Name: repeated blood collection for blood tests in adult zebrafish
Uploaded: 2015-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish at JoVE.com

This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.

נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מ.י., ובוצעו על פי תקנת רווחת בעלי החיים יפנית &quot;חוק על רווחה וניהול של בעלי חיים &#39;(משרד לאיכות הסביבה של יפן) ועמדו בהנחיות בינלאומיות. 1. הכנת המחט הערה: כל הניסויים בוצעו בהרדמה, וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. להמתת חסד, דגים היו שקועים באמבט קרח-מים (5 חלקים מים חלק קרח / 1 ב- C ° ≤4) ל≥20 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי microcapillary זכוכית על ידי משיכת נימי זכוכית 1.0 מ&quot;מ חיצוני בקוטר עם חולץ מחט (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קצות המחטים בעקיפין באמצעות מספריים קנס (איור 1). קוטר הקצה האידיאלי צריך להיות כ 100 - 200 מיקרומטר (איור 1 ג). אם diamete הקצהr הוא צר מדי, דם לא ייכנס למחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים הפרין במלח בריכוז של 5 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחט חתוכה בסוף מזנקים של הרכבה צינור aspirator ולהחזיק את השופר בפה, או לחבר את המחט למתקן הנורה. לטבול את קצה המחט לתוך פתרון הפרין, וheparinize המחט על ידי שאיבה ונושב הפתרון (איור 1D ו1E). הערה: ההרכבה צינור aspirator שמשה במשך הקפאת זרע דג הזברה 16. צינור גומי ארוך יכול לעצור את כל דם עף לתוך פה. הגדרת מסנן באמצע הדרך של הצינור יכולה למנוע את הסכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את מחטי heparinized בצלחת פטרי 10 סנטימטרים ואוויר יבש במשך שעה לפחות 1. מספר גדול של מחטים יכול להיות מוכן מראש. </li></ol> 2. הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ההרדמה במקרה פלסטיק קטן על ידי ערבוב 200 מיליליטר של מים דגים עם של 2-פנוקסיתנול 100 μl (2-pe). ריכוז סופי של ההרדמה הוא 500 עמודים לדקה. זהירות! יש 2-PE השפעה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מספר רצוי של דגים (זן א.ב.) ממערכת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברשת כדי להעביר את הדגים להרדמה 1 - 2 דקות (איור 1F). שימו לב לדגים לשחות בהדרגה, להפיץ את סנפירי החזה אופקי, התנשפות, ויש לי תנועות operculum מהירות בתוך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל שהזמן עובר, להתבונן הדגים נחו על הקרקעית של המקרה ולבסוף להפסיק לשחות. המטוס של הרדמה כירורגית יגיע כאשר הדגים מפסיק לנשום בכבדות ותנועות operculum הן איטיות. בשלב זה, דגים מוכנים לאיסוף דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רחפן להרים את הדגים בהרדמה מ2-PE ובעדינות מניח אותו על מגבת נייר ספוגה בהרדמה (איור 1G). לכסות את הראש של הדג בנייר טישו רך גם ספוג בפתרון 2-PE כדי למנוע יובש בעיניים ולהשתמש אחר נייר טישו רך ויבש, לעדינותלייבש את פני השטח הגוף. </li></ol> אוסף 3. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחט heparinized בסוף מזנקים של ההרכבה צינור aspirator (או מנפק הנורה) והחזק את סוף שופרו של ההרכבה צינור aspirator בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז בסוף מזנקים והמחט יחד, ולהסיר בזהירות את הכף מפריעה לקצה המחט. הכנס את המחט ב30 - זווית ° 45 לאתר איסוף דם. הימנע לנקב של מערכת העיכול (איור 1H). במקרה של שימוש במתקן הנורה, לחץ על הנורה עם אגודל ואצבע אמצעית, ולחסום את החור בקצה של הנורה עם האצבע ראשונה, ולאחר מכן להכניס את המחט כפי שתואר לעיל. הערה: האתר לאיסוף דם הוא לאורך ציר הגוף והאחורי לטבעת באזור של אב העורקים הגב. אב העורקים הגב (DA) ווריד הקרדינל האחורי (PCV) הם רק הגחון לעמוד השדרה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל למצוץשופר סוף ההרכבה צינור השאיפה כאשר המחט הרגישה נגיעה בעמוד השדרה. אם הדם לא עולה, להזיז את קצה המחט בעדינות ביד כדי לעודד את זרימת דם. שים לב שברגע שהדם עולה למחט, מייד הפסיק לרעוד ולמצוץ בעדינות (איור 1 ט). במקרה של שימוש במתקן הנורה, לשחרר את הלחץ של הנורה כדי לשאוב הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לדם יעלה לאט לתוך המחט באופן pulsatile ללא יניקה, אשר צפוי בגלל לחץ דם עורקים. לפיכך, אין זה הכרחי למצוץ אם המחט חודרת בצורה נכונה את העורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק יניקה לאחר הנפח המתאים של דם נאסף. הסר את המחט מהדגים ולחץ על האתר לנקב באמצעות נייר טישו רך כדי לעצור כל דימום. שים לב לעצירת הדימום לאחר כ 10 - 20 שניות של לחץ אצבע (איור 1J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדימום נעצר, להעביר את הדגים מייד חזרה לCLEמים חמים (~ 28 מעלות צלזיוס) טנק. עזרה הדגים להתאושש על ידי בעדינות מתערבל מים לכיוון הזימים עד שהוא מתחיל לשחות. הערה: שמור עד 5 דגי postsampling בטנק 2 L ולחבר את הטנק למערכת זרימת חמצן לדגים. תוספת של אנטיביוטיקה למים דגים אינה הכרחית. לשמור על הדגים עם דיור והאכלה רגילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את הדם מהמחט על אזור נקי של חתיכה (איור 1 יא) של parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד סוכר בדם באמצעות כל Glucometer כף יד מסחרי (איור 1 ליטר). הערה: Glucometer משתמש אלקטרודה dinucleotide גלוקוז פלבין-דהידרוגנז אדנין ודורש נפח דגימה של 0.6 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מקלון בדיקה לחלוטין למטר וישירות לגעת בטיפת הדם. שים לב לתיקו הדם לתוך רצועת הבדיקה באופן אוטומטי ולקבל שניות הגלוקוז בדם תוצאת 5 על שטח התצוגה. רשום את התוצאה ולהשליך את רצועת הבדיקה. להשתמש במקלון בדיקה חדשה לכל מדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (שלב אופציונאלי) קח כמויות מדויקות של דם על ידי pipetting ולהעביר את הדם לצינור microcentrifuge לניתוחים נוספים (המוגלובין, triacylglycerol (TG), כולסטרול כללי, וכו &#39;). במידת צורך, לדלל את כל הדם מדג אחד עם מי מלח. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 3 דקות ב 680 XG ב RT ולקצור את הפלזמה. העבר את הפלזמה לתוך צינור חדש. בשלב זה, הוא מוכן לשימוש בניתוחים ביוכימיים. </li></ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">The zebrafish as a model for human disease.</a> Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).</li><li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+blood+coagulation+in+the+zebrafish.">Analysis of blood coagulation in the zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).</li><li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+zebrafish+thrombocytes.">Identification and characterization of zebrafish thrombocytes.</a> Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).</li><li>Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+functional+characterization+of+granulocytes+and+macrophages+in+embryonic+and+adult.">Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult.</a> Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).</li><li>Iwanami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+understanding+the+evolution+of+the+vertebrate+immune+system+and+human+primary+immunodeficiency.">Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency.</a> Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).</li><li>Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+human+motor+neuron+diseases:+advantages+and+limitations.">Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations.</a> Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostasis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis.</a> Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).</li><li>Moss, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+pancreas+in+adult+zebrafish.">Regeneration of the pancreas in adult zebrafish.</a> Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10 (21), (2010).</li><li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish.">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).</li><li>Velasco-Santamar&#237;a, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bezafibrate,+a+lipid-lowering+pharmaceutical,+as+a+potential+endocrine+disruptor+in+male+zebrafish+(Danio+rerio).">Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio).</a> Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).</li><li>Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+reliable+method+for+repeated+blood+collection+from+aquarium+fish.">A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish.</a> Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center.">Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Thorson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+partitioning+of+body+water+in+Osteichthyes:+phylogenetic+and+ecological+implications+in+aquatic+vertebrates.">The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates.</a> Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).</li><li>Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+blood+volume+in+the+fish+(Salmo+gairdneri+gairdneri).">Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri).</a> Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).</li><li>Diehl, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+practice+guide+to+the+administration+of+substances+and+removal+of+blood,+including+routes+and+volumes.">A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes.</a> J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).</li><li>Nahas, K., Provost, J. -. P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+blood+removal+via+the+sublingual+vein+on+haematological+and+clinical+parameters+in+Sprague-Dawley+rats.">Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats.</a> Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Andersson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+signaling+promotes+regeneration+of+pancreatic+beta+cells+in+vivo.">Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo.</a> Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).</li><li>Hiramitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eriocitrin+ameliorates+diet-induced+hepatic+steatosis+with+activation+of+mitochondrial+biogenesis.">Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis.</a> Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).</li><li>Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Yuzu+(Citrus+junos+Siebold+ex+Tanaka)+peel+on+the+diet-induced+obesity+in+a+zebrafish+model.">Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model.</a> J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).</li><li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+non-alcoholic+fatty+liver+disease+with+zebrafish:+a+confluence+of+optics,+genetics,+and+physiology.">Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).</li><li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+lipid+accumulation,+lipoprotein+oxidation,+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish.">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li><li>Thomas, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+balance+and+energy+expenditure+during+ad+libitum+feeding+of+high-fat+and+high-carbohydrate+diets+in+humans.">Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans.</a> Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לקבלת סדרתי דם מדג הזברה מבוגרת. שיטה זו היא פשוטה לביצוע ואנחנו משתמשים בו במעבדה על בסיס יומי. שיטת איסוף דם זה מבוססת על החדרת מחט נימי זכוכית לתוך אב העורקים הגב של דג הזברה. במהלך הליך זה, זה קריטי להיות זהיר כדי לא לקטוע את עמוד השדרה ...

