Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Declaração de ética: Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Clínica da Universidade de Tübingen (projetos 38 / 2009B02 e 470 / 2013B02). 1. Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) <ol><li> Tome 50-100 ml de um voluntário saudável por meio de venipunctura usando uma seringa de 50 ml contendo 1000 UI de heparina e sulfato de diluir o sangue 1: 2 com PBS (pH = 7,2). </li><li> Camada cuidadosamente 35 ml de sangue em solução de PBS: solução de separação de 15 ml de sangue, tais como Biocoll (d = 1,077 g / ml) num tubo de 50 ml. Centrifugar durante 15 minutos a 800 xg à temperatura ambiente. NOTA: O freio não deve ser utilizado. </li><li> Recolher as células da camada linfocítica com uma pipeta e lava-se as células duas vezes em, pelo menos, 50 ml de PBS (centrifuga-se durante 12 min; a 400 xg). Remover o sobrenadante após centrifugação com uma pipeta. </li><li> Lyse restantes eritrócitos por suspensão e incubAting a fracção linfocítica com 1-5 ml de uma solução tampão hipotónico para 2-4 min. NOTA: A duração da exposição e do volume de tampão de lise dependem do tampão de lise utilizada e a quantidade de glóbulos vermelhos restantes na fracção de linfócitos. </li><li> Dilui-se as células com PBS (1:10) e centrifugar a 250 xg durante 12 min e, subsequentemente, lavar e ressuspender o sedimento de células uma vez em 10 ml de PBS a 300 xg durante 12 min. </li><li> Ressuspender os linfócitos em PBS e contar as células numa câmara de contagem Neubauer usando solução azul de Tripano. NOTA: Normalmente,&gt; 1 x 10 8 a partir de linfócitos são recebidos 100 ml recentemente tirado sangue periférico. </li></ol> 2. Isolamento de Células T Vδ1 <ol><li> Take &lt;1 x 10 6 linfócitos isolados por um período inicial de FACS que determinam a frequência de células T CD4 Vδ1. NOTA: O tamanho da população desta entidade de células T podem diferir muito entre os indivíduos e de acordo com seu estado imunológico. Neossoloaliado, cerca de 1% das células T são Vδ1 + e cerca de 1-5% de células T CD4 + são Vδ1 +. <ol><li> Dilui-se as células com 1 ml de FACS-tampão, que consiste em PBS contendo FCS a 2% e EDTA 5 mM. Centrifugar a 660 xg durante 2 minutos e decantar o sobrenadante. O volume de tampão de FACS de refluxo cerca de 100 ul é suficiente para a coloração subsequente. Resumidamente vórtex e incubar as células com 5 ul de reagente de Fc-bloqueio durante 5 min à TA, durante o aumento da especificidade da coloração FACS. </li><li> Adicionar anticorpos monoclonais humanos directamente para as células sem remover o reagente de bloqueio de Fc. Certifique-se de corar as células com anticorpos contra Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) e TCRαβ (01:25). Prepara-se o controlo do isotipo de imunoglobulina com as correspondentes isotipos. Incubar as células com anticorpos durante 20 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lave as células em 1 ml de tampão FACS (centrifugar por 2 min; a 660 xg), decantar o supernatant e proceder à aquisição FACS no volume tampão restante. </li></ol></li><li> Peletizar as células (que não são utilizadas na análise de FACS) por centrifugação durante 12 min; a 300 g; 8 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender a célula pelletin 60 ul MACS-tampão por 1 x 10 7 células. Adiciona-se 20 de Reagente de Bloqueio-Fc? L por 1 x 10 7 células e incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de anticorpo anti-humano Vδ1 conjugado com FITC por 1 x 10 7 células directamente para as células. Incubar durante 12 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células utilizando 14 mL de tampão-MACS (centrifuga-se durante 12 min; a 300 g; 8 ° C). Elimine o sobrenadante completamente e voltar a suspender as células em MACS tampão 80 ul por 1x10 7 células. </li><li> Tome 1-2 x 10 5 células e diluí-los em tampão FACS 100 ul para verificação da rotulagem por análise FACS. Não são necessários outros aditivos para este passo. Certifique-se de que existe um suficient diferença no brilho para Vδ1 - e células Vδ1 +. Se este não for o caso, repetir os passos 2.3) e 2.4). </li><li> Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC por 1 x 10 7 células para as células restantes, misturar bem e incubar durante 15 min no escuro a 4 ° C. Em seguida, lavar as células utilizando MACS ml de tampão de pelo menos 10 (centrifuga-se durante 12 min, a 300 xg; 8 ° C). </li><li> Durante a centrifugação, equilibrar a coluna magnética pré-arrefecida em um íman colocado com 500 ul de tampão MACS. </li><li> Ressuspender as células em 500 ul MACS-tampão (para o número de células maior do que 1 x 10 8, adaptar-se de acordo com este volume) e aplicam-se as células cuidadosamente na coluna. Recolher o flow-through contendo a Vδ1 - células. </li><li> Lava-se a coluna três vezes com 500 ul de tampão-MACS e recolher o fluxo de passagem de novo no mesmo tubo. Note-se que o reservatório tem de estar vazia antes da aplicação na coluna de tampão. </li><li> Remova a coluna do dispositivo magnético e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml. Rapidamente lavar a coluna com tampão de 1 ml por