Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Etik Beyanı: Tüm işlemler Helsinki Bildirgesi uyarınca yürütüldü ve Tübingen Üniversitesi&#39;nde Klinik Etik Komitesi tarafından kabul edildi (38 / 2009B02 ve 470 / 2013B02 projeler). Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. izolasyonu (PBMC) <ol><li> 1000 IU heparin sülfat içeren 50 ml&#39;lik şırınga kullanarak venipunktür yoluyla sağlıklı bir gönüllüden 50-100 ml alın ve kan sulandırmak 1: PBS (pH = 7.2) 2. </li><li> 15 ml kan ayırma çözeltisi üzerine PBS çözeltisi gibi Biocoll olarak (d = 1.077 g / ml), 50 ml konik bir tüp içinde: dikkatlice kan 35 ml katman. Oda sıcaklığında 800 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. NOT: Fren kullanılmamalıdır. </li><li> Bir pipet ile lenfositik tabakanın hücreleri toplamak ve en az 50 ml PBS içerisinde iki kez yıkama hücreleri (400 x g&#39;de 12 dakika boyunca santrifüj). Bir pipet ile santrifüj sonra süpernatantı. </li><li> Lyse askıya alınması ve inkubasyon suretiyle eritrositler kalan2-4 dakika boyunca, bir hipotonik tampon çözeltisi 1-5 ml lenfositik kısmını bir başlatma. Not: maruz kalma ve liz tampon maddesi hacmi süresi kullanılan parçalama tamponu ve lenfosit fraksiyonunda kalan kırmızı kan hücrelerinin miktarına bağlıdır. </li><li> 12 dakika boyunca 250 xg&#39;de PBS (01:10) ile hücreler ve santrifüj seyreltilir ve daha sonra tekrar süspansiyon ve 12 dakika boyunca 300 x g&#39;de 10 ml PBS içinde bir kez hücre pelletini yıkayın. </li><li> PBS içinde yeniden süspanse lenfositleri ve tripan mavi bir solüsyon kullanımıyla bir Neubauer sayım odası içinde hücreleri sayın. NOT: Genellikle,&gt; 1 x 10 8 lenfositler 100 ml alınan taze periferik kan çekilmiş. </li></ol> Vδ1 T hücreleri 2. İzolasyon <ol><li> Vδ1 CD4 T hücrelerinin frekansı belirleyen bir ilk FACS &lt;1 x 10 6 izole edilen lenfositlerin al. NOT: Bu T-hücresi varlığın Nüfus büyüklüğü bireylere ve onların immünolojik durumuna göre arasında büyük farklılık gösterebilir. Typically, T hücrelerin yaklaşık% 1 Vδ1 + ve Vδ1 + hücreleri, yaklaşık% 1-5 olan CD4 + &#39;dır. <ol><li> PBS,% 2 FCS ve 5 mM EDTA içeren oluşur 1 ml FACS tamponu ile hücreleri seyreltilir. 2 dakika süreyle 660 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant süzün. 100 ul FACS tampon akış hacmi daha sonraki boyama için yeterlidir. Kısaca bir girdap ve 5 ul FACS boyaması etkisi arttığından, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaktifi Fc bloke ile hücrelerin inkübe edin. </li><li> Fc bloke edici tepkin madde çıkartılmadan direkt olarak hücrelere insan monoklonal antikor ekleyin. , CD8 (1: 200) ve TCRαβ (01:25): Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (200 1) karşı antikorlar ile hücrelerin leke emin olun. Karşılık gelen immünoglobulin izotipleri ile izotip kontrolü hazırlayın. Karanlıkta 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca antikorlar ile inkübe hücreleri. </li><li> (2 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 660 xg) 1 ml FACS tampon maddesi içinde hücrelerin yıkayın, Süpernatant, süzünatant ve kalan tampon hacminde FACS edinimi geçin. </li></ol></li><li> 12 dakika boyunca santrifüj ile (FACS analizi kullanılmaz) hücreler topaklaşmasına; 300 g; 8 ° C. Süpernatantı ve 1 x 10 7 hücre başına 60 ul MACS-tamponu pelletin hücreyi tekrar süspansiyon. 