דג הזברה צוברת פופולריות גוברת כמודל ערך של מחלות בבני אדם משום שהאיברים והגנטיקה שלהם דומים לאלה של בני אדם 1,2. בתחום הביולוגיה התפתחותית, מחקרים רבים הראו כי דג הזברה ומופע אנושי מסומנות דמיון בhematopoiesis 3, עצירת הדימום 4,5, וmyelopoiesis 6. דג הזברה מבוגרת משמש גם ללימוד חיסוני 7, 8 ניווניות ומחלות הקשורות להשמנה 9 כי מניות אורגניזם מודל זה מסלולים משותפים עם אלה שיבשו במחלות בבני אדם. להשמנת יתר ומחלות הקשורות להשמנת יתר (סוכרת, הכבד וsteatosis steatohepatitis נטול אלכוהול וטרשת עורק), רמת סוכר בדם ורמות שומני דג הזברה נחקרו ביסודיות במספר דגמי השמנה מהונדס ומושרה דיאטה 10-13. דגימת דם חוזרת ונשנית של בעלי חיים פרט להפחית את השימוש בבעלי חי ודצמrease הבדלי interindividual. עם זאת, אוסף מדגם חוזר ונשנה הוא קשה מבחינה טכנית בבעלי חיים קטנים כמו דג הזברה בגללם קטן יחסית נפח הדם וחוסר כלי נגישים בקלות. כמה שיטות לחד פעמי איסוף דם מדג הזברה פותחו, למרות שיש לי שיטות אלה חסרונות שלהם, כולל קטלני, נזק לרקמות קשורות ומוגבל נפח דם. לדוגמא, 1-5 דם μl ניתן לקצור מחתך רוחב של כ -0.3 סנטימטר באורך באזור של אב העורקים גב 5. עריפת ראש במספריים על ידי חיתוך דרך חגורת החזה יכול לאסוף 5-10 μl דם 10. שיטת דגימת דם נוחה נוספת היא אבלציה זנב 14. לנקב לב הוא שיטה חלופית פוטנציאלית אחד לאיסוף דם חוזר ונשנה של אותו דג, אבל הכמות קטנה מאוד שהושגה (כ 50 NL) עם הליך זה מגביל את מספר הניתוחים שיכולים להיות performed 11. בהתאם לכך, יש צורך בפרוטוקול חדש שיאפשר דגימה החוזרת ונשנית לא קטלנית דם, אשר תהיה מראש קריטי הכרחיות לאורגניזם זה להיות אורגניזם מודל סטנדרטי למחלות בבני אדם. טכניקה זו תאפשר לבדיקת תגובה תרופתית, גילוי של סמנים מולקולריים לאבחון, קביעת פרוגנוזה, והניטור של מחלות שונות, כגון מחלות מטבוליות, מחלות ניווניות וסוגים שונים של גידולים ממאירים. לפיכך, אנו פיתחנו שיטה זעיר פולשנית לקבלת דם מדג הזברה סדרתי 15. כאן אנו מדגימים את הליך בחינה ויזואלית ולספק פרוטוקול מפורט לטכניקה זו. באמצעות שיטה זו, הערך הנורמלי המסתמך על פרמטרים שונים, בין המוגלובין, צום רמת סוכר בדם, ושומנים בדם של דג הזברה מבוגר בריאה הוערכו. בנוסף, אנחנו גם הערכנו האם שיטה זו מתאימה ללימודים שדורשים דגימות סידורי על ידי מ &#39;onitoring השינויים זמניים ברמות סוכר בדם במהלך ניסויי האכלת יתר.