MACS firmemente empurrando o êmbolo para a coluna. Recolher o eluído num tubo. NOTA: De modo a obter um grau de pureza&gt; 98%, é geralmente necessário repetir os passos de 2,7-2,9) com uma segunda coluna. </li><li> Verifique a pureza das células por análise de FACS 18 com o mesmo painel de anticorpos, como anteriormente (ver 2.1.2) e contar as células. </li></ol> 3. Isolamento de Células T + Vδ1CD4 <ol><li> Ressuspender 25 ul de pérolas de CD4 com um vortex para&gt; 30 seg. Lavar as pérolas (a quantidade mínima como descrito pelo fabricante) em 1 ml de tampão de MACS em um tubo de 1,5 ml de reacção, colocando o tubo num íman durante 1 min. Descartar o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta de pequena escala (200 mL) e ressuspender as esferas no volume original de tampão-MACS. </li><li> Pelotizar Vδ1 + células (centrifugar por 12 min; a 300 xg) e aspirar o sobrenadante e ressuspender as células todas Vδ1 + em 500 ul de tampão-MACS e adicioná-los para o tubo contendo os grânulos. Misturar vigorosamente e incubar durante 20 min a 4 ° C com inclinação constante (por exemplo, em um rotor). </li><li> Colocar o tubo contendo as células em um magnete durante 2 min. Certifique-se de que não existem vestígios na tampa. NOTA: As células T CD4 + terá ligado a esferas magnéticas e anexar ao lado do tubo virado para o íman. </li><li> Abra cuidadosamente a tampa, mantendo o tubo no interior do dispositivo magnético e recolher o sobrenadante que contém o CD4 - células Vδ1 + utilizando uma pipeta de pequena escala. Coloque - CD4 + Vδ1 células para um tubo separado e colocar este tubo para o íman de novo para evitar possivelmente remanescente células CD4 ou grânulos a partir da população. <ol><li> Lava-se a CD4 - células em 5 ml de tampão-MACS (centrifuga-se durante 12 min; a 300 xg) umND ressuspender-los em uma concentração de 1 x 10 5 células por 100 uL meios. - Células CD4 pode ser facilmente cultivado sob as condições dadas abaixo (4.2). </li></ol></li><li> Colocar o tubo com os alvos de células CD4 + fora do campo magnético, ressuspender as células em 500 ul de tampão-MACS e colocá-los de volta para dentro do dispositivo magnético. Repita duas vezes os passos de 3,3-3,5 para obter uma pureza mais elevada. Remover o sobrenadante por pipetagem </li><li> Ressuspender as células CD4 + em meio de cultura 100 ul (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina) e adicionar 10 ul de uma solução destacando-grânulo. Incubar à temperatura ambiente durante 45 min com inclinação constante (por exemplo, em um rotor). </li><li> Colocar as células em um íman durante 1 min. Recolher cuidadosamente o sobrenadante contendo Vδ1 células CD4 + livre-talão com uma pipeta de pequena escala. </li><li> Fora do ímã, voltar a suspender as contas com meios de cultura de 100 ul e repitaos passos 3.6 e 3.7 por duas vezes para se obter números maiores de células de células CD4 +. </li><li> Peletizar as células (centrifugar a 300 xg, durante 12 minutos) e descartar o sobrenadante completamente por pipetagem. Ressuspender as células em meios frescos, pré-aquecido e contá-los. Examinar a pureza das células CD4 + Vδ1 por análise FACS descritos nos passos 2.1.1-2.1.3. </li></ol> A clonagem de células 4. Único por diluição limitada <ol><li> Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de um dador alogénico como representado na 1,1-1,6. </li><li> Irradiar 2,5 x 10 7 PBMC alogénicas com 80 Gy em 25 ml de meio de cultura utilizando-γ radiação. </li><li> Adicionar IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) e PHA (2 ug / ml) para as células de alimentação irradiadas e distribuí-los em placas de 96 poços formato U, 5 x 10 4 alimentador células em 50 ul por poço. </li><li> Diluir as células Vδ1 CD4 + a uma concentração de 0,3 células por 50 ul. Pipette 50 ul de solução de células em cada cavidade que abriga as células irradiadas e citocinas. NOTA: Assim, as citocinas são diluídas para a concentração final de 100 U / ml de IL-2, 10 ng / ml de IL-7 e 1 ug / ml de PHA. Incubar as placas de 96 cavidades em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 atmosfera humidificada. <ol><li> Opcionalmente, permanecendo cultivar células purificadas Vδ1 + CD4 + como a cultura em massa sob as mesmas condições de cultura como os clones. </li></ol></li><li> Fornecer as células a cada 3-4 dias com citocinas e meios frescos. Para isso, a troca de metade do meio nos poços com 50 ul de meio fresco por pipetagem. Adicionar concentração duas vezes superior de citoquinas para cada suplementação. Adicionar 5x10 4 células de alimentação irradiadas por poço qualquer outra rodada de alimentação. </li><li> Utilizando um microscópio, observar primeiros clones tornam-se visíveis após 3-4 semanas, como eles metabolizam e, assim, alterar a cor das colónias de meio de cultura e forma. NOTA: Para pelesterap cultivo, ressuspender os clones bem e transferi-los para separar placas de 96 poços. Analisar as células via FACS, conforme indicado na 2.1.1-2.1.3. Clones mantidos nestas condições poderá vir a alterar a sua TCR a partir Vδ1 para αβTCR. O ponto de tempo para esta transdiferenciação varia de clone para clonar. </li></ol>