1 x 10 7 hücre başına 20 ul Fc bloke edici tepkin madde ekleyin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Şirketinden hücrelere 1 x 10 7 hücre başına 10 ul FITC-konjüge anti-insan Vδ1 antikor ekleyin. Karanlıkta 4 ° C&#39;da 12 dakika kuluçkalayın. </li><li> 14 ml MACS-tamponu kullanılarak hücre yıkayın (12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 300 g, 8 ° C). Tamamen Süpernatant atın ve 1x10 7 hücre başına 80 ul MACS tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> 1-2 x 10 5 hücre almak ve FACS analizi ile etiketleme doğrulanması için 100 ul FACS tampon maddesi içinde seyreltilmesi. Daha başka katkı maddeleri, bu aşama için ihtiyaç vardır. Bir taşıdıkları risklerle olduğundan emin olunVδ1 için parlaklık cient farkı - ve Vδ1 + hücreler. Bu durumda değilse, tekrar) 2.3) ve 2.4 adımları tekrarlayın. </li><li> Geri kalan hücreler 1 x 10 7 hücre başına 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, (300 x g&#39;de, 12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 8 ° C), en az 10 ml MACS tamponu ile yıkama hücreleri. </li><li> Santrifüj sırasında, 500 ul MACS tamponu ile bir mıknatıs yerleştirilen önceden soğutulmuş bir manyetik sütun dengeye. </li><li> (Hücre sayıları daha yüksek 1 x 10 8 bu hacim buna göre büyütmek) 500 ul MACS-tampon hücreleri yeniden süspanse ve kolona dikkatle hücreleri geçerlidir. Vδ1 içeren flow-through toplayın - hücrelerini. </li><li> 500 ul MACS tamponu ile sütun üç kez yıkayın ve aynı tüp içinde tekrar flow-through toplamak. Rezervuar kolona tampon uygulamadan önce boş olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Manyetik cihazdan sütun çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Hızlı bir şekilde sıkı bir şekilde sütuna pistonu iterek 1 ml MACS tamponu ile kolonu temizlemek. Bir tüp içinde eluat toplayın. NOT:&gt;% 98 bir saflığa elde etmek için, genellikle tekrar için gerekli olan ikinci bir sütun ile) 2.7-2.9 adımları tekrarlayın. </li><li> (2.1.2 bakınız) eskisi gibi antikor paneli ile FACS analizi 18 ile hücrelerin saflığını doğrulayın ve hücreleri saymak. </li></ol> Vδ1CD4 + T hücrelerinin 3. İzolasyon <ol><li> &gt; 30 saniye boyunca bir vorteks CD4 boncuk 25 ul yeniden süspanse edin. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirilmesi ile, 1.5 ml reaksiyon tüpünde 1 ml MACS tamponu boncuk (üretici tarafından gösterildiği gibi az miktarda) yıkayın. Küçük ölçekli bir pipet (200 ul) ile dikkatlice süpernatant atın ve MACS-tampon orijinal hacminin boncuk tekrar süspansiyon. </li><li> 1 için Vδ1 + hücreleri (santrifüj topaklaşmasına2 dk; ve) 300 xg&#39;de süpernatant aspirat ve 500 ul MACS-tamponu tüm Vδ1 + hücreleri tekrar süspansiyon ve boncuk içeren tüp ekleyebilirsiniz. Kuvvetli bir şekilde karıştırın ve (bir rotatör içine örneğin) sabit bir eğimlenme 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 2 dakika için bir mıknatıs hücreleri ihtiva eden tüp yerleştirin. Kapaktaki hiçbir kalıntıları olmadığından emin olun. Not: CD4 + hücreleri manyetik taneler bağlanmış ve mıknatısın bakan tüp yan eklemek olacaktır. </li><li> Bir küçük ölçekli pipet kullanarak Vδ1 + hücreler - dikkatle manyetik cihazın içindeki tüpü tutarak kapağı açın ve CD4 içeren süpernatant toplamak. Ayrı bir tüp içine Vδ1 + hücreleri ve nüfus CD4 hücreleri veya boncuk kalan muhtemelen önlemek için tekrar cazibe merkezi haline bu tüp yerleştirmek - CD4 yerleştirin. <ol><li> CD4 yıkayın - hücreleri, 5 ml MACS tamponu içinde (santrifüj 12 dakika boyunca, 300 xg da) and 100 ul ortam başına 1 x 10 5 hücre konsantrasyonunda bunları tekrar süspansiyon. CD4 - hücreler hali hazırda (4.2) aşağıda belirtilen koşullar altında kültive edilebilir. </li></ol></li><li> , Manyetik alanın dışında CD4 + hücre hedefleri ile tüp koyun 500 ul