסע באמצע של כלי-דם קטנים החסום ואתר החסימה נרשם כך שמסלול התא יכול להיות במעקב במשך 5-10 שניות לאחר חסימה. העמדה הראשונית (ℓ 0) ומהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של התא משמשים לחישוב קצב הסינון הממוצע ליחידת שטח של קיר כלי-דם קטנים בין תא הסמן והאתר של חסימה. Microoccluder לאחר מכן העלה, וזלוף החופשי הוקם לפני מדידות נוספות עשויות.com / קבצים / ftp_upload / 53,210 / &quot;target =&quot; _ 53210fig3large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53210/53210fig4.jpg" /> 4. נציגי נתונים איור מראים כי sphingosine-1-פוספט עיכוב (S1P) פועל מהר מאוד ברדיקינין (BK; 10 ננומטר). גרם לעלייה חולפת בעמ L כלי-דם קטנים. S1P מיושם כמו במקביל לברדיקינין השני מבחן (BK) מעוכב החריפה Bk התגובה ביחס לBk הראשון. נתונים אלה מראים כי הזמן של חשיפה לסוכן בדיקה יכול להיות שונה כדי להעריך את קינטיקה של הפעלה של תגובה מעכבת. באופן ספציפי, S1P מיושם במקביל רק עם Bk מאוד עכבות תגובת Bk. S1P היה 1 מיקרומטר וBk היה 10 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53210/53210fig5.jpg" /> איור 5. מדידה של J נ / S בלחצים מרובים מאפשר שני p L ולחץ oncotic היעיל כדי להימדד. שטף הסינון, J נ / S, נמדד בכלי זה בלחצים ההידרוסטטי microvessel שונים במהלך זלוף עם BSA (50 מ&quot;ג מיליליטר - 1; π = 27 CMH 2 O) ואילו לפדר היה שטוף עם הפתרון של רינגר ללא חלבון. השיפוע של הקשר בין J נ / S ולחץ הוא p L וליירט על ציר הלחץ מציין את הבדל לחץ oncotic היעיל על פני קיר הכלי. בניסוי זה Lp היה 1.2 × 10 -7 (שניות סנטימטר -1 CMH 2 O -1) וσΔπ היה 24 CMH 2 O. &lt;href = יעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Views.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...