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	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Para estudar o fenótipo, biologia e função de uma entidade celular escassos (T-), nomeadamente células Vδ1 + T CD4 +, foram utilizados dois marcadores: Vδ1 e CD4 por seu isolamento de células magnético positivo. Vδ1 é um receptor órfão, enquanto que CD4 é expresso em células T auxiliares, a um nível inferior em monócitos e células dendríticas, e a um nível muito baixo em células progenitoras hematopoiéticas. As técnicas para o enriquecimento e a selecção de...

Nos vertebrados, a imunidade adaptativa, que está estruturado na celular e uma parte humoral da imunidade desempenha um papel importante na defesa contra agentes patogénicos. O reconhecimento de uma vasta gama de antigénios é mediada por T-hyperpolymorphic e receptores de células B (TCR / BCR), que diz respeito às células T são assumidos para ser produzida principalmente no timo 1. A esta, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs), derivadas de medula óssea, o timo sementes e se diferenciam ao longo de etapas bem definidas, finalmente, que dão origem a todas as linhagens de células T. Timo progenitores de semeadura são CD4 - e CD8 - e constituem, assim, a fração de timócitos imaturos, dupla negativa (DN). Sinais derivados do timo, em seguida, induzir a sua linhagem compromisso e a diferenciação em células T, quer ap ou γδ. A expressão de TCR e TCR-y-ô genes das cadeias funcionalmente rearranjados em DN2 / 3 timócitos leva a y δTCR complexos, que levam uma proliferação celulard promover a diferenciação em células γ AT 2,3. Em contraste, o rearranjo de uma cadeia de TCR-β funcional, que pode emparelhar com preTα para construir um preTCR Pt, induz o silenciamento transcricional da cadeia TCR-γ em timócitos DN3 e a sua passagem em células CD4 + CD8 + duplo-positivos timócitos 4 . Nesta fase, a recombinação da cadeia TCR-α ocorre, a exclusão do locus TCR-δ que se aninha no interior do locus TCR-α, revoga assim a produção de um γδTCR nestas células irrevogavelmente 5-9. ΑβTCRs reorganizados são posteriormente seleccionados pela sua capacidade de se ligar a auto-MHC fracamente (seleção positiva), que não pode exceder um determinado limiar para evitar a auto-imunidade (seleção negativa). De acordo com a sua capacidade de se ligar a MHC de classe I ou II, as células seleccionadas αβT desenvolvem em células de um único positivo CD4 + ou T CD8 +, que a saída do timo células T como naive. No entanto, a involução do timo começa cedo na vida levando a exponencialmente reduziu a produção de células T naive que é quase extinto pós-adolescência 10. No entanto, o tamanho do conjunto de células T permanece constante durante toda a vida, o que pode ser explicado apenas parcialmente por uma proliferação homeostática pós-timo de células T e a proliferação de memória imunológica de longa duração 11. Por conseguinte, o desenvolvimento de células T extrathymic deve ocorrer. Uma pesquisa recente ganhou atração substancial que caracterizou progenitores de células, que αβT-at-extrathymic locais deram origem às células T ap funcional 12-17. No entanto, o conhecimento detalhado sobre precursores de células extrathymic αβT que independente de um timo diferenciam em células αβT é tão fragmentado como o fundo que nós temos na rota tomam assim. Recentemente, identificou a entidade pequeno de células T de Vδ1 + </sup&gt; células T CD4 + como uma αβT γδT prognitor extrathymic célula 18, a qual, quando isolados a partir de sangue periférico de dadores humanos saudáveis, podem transdiferenciar em células αβT num ambiente inflamatório leve. Curiosamente e ao contrário da proliferação homeostática de células T pós-timo, transdiferenciação de células Vδ1 CD4 + gera novos receptores de células T, ampliando assim a diversidade repertório, de modo que, potencialmente, novos antígenos podem ser reconhecidas e podem protecção do hospedeiro contra patógenos recém-adquiridas. Isso aumenta a plasticidade das células T e adiciona um novo caminho até agora pouco apreciado para o desenvolvimento de células T extrathymic. O isolamento quantitativo a partir de fontes linfocítica, a geração de clones de uma única célula e sua expansão eficiente são essenciais para o objectivo de identificar os marcadores e moléculas que desencadeiam essa célula αβT precursor`s desenvolvimento extrathymic.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