<table><tbody><tr><td>Glass capillaries with filament</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td>1.0 mm outer diameter.</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>To produce the needles</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>081-00136</td><td>For heparinization</td></tr><tr><td>Aspirator tube assembly</td><td>Drummond</td><td>2-040-000</td><td>For blood collection</td></tr><tr><td>Bulb dispenser</td><td>Drummond</td><td>1-000-9000</td><td>For blood collection</td></tr><tr><td>2-phenoxyethanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-12075</td><td>For anesthetizing the fish</td></tr><tr><td>DRI-CHEM3500V</td><td>Fujifilm</td><td>-</td><td>For hemoglobin measurement</td></tr><tr><td>DRI-CHEM Slides</td><td>Fujifilm</td><td>Hb-WII</td><td>For hemoglobin measurement</td></tr><tr><td>Glutest Neo Super</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho</td><td>-</td><td>For bood glucose measurement</td></tr><tr><td>Wako L-type TG kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>464-44201</td><td>For TG measurement</td></tr><tr><td>Wako L-type CHO kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>460-44301</td><td>For total cholesterol measurement</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan Packaging</td><td>PM996</td><td>To expel the blood on</td></tr></tbody></table>

repeated blood collection for blood tests in adult zebrafish

איסוף דם חוזרים ונשנים הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר שבוצעו בחיות מעבדה. עם זאת, פרוטוקול לא קטלני לאיסוף דם מדג הזברה לא הוקם. השיטות הקודמות לאיסוף דם מדג הזברה הן קטלניות, כגון חתך לרוחב, עריפת ראש והזנב אבלציה. כך פיתחנו שיטה חדשה &quot;חזר&quot; איסוף דם, ובהווה כאן פרוטוקול מפורט המתאר הליך זה. שיטה זו היא פולשנית ותוצאות בשיעור תמותה נמוכה מאוד (2.3%) לדג זברה, ובכך לאפשר דגימת דם חוזרת ונשנית של אותו אדם. הנפח המרבי של דגימת דם תלוי במשקל גוף של הדג. נפח דגימת דם חוזר ונשנה במרווחים צריך להיות ≤0.4% ממשקל גוף בכל שבוע או ≤1% כל 2 שבועות, שהוערכו על ידי מדידות של המוגלובין בדם. בנוסף, המוגלובין,, triacylglycerol צום סוכר בדם הפלזמה (TG) וג הכוללרמות holesterol בדג זברה מבוגרת זכר ונקבה נמדדו. אנחנו גם מיושמים בשיטה זו כדי לחקור את חוסר הוויסות של חילוף חומרים של הגלוקוז בהשמנה יתר הנגרם דיאטה. שיטת איסוף דם זה תאפשר יישומים רבים, כולל גלוקוז וחילוף חומרים של שומנים ומחקרים המטולוגיות, אשר יגדילו את השימוש בדג הזברה כאורגניזם מודל מחלה אנושי.

