This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.

הצהרת אתיקה: כל הניסויים האלה לעקוב אחרי הטיפול בבעלי החיים וקווים מנחים אתיים של אוניברסיטת נוטינגהם. 1. הכנת חרוזים הפרין להארכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים הפרין ביסודיות בPBS לפני השימוש. הערה: ניתן לאחסן חרוזים על 4 מעלות צלזיוס כתרחיף בPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חרוזים להשתלה על ידי הוצאתם מהמנייה עם טפטפת 20 μl לירידת 1 מיליליטר של PBS. לאחר מכן להשתמש micropipette מוגדר 2 μl להעביר חרוזים לירידה של 20 μl של PBS בצלחת פטרי 3 סנטימטר. בחר חרוזים מבוססים על גודל ו, באמצעות סטריאו מיקרוסקופ לנתח, להעביר חרוזים נבחרו עם קצה פיפטה P2; הסובבים 100 מיקרומטר הקוטר הוא אידיאליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהחרוזים. להסיר את רוב הנוזל עם טפטפת μl 20 ואת הנוזל שיורית על ידי פעולת נימים עם מלקחיים שענים בסדר. שים לב: חשוב להסיר כמה שיותר כך צמיחת פקטוr אינו מדולל כאשר הוא הוסיף לחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה גורם הגדילה ישירות על חרוזים. לFGF18 להוסיף 0.5 μl של FGF18 רקומביננטי מחדש ברמה של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בBSA 0.1% ב PBS. מניחים כמה טיפות של מים בקצוות של המנה, כדי למנוע את הנוזל מתאדה מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים עבור שעה 1 ב RT. הסר את טיפות מים מהצלחת עם פיפטה פסטר ומניח על קרח מוכן להשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נדרש העברה (לחרוזים שקופים) 4-5 חרוזים 2% פנול אדומים לפני השתלה כדי לעזור לחזות אותם. יש לשטוף בPBS לפני העברה לעובר. </li></ol> 2. הכנת חרוזים 1-X2 AG להארכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש derivatize חרוזים עם 0.2 חומצה פורמית N. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות שימוש זה מרית להעביר חרוזים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 1ml של 0.2 חומצה פורמית N ולשטוף על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להסיר את החומצה פורמית עם טפטפת P1000 ולהחליף עם 1מיליליטר של מים. לשטוף עבור שעה 1 ולחזור על שש פעמים כדי להסיר נותר חומצה פורמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוזל שנותר עם טפטפת P1000 ולאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס. הערה: אין צורך להסיר את כל שאריות המים בשלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלולה קטנה של חרוזים של כ 5-10 μl נפח מהמניות בעזרת מרית קטנה לצלחת פטרי 3 סנטימטר ולהוסיף 1 מיליליטר של DMSO (או לפי ממס התרופה מומסת ב). הערה: זה אמור לספק כמה מאה חרוזים שממנו ניתן לבחור את הגודל הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להשתמש פיפטה P2 מוגדרת 2 μl להעביר חרוזים של כ -100 מיקרומטר קוטר לירידה של 20 μl של ממס בצלחת פטרי עוד 3 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ממס עם טפטפת μl 20 וכל ממס שייר עם טפטפת 2 μl. החלף עם 20 μl של התרופה שיש להחיל. הערה: לעקביות לפזר את התרופה בריכוז של 100 מיקרומטר בDMSO (או שאי פעם ממס משמש),aliquot לתוך 20 μl ולאחסן ב -80 ° C כמו כמה מעכבי מולקולה קטנים אינם יציבים ועדיף להימנע מהקפאה-הפשרה חוזרת ונשנית. אם יש צורך אז לדלל את התרופה לריכוז הרצוי לפני השרייה חרוזים. ריכוזים יעילים ייתכן שיהיו הצורך לקבוע באופן אמפירי לכל תרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1. להגן מפני אור רב של מולקולות אלה הם רגישים לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השתלת העברה 4-5 חרוזים עם טפטפת P2 מוגדר 2 μl לμl 20 של 2% פנול אדומים מומס במים. לבצע שלב זה באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו לדמיין את החרוזים. הסר חרוז אחד עם מלקחיים שענים קנס או