MACS-tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon ve manyetik cihazın içine geri koydu. Tekrarlayın daha yüksek bir saflık elde etmek için iki kez 3.3-3.5 adımları tekrarlayın. Pipetleme süpernatantı </li><li> 100 ul kültür ortamı CD4 + hücreleri (RPMI 1640,% 10 FCS,% 1 L-glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin) yeniden süspanse edin ve bir boncuk-ayırma çözeltisi 10 ul ekle. Sabit devirme (örneğin, bir rotatör içinde) ile birlikte 45 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1 dakika süre ile bir mıknatıs hücreleri yerleştirin. Dikkatle küçük ölçekli bir pipet kullanarak boncuk ücretsiz Vδ1 + CD4 + hücreleri içeren süpernatant toplamak. </li><li> Mıknatıs dışında, 100 ul kültür ortamı ve tekrar ile boncuklar tekrar süspansiyonCD4 + hücrelerinin yüksek hücre sayıları elde etmek için iki kez 3.6 ve 3.7 adımları tekrarlayın. </li><li> Hücreleri pellet&#39;leştirilmesi (12 dakika boyunca, 300 xg&#39;de santrifüj) ve pipetleme tamamen süpernatant atın. Taze, önceden ısıtılmış medya hücrelerin tekrar süspansiyon ve onları saymak. 2.1.1-2.1.3 adımda tasvir, FACS analizi ile Vδ1 + CD4 + hücrelerinin saflığı inceleyin. </li></ol> Sınırlı seyreltme ile 4. Tek hücreli Klonlama <ol><li> 1.1-1.6 tasvir edildiği gibi, bir allojenik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) izole edilir. </li><li> Γ-ışını kullanılan 25 ml kültür ortamı içinde 80 Gy ile 2.5 x 10 7 allojeneik PBMC&#39;ler ışın tedavisi. </li><li> , 96 oyuklu U-şekli plakalarında 5 x 10 4 besleyici bunları ışınlanmış besleyici hücreler IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) ve PHA (2 ug / ml) ilave edin ve dağıtma oyuk başına 50 ul hücre. </li><li> 50 ul başına 0,3 hücre konsantrasyonuna Vδ1 + CD4 + hücreleri ile seyreltilir. Pipette her bir oyuğa ışınlanmış hücreleri ve sitokinler barındıran hücre çözeltisi 50 ul. NOT: Bu nedenle, sitokinler 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 ve 1 ug / ml PHA nihai konsantrasyona kadar seyreltilir. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer içinde, bir kuluçka makinesi içinde, 96 gözlü levhalar inkübe edin. <ol><li> İsteğe bağlı olarak, klonlar aynı kültür koşulları altında dökme kültürü olarak Vδ1 + CD4 + hücreleri üzerinde saflaştırılmıştır kalan geliştirin. </li></ol></li><li> Sitokinler ve taze medya ile her 3-4 günde hücre kaynağı. Bunun için, pipetleme ile 50 ul taze ortam ile kuyu ortamın değişimi yarısı. Her takviyesine sitokinlerin 2 kat konsantrasyon ekleyin. Beslenme de her tur başına 5x10 4 ışınlanmış besleyici hücreler ekleyin. </li><li> Kültür ortamı ve form kolonilerinin rengini değiştirmek böylece metabolize olarak, ilk klon 3-4 hafta sonra görünür hale gözlemlemek ve bir mikroskop kullanarak. NOT: kürk içinther ekimi, iyi klon tekrar süspansiyon ve bunları, 96 gözlü levhalar ayrı aktarın. 2.1.1-2.1.3 belirtildiği gibi FACS yoluyla hücreleri analiz edin. Bu şartlar altında tutulmuştur klonlar nihayetinde αβTCR için Vδ1 kendi TCR değişebilir. Bu transdiferansiyonun için zaman noktası klonlamak için klon değişir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Pozitif manyetik hücre izolasyonu için Vδ1 ve CD4: kıt (T-) hücre varlığın fenotip, biyoloji ve işlevini incelemek için, yani Vδ1 + CD4 + T hücreleri, iki işaret kullanılır. CD4 monositler ve dendritik hücreler üzerinde daha düşük bir seviyede, T yardımcı hücreleri üzerinde ifade edilen ve hematopoietik progenitör hücreler üzerindeki çok düşük bir seviyede, oysa Vδ1, yetim reseptörüdür. Yüksek saflıkta hücrelerin zenginleştirilmesi ve seçim ...