שיטת איסוף דם זה גורם לפגיעה מינימאלית לדג זברה (&lt;לנקב 1 מ&quot;מ; איור 1J) ומניבה שיעור תמותה נמוך מאוד של 2.3%. בחנו את הנפח המרבי של דם שיכול להיות שנאסף מדג אחד והעריך את הקשר למשקל הגוף שלה (איור 3). מצאנו שמרבית הדם שנאסף הנפח היה מתואם באופן ליניארי עם ...

Watch this Scientific Journal Video about Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish at JoVE.com

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

repeated-blood-collection-for-blood-tests-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

34.9K Views.  Mie University. Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Video: Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetics

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Developmental Biology

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Optimized Intravenous Injection in Adult Zebrafish

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in mammalian research models. However, its application in adult zebrafish for drug delivery, stem cell transplantation, and regenerative and cancer studies has been limited due to the challenges posed by their small body size and intricate blood vessels. To overcome these limitations, alternative injection techniques such as intracardiac and retro-orbital (RO) injection have been explored in the past for stem cell transplantation in adult zebrafish. However, these techniques have their drawbacks, including the need for meticulous injection techniques or increased risk of mortality.
In this study, we have developed a refined and optimized IV injection procedure specifically tailored to adult zebrafish, addressing the challenges associated with their unique anatomy. To demonstrate the effectiveness of this technique, we performed successful IV injections of whole kidney marrow cells from Tg(mpo: EGFP) fish and FITC-dextran dye into adult Casper fish. The subsequent visualization of injected cells and dyes using a fluorescence microscope confirmed their successful delivery and engraftment within the zebrafish. Furthermore, we demonstrated that compared with the intracardiac and RO injections, the IV injection resulted in improved survival rates and engraftment efficiency in treated zebrafish. This approach enables precise delivery and localization of substances and holds great potential for large-scale drug and chemical screening using adult zebrafish. Additionally, the ability to visually track the injected cells and dyes provides invaluable insights into their engraftment, migration, and interactions with host tissues, enabling a more comprehensive evaluation of therapeutic effects and biological processes in zebrafish models.

Here, we present an optimized and effective protocol for the intravenous injection of cells or pharmacological agents into adult zebrafish, resulting in enhanced cell engraftment and increased survival rates of the treated zebrafish.

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in ...

Cancer Research

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Medicine

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of zebrafish not only as a research model for human cardiac electrophysiology and myopathies but also as a surrogate model in high throughput pharmaceutical screening for potential cardiotoxicities to humans, such as QT prolongation. As such, in vivo electrocardiography for adult zebrafish is an electrical phenotyping tool that is necessary, if not indispensable, for cross-sectional or longitudinal in vivo electrophysiological characterizations. However, too often, the lack of a reliable, practical, and cost-effective recording method remains a major challenge preventing this in vivo diagnostic tool from becoming more readily accessible. Here, we describe a practical, straightforward approach to in vivo electrocardiography for adult zebrafish using a low-maintenance, cost-effective, and comprehensive system that yields consistent, reliable recordings. We illustrate our protocol using healthy adult male zebrafish of 12-18 months of age. We also introduce a rapid real-time interpretation strategy for quality validation to ensure data accuracy and robustness early in the electrocardiogram recording process.

Here, we present a reliable, minimally invasive, and cost-effective method to record and interpret electrocardiograms in live anesthetized adult zebrafish.

ב אלקטרוקרדיוגרפיה למבוגרים בלבד Vivo

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...