לולאת חוט ולשטוף בPBS לפני העברה לעובר. אל תשאירו חרוזים ב 2% פנול אדומים ליותר מ -15 דקות לפני השימוש כמו זה יכול לגרום לאובדן של פעילות. </li></ol> 3. הכנת מחטי טונגסטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך חוט טונגסטן קנס ל3-4 סנטימטר אורך. הכנס חתיכת חוט אחד לסוףפיפטה פסטר זכוכית ולהמס במבער בונזן לתקן בעמדה. הכן עד 10 מחטים על מנת להבטיח כי יש חלקי חילוף אם הם ניזוקו במהלך שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קצה החוט לתוך להבת מבער ולהחזיק אותו שם עד טונגסטן זוהר לבן והקצה חד (כ 2-3 דקות). הערה: במהלך שימוש המחט ניתן לנקות ו- חידד מחדש במבער בהתאם לצורך. הערה: גם מחטים אלה יכולים לשמש כדי להפוך את הלולאות להעברת חרוזים. לגעת בעדינות את המחט לספסל וזה יהיה לכופף כדי ליצור לולאה. </li></ol> 4. עוברים הכנה לתל חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים עם סופו של הדבר הבוטה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי (3-5 ימים עבור רוב מניפולציות ניצן האיבר). שימוש בברז מלקחיים בוטה על הקצה הקהה לשבור את הקליפה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להסיר את הקליפה ולחשוף את העובר. ודא קרום קליפת הביצה הוא גם הוסר. הערה: ניתן להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS עם פיפטה פסטר לסייע בזה אם הקרום נדבק לחלמון. בעדינות פיפטה PBS על פני השטח של החלמון, לתפוס את הקרום עם המלקחיים, נזהר שלא לפגוע בחלמון, ומשוכים בעדינות מהביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עד 5 מיליליטר של חלבון מן הביצה עם מזרק 10 מיליליטר ומחט 19 G. קח רק את מה שנחוץ כדי להבטיח את העובר לא ליצור קשר עם הקלטת משמשת לאטום את הביצה כהסרה של נפחים גדולים יותר יכול להפחית את שיעורי הישרדות עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את העובר להוסיף 5-6 טיפות של דיו הודו אמנים עד 15 מיליליטר של PBS המכיל 100 פניצילין U ו 0.1 מ&quot;ג סטרפטומיצין / מיליליטר. להזריק 0.5-1 מ&quot;ל ישירות תחת העובר עם מזרק 1 מיליליטר ומחט 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2-3 מיליליטר של PBS עם 1% בסרום עוברי עגל ופניצילין 100 U ו 0.1 מ&quot;ג סטרפטומיצין / מיליליטר לתוך הביצה על מנת להבטיח את העובר אינו מייבשים. בעזרת מלקחיים שענים חידדו להסיר את קרום vitelline ולפתוח את amnion מעל ניצני איבר הפיתוח. להבטיח את העובר לא להתייבש ו, במידת הצורך, להוסיף עוד PBS / FCS. הערה: ניצני האיבר ניתן לראות צמחים לזווג בכנף של העובר באופן ברור. בשלבים אלה העובר יהפוך הלוואי כגון הנכון הוא בדרך כלל עליון. כתוצאה מכך היא בדרך כלל קלה יותר להרכיב חרוזים לגפיים תקין ולהשתמש באלה עזבו כפקדים נגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט טונגסטן חידד לעשות חתך לניצן האיבר שבו חרוז יהיה מושתל. הימנע חיתוך לאורך כל הדרך ניצן האיבר שבו אפשרי אם כי בשלבים צעירים זה קשה. הערה: בעוברים גדולים יותר (שלב HH 22 ומעלה) ניתן לבחור אזורים ספציפיים של ניצן האיבר להשתלה, אך בשלבים צעירים זה קשה יותר כאיבר הניצן עצמו הוא קטן. כמו כן, חשוב לזכור כי ניצן האיבר יגדל עבר חרוז המורכבים כל כך, במיוחד בשלבים צעירים, חרוז יישאר בגפה הפרוקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים חרוז משני גורם הגדילה או תרופה או באמצעות wa קנס נוסףמלקחיים tchmakers או לולאה עשויה ממחט טונגסטן. אם חרוז כבר ספוג באו DMSO או פנול אדום, לשטוף בPBS לפני היישום לעובר. העבר את חרוז לעובר עם המלקחיים / לולאת חוט. לאחר מכן השתמשתי בחוט טונגסטן חידד להכניס את חרוז לתוך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS / FCS לביצה להבטיח כי העובר נשמר התייבשות, אך להימנע יישום ישירות על העובר עצמו כמו זה יכול לגרום נזק לעוברים ולגרום חרוז שחלץ. לאטום את הביצה עם קלטת ולחזור לחממה. </li></ol>