Omurgalılarda, hücresel ve bağışıklığın bir hümoral bölümünde yapılandırılmıştır adaptif bağışıklık patojenlere karşı savunmasında önemli bir rol oynar. Antijenleri geniş bir tanıma, T hücreleri ile ilgili olarak timus 1 esas olarak üretilecek varsayılır hyperpolymorphic T ve B hücresi reseptörlerinin (TCR / BCR), aracılık eder. Bunun üzerine, kemik iliğinden elde edilen hematopoetik kök hücrelerin (HSC), timus tohum ve nihayet tüm T hücre soyları sebebiyet veren iyi tanımlanmış aşamaları boyunca ayırt. Ve CD8 - - Thymus ekim atalarıdır CD4 ve böylece olgunlaşmamış, çift negatif (DN) timosit kısmını oluşturmaktadır. Thymus türetilmiş sinyaller daha sonra soy bağlılığı ve αβ veya γδ T hücrelerinin içine ya farklılaşmasını teşvik. DN2 / 3 timositlerde fonksiyonel olarak yeniden düzenlenmiş TCR-γ ve TCR-δ zincir genlerinin sentezlenmesi selüler proliferasyon, bir sürücü δTCR kompleksleri, y olan yol açarγ ¨t hücrelerine 2,3 içine farklılaşmasını teşvik d. Buna karşılık, bir preTCR pT oluşturmak için preTα eşleştirmeden işlevsel TCR-β zincirinin yeniden düzenlenmesi, transkripsiyon DN3 timositlerde TCR-γ zincirinin susturulması ve CD4 + CD8 + çift pozitif timositleri 4 içine geçiş indükler . Bu aşamada, TCR-α zincirinin rekombinasyon ve böylece, bu hücrelerin geri dönülmez 5-9 üretim, bir γδTCR ortadan kaldıran, TCR-α lokusundaki sırtını TCR-δ lokusunu silme oluşur. Rearranged αβTCRs sonradan otoimmünitesini (negatif seçim) önlemek için belirli bir eşiği geçemez zayıf (pozitif seçimi) öz-MHC bağlanma yetenekleri için seçilir. MHC sınıf I veya II bağlama kapasitelerine göre, seçilen αβT hücreler tek-pozitif CD4 + veya CD8 + T hücreleri, timus çıkış naif T hücreleri dönüşür. Ancak, timus involusyonu erken neredeyse söndürülmüş sonrası ergenlik 10 naif T hücrelerinin katlanarak azaltılmış çıkış yol açan yaşam başlar. Bununla birlikte, T hücresi havuzunun büyüklüğü sonrası timik homeostatik T hücrelerinin çoğalması ve uzun ömürlü immünolojik bellek 11 proliferasyonu ile sadece kısmen açıklanabilir ömrü boyunca sabit kalır. Sonuç olarak, T-hücresi gelişimi extrathymic gerçekleşmelidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar-de extrathymic fonksiyonel αβ T hücrelerinin 12-17 yol siteleri-verdi αβT hücre atalarıdır, karakterize önemli cazibe kazanmıştır. Oysa, bir timus bağımsız αβT hücrelerine ayırt extrathymic αβT hücre öncüleri hakkında detaylı bilgi biz onlar böylece almak güzergahı üzerinde olan arka plan olarak bölük pörçük olduğunu. Biz son zamanlarda Vδ1 + küçük T-hücre varlık tespit </sup&gt; hafif inflamatuar ortamında αβT hücrelerine transdifferentiate sağlıklı insan vericilerden periferal kandan izole edilen bir extrathymic αβT hücre prognitor 18 olarak CD4 + γδT hücreleri. İlginç bir şekilde ve potansiyel olarak yeni antijenler kabul edilebilir, böylece bu şekilde, repertuarı genişleyen çeşitlilik sonrası timik T hücrelerinin proliferasyonu homeostatik, Vδ1 CD4 + hücrelerinin transdiferansiyonun yeni T hücre reseptörleri üreten, aksine ve koruma olabilir yeni alınan patojenlere karşı konakçı. Bu T hücrelerinin plastisite ekler ve extrathymic T hücre gelişimi için şimdiye kadar farkedilmemiş yeni yolu ekler. Amaç bu αβT hücresi extrathymic gelişimini precursor`s tetikleyen işaretleri ve molekülleri tanımlamak için lenfositik kaynaklardan niceliksel izolasyonu, tek hücre klonlarının oluşturulması ve etkin genişletme gereklidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biocoll Solution</td>
			<td style="width:93px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L 6113</td>
			<td style="width:361px;">lymphocyte separating solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing Buffer</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>lysis of erythrocytes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>supplement with BSA and pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human Vd1 FITC (clone:&#160; TS8.2)</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td>TCR2730</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>345766</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555548</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-333</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>641400</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Anti-FITC MultiSort Kit</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-058-701</td>
			<td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS columns</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CD4 Positive Isolation Kit</td>
			<td style="width:93px;">life technologies</td>
			<td>11331D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Timus, αβ T hücreleri ve omurgalılarda adaptif bağışıklık sisteminin omurgasının oluşturulması için primer organ uzun αβT hücrelerinin tek kaynak olarak kabul edilmiştir. Ancak, timik involüsyon çevresine naif αβT hücrelerinin büyük ölçüde azalır çıkış lider hayatında erken başlıyor. Yine de, hatta asırlık yeni alınan patojenlere karşı bağışıklık inşa edebilirsiniz. Son araştırmalar fonksiyonunun timus kaybını telafi edebilir yolların ancak bizim anlayış hala rudimental olan extrathymic αβT hücre gelişimini göstermektedir. γδ T hücreleri dokularda temel T-hücresi alt kümesi oluşturur doğuştan lenfositlerdir. Biz son zamanlarda göstererek bir γδ T hücre alt kümesine bir şimdiye kadar farkedilmemiş seçkin işlevi atfedilen o CD4 kıt varlık + Vδ1 + γδ T hücreleri inflamatuar koşullarda αβT hücrelerin içine transdifferentiate olabilir. Burada, biz pperiferik kandan bu dede izolasyonu ve sonraki ekimi için protokol rovide. Vδ1 hücreleri pozitif bir başka manyetik işaretleme tekniği ile CD4 + hücrelerinin az kısmını hedef olup, burada, bir ikinci aşamada, ardından manyetik boncuklar kullanılarak Sağlıklı insan donörlerden bir PBMC&#39;lerden zenginleştirilmiştir. İkinci etiketleme manyetik kuvvet ilk manyetik etiket biri aşıyor ve bu nedenle faiz nüfusunun, verimli nicel ve belirli olumlu izolasyonu sağlar. Daha sonra hücreler, klonlama ve verimli bir şekilde genişletilmesi için ve FACS analizi ile üretilmiştir klonlarının tespiti için gerekli olan teknik ve kültür durum getirmektedir. Böylece, saflaştırma, kültür ve CD4 + Vδ1 + γδ T hücrelerinin ex vivo artışı için detaylı bir protokol sağlar. Bu bilgi, bu αβT hücre progenitor`s biyoloji ile ilgili çalışmalara ve ide amaçlayan olanlar için ön koşuldurBunu transdiferansiyonun yer alan moleküler tetikler ntify.

Şekil 1, farklı aşamaları ve periferal kandan Vδ1 T hücrelerinin izolasyonu sonucunu göstermektedir. Şekil 1A, CD3 + lenfositler, Vδ1 + hücrelerinin tipik dağılımı, hem de Vδ1 + popülasyonunun ko-reseptör ifadesini gösterir. Bu donör olarak Vδ1 + hücreleri (kırmızı) sıklığı toplam lenfosit sayımları% 2.3 ve Vδ1 + lenfositlerin CD4 ifadesi (yeşil)% 2.6 olduğunu. Tamamen, izolasyon için hedef nüfusu ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÎ´1+CD4+Î³Î´ T Cells, an Extrathymic Î±Î²T-cell Progenitor at JoVE.com

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Görüntüleme.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...