O timo, o órgão primário para a geração de células T e ap espinha dorsal do sistema imune adaptativa em vertebrados, tem sido considerada como a única fonte de células αβT. No entanto, a involução do timo começa no início da vida que conduz a uma saída drasticamente reduzido de células αβT naive para a periferia. No entanto, mesmo centenários pode construir a imunidade contra patógenos recém-adquiridas. Uma pesquisa recente sugere o desenvolvimento de células αβT extrathymic, no entanto a nossa compreensão das vias que podem compensar a perda da função do timo são ainda rudimentar. γδ células T são os linfócitos inatos que constituem o principal subconjunto de células T nos tecidos. Recentemente atribuída uma função notável, até agora não apreciado a um subconjunto de células T γδ, mostrando que a entidade escasso de células CD4 + Vδ1 + γδ células T podem transdiferenciar em células αβT em condições inflamatórias. Aqui, nós provide o protocolo para o isolamento do presente progenitoras do sangue periférico e o seu cultivo subsequente. Vδ1 células são enriquecidas a partir de PBMC positivamente de dadores humanos saudáveis ​​usando esferas magnéticas, seguido por um segundo passo em que temos como alvo a fracção escasso de células CD4 + com uma outra técnica de marcação magnética. A força magnética do segundo rótulo for superior a da primeira etiqueta magnética, e assim permite o isolamento positivo eficiente, quantitativa e específico da população de interesse. Em seguida, introduzir o estado da técnica e da cultura requerido para a clonagem eficiente e expansão das células e para a identificação dos clones gerados por análise de FACS. Assim, nós fornecemos um protocolo detalhado para a purificação, a cultura e expansão ex vivo de células T γδ CD4 + Vδ1 +. Este conhecimento é pré-requisito para estudos relacionados a esse αβT progenitor`s celulares biologia e para aqueles que pretendem identify os gatilhos moleculares que estão envolvidos na sua transdiferenciação.

A Figura 1 ilustra as diferentes fases e o resultado do isolamento das células T Vδ1 do sangue periférico. Figura 1A mostra uma distribuição típica das células Vδ1 + em linfócitos CD3 +, bem como a expressão do co-receptor da população Vδ1 +. Neste dador, a frequência de células Vδ1 + (vermelho) é de 2,3% das contagens totais de linfócitos e a expressão de CD4 (verde) de linfócitos Vδ1 + é de 2,6%. No total, a ...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K visualizações.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Vídeo: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biologia

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Imunologia e Infecção

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Pesquisa do câncer

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagem de alta resolução para detecção de microdomínios de Ca2+ em células T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a ativação inicial da resposta imune adaptativa para intervenção terapêutica

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Isolamento e

Resumo

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Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

Derivação de células T

Rato Naïve CD4

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Imagem de microdomínios iniciais de Ca²⁺ em células T primárias

Imagem de microdomínios iniciais de Ca²⁺ em células T primárias