<ol>
	<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Bell, E., Brickell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+retroviral+vectors+for+expressing+genes+in+avian+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo.</a> Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).</li><li>Abu-Elmagd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/Lef1+signaling+acts+via+Pitx2+to+regulate+somite+myogenesis.">Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis.</a> Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).</li><li>Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+signals+from+the+neural+tube,+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite.">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li><li>McGrew, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+germline+transgenic+chickens+using+lentiviral+vectors.">Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.</a> EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).</li><li>Valasek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+investigations+into+the+development+of+the+pectoral+girdle.">Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle.</a> Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).</li><li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development.">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region.">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li><li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells.">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li><li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing.">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li><li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development.">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li><li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scatter+factor/hepatocyte+growth+factor+(SF/HGF)+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo.">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li><li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts.">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li><li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5.">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li><li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(beta)-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals.">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk.">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li><li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension.">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li><li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity.">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li><li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes.">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li><li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos.">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li><li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals.">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).</li><li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors.">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li><li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system:+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem.">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השימוש בשתלי חרוז מיושמים ישירות לפיתוח רקמות באובו הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את התפקיד של איתות גורם גדילה במהלך הפיתוח נותן שליטה ללא תחרות על השלב ההתפתחותי שבו הם מיושמים ומשך חשיפה. הבחירה של החרוזים לכל סוג של מולקולה חשובה...

