Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Ethik Statement: Alle Verfahren wurden nach der Deklaration von Helsinki durchgeführt und wurden von der Klinischen Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt (Projekte 38 / 2009B02 und 470 / 2013B02). 1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) <ol><li> Nehmen Sie 50-100 ml von einem gesunden Freiwilligen über Venenpunktion unter Verwendung einer 50 ml Spritze mit 1.000 IE Heparinsulfat und verdünnt das Blut 1: 2 mit PBS (pH = 7,2). </li><li> Sorgfältig Schicht 35 ml Blut: PBS-Lösung auf 15 ml Bluttrennlösung wie Biocoll (d = 1,077 g / ml) in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren für 15 min bei 800 × g bei RT. HINWEIS: Brems dürfen nicht verwendet werden. </li><li> Sammeln der Zellen des lymphatischen Schicht mit einer Pipette und die Zellen werden zweimal in mindestens 50 ml PBS (Zentrifuge für 12 min; bei 400 xg). Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation mit einer Pipette. </li><li> Lyse verbleibenden Erythrozyten durch die Aussetzung und Incubtriebs lymphozytären Fraktion mit 1-5 ml eines hypotonischen Pufferlösung für 2-4 min. Hinweis: Dauer der Exposition und Volumen Lysepuffer hängen vom verwendeten Lysepuffer und auf die Menge der roten Blutzellen in der Lymphozytenfraktion gelassen. </li><li> Verdünnen der Zellen mit PBS (1,10) und zentrifugiert bei 250 g für 12 min und anschließend wieder zu suspendieren und wasche das Zellpellet einmal in 10 ml PBS bei 300 g für 12 min. </li><li> Resuspendieren der Lymphozyten in PBS und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer mit Trypanblau-Lösung. HINWEIS: In der Regel werden&gt; 1 x 10 8 Lymphozyten von 100 ml erhalten frisch gezapftes peripheren Blut. </li></ol> 2. Isolierung von T-Zellen Vδ1 <ol><li> Take &lt;1 x 10 6 isolierten Lymphozyten für zunächst FACS Bestimmung der Frequenz Vδ1 CD4-T-Zellen. HINWEIS: Populationsgröße dieser T-Zell-Unternehmen kann stark zwischen den Individuen und nach ihrem Immunstatus abweichen. TypicVerbündeter, etwa 1% der T-Zellen sind Vδ1 + und etwa 1-5% der Vδ1 + Zellen sind CD4 +. <ol><li> Verdünnen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer, der PBS, enthaltend 2% FCS und 5 mM EDTA besteht. Zentrifuge bei 660 xg für 2 Minuten und Dekantieren des Überstandes. Das Rücklaufvolumen von etwa 100 ul FACS-Puffer ausreichend ist für die anschließende Färbung. Vortexen und Inkubation der Zellen mit 5 &amp; mgr; Fc-Blocking-Reagenz für 5 min bei RT für erhöhte Spezifität des FACS-Färbung. </li><li> Hinzufügen menschliche monoklonale Antikörper direkt an die Zellen, ohne den Fc-Blocking-Reagenz. Stellen Sie sicher, um die Zellen mit Antikörpern gegen Vδ1 (1:50), CD 3 (1:50), CD4 (1: 200) zu färben, CD8 (1: 200) und TCRαβ (01.25). Bereiten Sie die Isotyp-Kontrolle mit den entsprechenden Immunglobulin-Isotypen. Inkubieren Zellen mit Antikörpern für 20 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer (Zentrifuge für 2 Minuten; bei 660 xg), dekantiert die supernatant und FACS Akquisition gehen in der verbleibenden Puffervolumen. </li></ol></li><li> Pelletisieren der Zellen durch Zentrifugation für 12 min (die nicht in der FACS-Analyse verwendet werden); bei 300 g; 8 ° C. Entfernen Sie den Überstand und Zell pelletin 60 &amp; mgr; l MACS-Puffer pro 1 x 10 7 Zellen. In 20 &amp; mgr; Fc-Blocking-Reagenz pro 1 x 10 7 Zellen und Inkubation für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l FITC-konjugierten anti-human Vδ1 Antikörper pro 1 x 10 7 Zellen direkt in die Zellen. Inkubation für 12 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 14 ml MACS-Puffer (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g; 8 ° C). Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der Zellen in 80 &amp; mgr; l MACS-Puffer pro 1x10 7 Zellen. </li><li> Nehmen 1-2 x 10 5 Zellen und verdünnte sie in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer für die Überprüfung der Markierung durch FACS-Analyse. Keine weiteren Zusätze sind für diesen Schritt benötigt wird. Stellen Sie sicher, dass es eine ausreiziente Differenz in der Helligkeit für Vδ1 - und Vδ1 + Zellen. Ist dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die Schritte 2.3) und 2.4). </li><li> In 20 ul Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 1 x 10 7 Zellen zu den übrigen Zellen, gut mischen und inkubieren für 15 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C. Danach die Zellen werden unter Verwendung von mindestens 10 ml MACS Puffer (Zentrifuge für 12 min, bei 300 g; 8 ° C). </li><li> Während der Zentrifugation äquilibrieren die in einem Magneten mit 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer platziert vorgekühltem Magnetspalte. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer (für die Zellzahlen höher als 1 x 10 8, Scale-up dieses Volumen entsprechend), und die Zellen anzuwenden vorsichtig auf die Säule. Sammeln Sie die Durchfluss mit dem Vδ1 - Zellen. </li><li> Dreimal Waschen der Säule mit 500 ul MACS-Puffer zu sammeln und das Durchfluss erneut in derselben Röhre. Beachten Sie, dass der Vorratsbehälter leer ist, bevor Puffer auf die Säule sein. </li><li> Entfernen Sie die Spalte aus der Magnetvorrichtung und legen Sie sie in einen 15 ml konischen Röhrchen. Spülen schnell die Säule mit 1 ml MACS-Puffer durch festes Drücken des Kolbens in der Spalte. Eluat in einem Rohr. HINWEIS: Um eine Reinheit von&gt; 98% zu erhalten, ist es üblicherweise notwendig, wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,9) mit einem zweiten Spalte. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der Zellen mittels FACS-Analyse 18 mit dem gleichen Antikörper-Panel wie zuvor (siehe 2.1.2) und zählen Sie die Zellen. </li></ol> 3. Isolierung Vδ1CD4 + T-Zellen <ol><li> Resuspendieren 25 ul CD4-Perlen mit einem Vortex für&gt; 30 Sek. Waschen der Kügelchen (die minimale Menge, wie vom Hersteller dargestellt) in 1 ml MACS-Puffer in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß, indem das Röhrchen in einem Magnet für 1 min. Überstand verwerfen vorsichtig mit einer kleinen Pipette (200 ul) und Resuspendieren der Beads in dem ursprünglichen Volumen der MACS-Puffer. </li><li> Pelletieren Vδ1 + Zellen (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g) und saugen Sie den Überstand und resuspendieren alle Vδ1 + Zellen in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer und fügen Sie sie in das Rohr, das die Perlen. Kräftig mischen und Inkubation für 20 min bei 4 ° C unter konstantem Neigungs (beispielsweise in einem Drehgelenk). </li><li> Das Röhrchen, das die Zellen in einem Magnet für 2 min. Stellen Sie sicher, dass es keine Reste im Deckel. HINWEIS: Die CD4 + -Zellen werden die magnetischen Perlen gebunden sind und heften sich an die Seite des Rohrs gegenüber dem Magneten. </li><li> Den Deckel vorsichtig öffnen, während der Schlauch in der Magneteinrichtung und sammeln Sie den Überstand, der die CD4 enthält - + Vδ1 Zellen unter Verwendung eines kleinen Pipetten. Platzieren CD4 - Vδ1 + Zellen in ein separates Röhrchen und setzen dieses Rohr in den Magneten wieder möglicherweise vermeiden verbleibenden CD4-Zellen oder Kügelchen, aus der Population. <ol><li> Waschen Sie die CD4 - Zellen in 5 ml MACS-Puffer (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g) and resuspendieren sie in einer Konzentration von 1 x 10 5 Zellen pro 100 &amp; mgr; l Medium. CD4 - Zellen können leicht unter den unten (4.2) gegebenen Bedingungen kultiviert werden. </li></ol></li><li> Das Röhrchen mit den CD4-Zell Ziele außerhalb des magnetischen Feldes, resuspendieren Zellen in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer und setzen Sie diese wieder in die Magnetvorrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,5 zweimal, um eine höhere Reinheit zu erhalten. Überstand entfernen durch Pipettieren </li><li> Resuspendieren der CD4 + -Zellen in 100 ul Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin) und füge 10 ul einer Wulst Ablöselösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min mit konstanter Kippen (beispielsweise in einem Drehgelenk). </li><li> Platzieren der Zellen in einem Magnet für 1 min. Sorgfältig sammeln Überstand, der Wulst freie Vδ1 + CD4 + Zellen unter Verwendung einer kleinen Pipette. </li><li> Außerhalb des Magneten, resuspendieren die Perlen mit 100 ul Kulturmedium, und wiederholen Siedie Schritte 3.6 und 3.7 zweimal höhere Zellzahlen von CD4 + Zellen zu erhalten. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen (bei 300 g zentrifugiert, für 12 min) und den Überstand verwerfen vollständig durch Pipettieren. Die Zellen in frischen, vorgewärmten Medien und zählen. Prüfung der Reinheit der Vδ1 + CD4 + Zellen durch FACS-Analyse in den Schritten 2.1.1-2.1.3 dargestellt. </li></ol> 4. Single-Zell-Klonen durch limitierte Verdünnung <ol><li> Isolieren peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einem allogenen Spender, wie in 1,1-1,6 dargestellt. </li><li> Bestrahlen 2,5 x 10 7 allogenen PBMCs mit 80 Gy in 25 ml Kulturmedium mit γ-Strahlung. </li><li> Hinzufügen IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) und PHA (2 ug / ml) zu den bestrahlten Feeder-Zellen und verteilen sie in 96-Well U-förmigen Platten, 5 x 10 4 feeder Zellen in 50 ul pro Vertiefung. </li><li> Verdünnt den Vδ1 + CD4 + Zellen zu einer Konzentration von 0,3 Zellen pro 50 ul. Pipette 50 ul der Zelllösung zu jeder Vertiefung beherbergen die bestrahlten Zellen und Cytokinen. Hinweis: So werden die Cytokine bis zu einer Endkonzentration von 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 und 1 ug / ml PHA verdünnt. Die 96-Well-Platten in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. <ol><li> Wahlweise kultivieren bleibt als Massenkultur unter den gleichen Kulturbedingungen wie die Klone gereinigt Vδ1 + CD4 + -Zellen. </li></ol></li><li> Liefern die Zellen alle 3-4 Tage mit Zytokinen und frische Medien. Hierzu Austausch Hälfte des Mediums in den Vertiefungen mit 50 &amp; mgr; l frisches Medium durch Pipettieren. In 2-fache Konzentration der Zytokine auf jede Ergänzung. In 5x10 4 bestrahlten Feeder-Zellen pro Vertiefung jeder anderen Runde der Fütterung. </li><li> Mit einem Mikroskop beobachten ersten Klone sichtbar nach 3-4 Wochen zu werden, wie sie verstoffwechseln und so ändern die Farbe des Kulturmediums und Kolonien bilden. HINWEIS: Pelzther Anbau, resuspendieren Klone gut und sie auf 96-Well-Platten zu trennen. Analysieren Sie die Zellen über FACS wie in 2.1.1-2.1.3 angezeigt. Klone unter diesen Bedingungen gehalten, kann schließlich ihren TCR von Vδ1 verändern αβTCR. Der Zeitpunkt für diese Transdifferenzierung ist von Klon zu Klon. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Um den Phänotyp, der Biologie und Funktion einer knappen (T-) Zell Einheit zu studieren, nämlich Vδ1 + CD4 + T-Zellen, verwendeten wir zwei Marker: Vδ1 und CD4 für seine positive magnetische Zellisolierung. Vδ1 ist ein Orphan-Rezeptor, während CD4 auf T-Helfer-Zellen exprimiert wird, auf einem niedrigeren Niveau auf Monozyten und dendritischen Zellen, und auf einem sehr niedrigen Niveau von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Techniken zur Anreicherung und Selektion von Zel...

Bei Wirbeltieren spielt adaptiven Immunität, die in der zellulären und humoralen Immunität Teil strukturiert ist, eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern. Die Erkennung von einer Vielzahl von Antigenen durch hyperpolymorphic T- und B-Zell-Rezeptoren (TCR / BCR), der in Bezug auf T-Zellen wird angenommen, dass vor allem im Thymus 1 produziert werden, vermittelt. Daran, hämatopoetische Stammzellen (HSC), aus dem Knochenmark, Samen der Thymus und Differenzierung entlang gut definierte Stadien schließlich, die zu allen T-Zell-Linien. Thymus Impfen Vorläuferzellen sind CD4 - und CD8 - und damit stellen die unreifen, doppelt negative (DN) Thymozyten Fraktion. Thymus-abgeleiteten Signale dann zu induzieren ihre Abstammung Engagement und die Differenzierung entweder in αβ bzw. γδ T-Zellen. Die Expression von funktionell neu arrangierte TCR-γ und δ TCR-Kettengene in DN2 / 3 Thymozyten zu δTCR Komplexe, die Zellproliferation eine Fahrt ggr;d Förderung der Differenzierung in γ &amp; dgr; T-Zellen 2,3. Im Gegensatz dazu ist die Umlagerung einer funktionellen TCR-β-Kette, die mit preTα koppeln kann, um eine preTCR pT aufzubauen, induziert die transkriptionalen Silencing des TCR-γ-Kette in DN3 Thymozyten und deren Übergang in CD4 + CD8 + doppelt positiven Thymozyten 4 . In diesem Stadium Rekombination des TCR-α-Kette auftritt, das Löschen der TCR-δ-Locus, die im TCR-α-Locus eingebettet, wodurch eine Aufhebung der Produktions γδTCR in diesen Zellen unwiderruflich 5-9. Umgeordnet αβTCRs werden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Selbst MHC schwach binden (positive Selektion), die einen bestimmten Schwellenwert nicht übersteigen darf, um Autoimmunerkrankungen (negative Selektion) vermeiden ausgewählt. Entsprechend ihren Möglichkeiten zu binden MHC-Klasse I oder II, entwickeln die ausgewählten αβT Zellen in Einzel positive CD4 + oder CD8 + T-Zellen, die Ausfahrt der Thymus als naive T-Zellen. , Rückbildung des Thymus beginnt jedoch schon früh im Leben, die zu exponentiell verringert Leistung von naiven T-Zellen, die fast erloschene Postadoleszenz 10 ist. Dennoch bleibt die Größe der T-Zell-Pools während des gesamten Lebens, die nur teilweise durch post-Thymus homöostatische Proliferation von T-Zellen und der Proliferation der langlebig immunologischen Gedächtnisses 11 erklärt werden kann, konstant. Folglich muss extrathymic T-Zell-Entwicklung auftritt. Die neuere Forschung hat erhebliche Anziehungskraft, die αβT Vorläuferzellen, die bei extrathymic-sites-verursachte Funktions αβ T-Zellen 12-17 gekennzeichnet gewonnen. Dennoch ist detailliertes Wissen über extrathymic αβT Vorläuferzellen, die aus einem Thymus-unabhängige differenzieren sich in αβT Zellen als fragmentarisch wie der Hintergrund, dass wir auf dem Weg, den sie so zu nehmen. Vor kurzem haben wir das kleine T-Zellen-Einheit der Vδ1 + identifiziert </sup&gt; CD4 + Zellen γδT als extrathymic αβT Zell prognitor 18, die, wenn sie aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern isoliert in einem milden entzündlichen Umgebung in αβT Zellen transdifferen. Interessanter und entgegen der homöostatischen Proliferation von post-Thymus-T-Zellen, Transdifferenzierung Vδ1 CD4 + Zellen generiert neue T-Zell-Rezeptoren, wodurch die Erweiterung des Repertoires Diversität, so dass potentiell neuer Antigene erkannt werden, und kann den Schutz des Wirtes gegen neu erworbenen Erregern. Dies trägt zur Plastizität von T-Zellen und fügt eine bisher unbeachtet neuen Weg für extrathymic T-Zell-Entwicklung. Die quantitative Isolierung von lymphatischer Quellen, die Erzeugung von Einzelzellklonen und deren effiziente Expansion sind wesentlich für das Ziel, jene Marker und Moleküle, die diese auslösen αβT Zell precursor`s extrathymic Entwicklung zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biocoll Solution</td>
			<td style="width:93px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L 6113</td>
			<td style="width:361px;">lymphocyte separating solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing Buffer</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>lysis of erythrocytes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>supplement with BSA and pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human Vd1 FITC (clone:&#160; TS8.2)</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td>TCR2730</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>345766</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555548</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-333</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>641400</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Anti-FITC MultiSort Kit</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-058-701</td>
			<td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS columns</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CD4 Positive Isolation Kit</td>
			<td style="width:93px;">life technologies</td>
			<td>11331D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Thymus, das wichtigste Organ für die Erzeugung von αβ-T-Zellen und das Rückgrat des adaptiven Immunsystems bei Wirbeltieren, ist seit langem als die einzige Quelle von αβT Zellen berücksichtigt. Dennoch beginnt Thymusinvolution im Leben, die zu einer drastisch reduzierten Leistung von naiven αβT Zellen in die Peripherie zu früh. Dennoch können sogar Hundertjährigen Immunität gegen neu erworbenen Erreger aufzubauen. Jüngste Untersuchungen legen nahe extrathymic αβT Zellentwicklung, aber unser Verständnis der Signalwege, die für Thymus-Funktionsverlust kompensieren kann immer noch rudimentär. γδ T-Zellen sind angeboren Lymphozyten, die den Haupt T-Zell-Untergruppe in den Geweben dar. Wir haben vor kurzem eine bisher unbeachtet herausragende Funktion zu einem γδ T-Zell-Untergruppe zugeschrieben durch die zeigen, dass die knappe Einheit von CD4 + Vδ1 + γδ T-Zellen können in αβT Zellen in entzündlichen Erkrankungen transdifferen. Hier haben wir provide das Protokoll für die Isolierung dieser Progenitorzellen aus dem peripheren Blut und die anschließende Kultivierung. Vδ1 Zellen positiv von PBMCs von gesunden menschlichen Spendern unter Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert, gefolgt von einem zweiten Schritt, bei dem man gezielt die knappen Fraktion von CD4 + Zellen mit einem weiteren magnetischen Markierungstechnik. Die Magnetkraft der zweiten Kennzeichnung der als einer der ersten magnetischen Etiketten überschreitet, und ermöglicht die effiziente, quantitative und spezifische positive Isolation der Population von Interesse so. Danach führen die Technik und die Kulturbedingungen für die Klonierung und effizient Expansion der Zellen und zur Identifizierung der erzeugten Klone mittels FACS-Analyse erforderlich. Somit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Reinigung, die Kultur und ex vivo Expansion von CD4 + Vδ1 + γδ T-Zellen. Dieses Wissen ist Voraussetzung für Studien, die zu dieser αβT Zell progenitor`s Biologie beziehen, und für diejenigen, die ide Zielntify die molekularen Auslöser, die in ihrer Transdifferenzierung beteiligt sind.

Figur 1 zeigt die verschiedenen Schritte und das Ergebnis der Trennung der Vδ1 T-Zellen aus dem peripheren Blut. 1A zeigt eine typische Verteilung der Vδ1 + Zellen CD3 + Lymphozyten, sowie die Co-Rezeptor die Expression des Vδ1 + -Population. In diesem Spender, ist die Frequenz der Vδ1 + Zellen (rot) 2,3% des Gesamtlymphozytenzahl und der CD4-Expression (grün) der Vδ1 + Lymphozyten beträgt 2,6%. Insgesamt ist die Zielgruppe f...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Aufrufe.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Serie: Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...