עוברי עופות סיפקו כלי רב עוצמה ללימוד פיתוח במשך שנים רבות 1. אחד מהמאפיינים השימושיים ביותר שלהם הוא שהם קלים יחסית לתמרן. פיתוח חיצוני מאפשר לפתוח את הביצה כדי לגשת לעובר ולבצע micromanipulations השונים, כולל דוגמאות, כגון מערכת הכימרה שליו-חומוס הקלאסית ללימוד תא גורל 2,3, ההזרקה של רטרווירוסים לביטוי יתר ברקמות ספציפיות במהלך פיתוח 4,5 ותרבות explant לזהות מקורות איתות התפתחותית 6. לאחרונה מפלצות שנוצרו בין מארחים ללא תווית עם שתלים מקו עוף מהונדס להביע GFP הראה כי שילוב של השתלה קלסית ושינוי גנטי יכול לספק תובנות חשובות פיתוח 7,8. הקלות שבה ניתן להשפיע עובר העופות הפכה אותו מודל מצוין לחקר איברפיתוח 9. היישום של גורמי גדילה ספציפיים לאיברי פיתוח in vivo כבר סייע בזיהוי גורמים המשנים דפוסי איבר 10,11 וממשיך לספק תובנות תהליך זה 12. גישה זו שימשה גם כדי ללמוד את הגורמים המווסתים את התפתחות שרירים וחשפה תפקידים למספר רבים של אותות כגון 13 Wnts, 14 ו -15 BMPs HGF. לאחרונה טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לחקור את אותות שליטה ביטוי גני myogenic בניצן האיבר והראתה כי אינטראקציות בין FGF18 וחומצה רטינואית יכולות לשלוט על העיתוי של ביטוי Myod 16. באמצעות שילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות שניתן לטעון על חרוזים ולאחר מכן השתילו ישירות לתוך רקמות ספציפיות בשלבי התפתחות מוגדרים נותנת ההזדמנות להתערב כמעט בכל זמן ובאזור במהלך פיתוח. זה נעשה שימוש כדי Investigate תהליכים רבים, כולל דפוסי somite 17,18, מפרט עצבי 19, הגירה עצבית פסגת 20 והארכת ציר 21. כאן אנו מתארים שיטה להשתלת חרוזים ספוגים באו גורמי גדילה או מעכבים לפיתוח גפיים עוף. זה נעשה שימוש כדי לקבוע את ההשפעות של אותות אלה על ידי ניתוח myogenesis ביטוי שריר גן ספציפי עם הכלאה באתר. אנו מתארים שתלים או באמצעות חרוזים הפרין ספוגים, המשמשים לגורמי גדילה, או חרוזים 1-X2 AG למולקולות קטנות הידרופובי כגון חומצה רטינואית או מעכבי מולקולה קטנים של מסלולי איתות ספציפיים. עם זאת חרוזים אחרים זמינים גם אשר היו בשימוש כדי לספק את שני 22 FGFs ושש 23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin acrylic beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5263</td>
			<td>The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG 1-X2 beads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>140-1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affi Gel blue beads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301; 153-7302</td>
			<td>These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF18</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-28</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80&#176;C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U0126</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9903</td>
			<td>Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80&#176;C. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMS-493</td>
			<td>Tocris Biosciences</td>
			<td>3509</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80&#176;C. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Indian ink</td>
			<td>Windsor and Newton</td>
			<td>5012572003384 (30ml)</td>
			<td>While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

grafting of beads into developing chicken embryo limbs to identify signal transduction pathways affecting gene expression

שימוש בעוברי עוף אפשר לבדוק ישירות את ההשפעות של שני גורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות על ביטוי גנים והפעלה של מסלולי העברת אותות. טכניקה זו מאפשרת המשלוח של מולקולות איתות בשלבי התפתחות מוגדרות במדויק לזמנים מסוימים. לאחר ניתן לקצור זו עוברים וביטוי גנים בדקו, למשל, על ידי הכלאה באתר, או הפעלה של מסלולי העברת אותות נצפו עם immunostaining. בחרוזים זה וידאו הפרין הספוג בFGF18 או חרוזים 1-X2 AG הספוג בU0126, מעכב MEK, הם מורכבים לניצן האיבר באוב. זה מראה כי FGF18 גורם ביטוי של Myod וזירחון ERK וביטוי Myod שני אנדוגני וFGF18 המושרה הוא מעוכב על ידי U0126. חרוזים הספוגים באנטגוניסט חומצה רטינואית יכולים להגביר אינדוקציה Myod מוקדמת על ידי FGF18. גישה זו יכולה להיות לנואד עם מגוון רחב של גורמים שונים צמיחה ומעכבים ומותאם בקלות לרקמות אחרות בעובר המתפתח.

בשלב HH 21 Myod לא בא לידי ביטוי בפיתוח myoblasts איבר למרות הכתמה ניתן לראות בmyotome של somites הפיתוח (איור 1 א). איור 1 מציג הכלאה באתר לMyod 6 שעות הבאות שתל חרוז FGF18. Myod מושרה בmyoblasts הקרוב לחרוז בעוד אין ביטוי באיבר הנגדי. שיתוף השתלת חרוז הספוג בU0126, מעכב ספציפי ...

Watch this Scientific Journal Video about Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression at JoVE.com

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Views.  University of Nottingham. By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Video: Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

ביטוי של חלבונים ניאון ב<em&gt; Lanceolatum מיתרני הראש</em&gt; על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ביטוי של חלבונים ניאון ב

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצבי^GFPאפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים