Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

بيان أخلاقيات: تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في جامعة توبنغن (المشاريع 38 / 2009B02 و 470 / 2013B02). 1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 50-100 مل من المتطوعين الأصحاء عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 50 مل تحتوي على 1000 وحدة دولية الهيبارين كبريتات وتمييع الدم 1: 2 مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة بعناية 35 مل من الدم: حل PBS على حل فصل 15 ملليتر دم مثل Biocoll (د = 1.077 جم / مل) في 50 مل المخروطية أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 800 x ج في RT. ملاحظة: الفرامل يجب ألا تستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا من طبقة الليمفاوي مع ماصة وغسل الخلايا مرتين في لا يقل عن 50 مل PBS (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 400 x ج). إزالة طاف بعد الطرد المركزي مع ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز المتبقية خلايا الدم الحمراء من خلال تعليق وincubأثناء التشغيل جزء الليمفاوي مع 1-5 مل من محلول العازلة منخفض التوتر لمدة 2-4 دقيقة. ملاحظة: مدة التعرض وحجم الناشر عازلة تعتمد على المخزن المؤقت الناشر المستخدمة وعلى كمية من خلايا الدم الحمراء اليسار في جزء اللمفاويات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا مع PBS (01:10) وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 12 دقيقة وبعد ذلك و resuspend ويغسل بيليه الخلايا مرة واحدة في 10 مل PBS في 300 x ج لمدة 12 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والخلايا الليمفاوية في برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا في غرفة الفرز نويباور باستخدام التريبان حل الأزرق. ملاحظة: عادة، يتم استلام&gt; 1 × 10 8 الخلايا الليمفاوية من 100 مل ضعت حديثا الدم المحيطي. </li></ol> 2. عزل خلايا T Vδ1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ &lt;1 × 10 6 الخلايا الليمفاوية المعزولة لFACS الأولية تحديد وتيرة خلايا CD4 T Vδ1. ملاحظة: حجم سكان هذا الكيان T-الخلية قد تختلف اختلافا كبيرا بين الأفراد وفقا لحالتهم المناعية. Typicحليف، وحوالي 1٪ من خلايا T هي Vδ1 + وحوالي 1-5٪ من Vδ1 + CD4 + الخلايا هي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا مع 1 مل FACS العازلة، والذي يتألف من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FCS و 5 ملي EDTA. أجهزة الطرد المركزي في 660 x ج لمدة 2 دقيقة وصب طاف. حجم الجزر حوالي 100 ميكرولتر FACS العازلة كافية لتلطيخ لاحقة. دوامة لفترة وجيزة واحتضان الخلايا مع 5 ميكرولتر FC-حجب الكاشف لمدة 5 دقائق على RT لزيادة خصوصية تلطيخ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الاجسام المضادة الإنسان مباشرة إلى الخلايا دون إزالة كاشف الحظر لكرة القدم. تأكد من وصمة عار على الخلايا مع أجسام مضادة ضد Vδ1 (01:50)، CD3 (01:50)، CD4 (1: 200)، CD8 (1: 200) وTCRαβ (01:25). إعداد isotype السيطرة مع isotypes المناعي المقابلة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في 1 مل FACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة، في 660 x ج)، صب supernatant، والشروع في اكتساب FACS في حجم العازلة المتبقية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلتيز الخلايا (التي لا يتم استخدامها في تحليل FACS) بواسطة الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة. في 300 غرام؛ 8 ° C. إزالة طاف و resuspend الخلية pelletin 60 ميكرولتر MACS العازلة لكل 1 × 10 7 الخلايا. إضافة 20 ميكرولتر حجب التيسير الكاشف لكل 1 × 10 7 الخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر FITC مترافق الأجسام المضادة Vδ1 مكافحة الإنسان في 1 × 10 7 الخلايا مباشرة إلى الخلايا. احتضان لمدة 12 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا باستخدام 14 مل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 غرام؛ 8 ° C). تجاهل طاف تماما وresuspend الخلايا في 80 ميكرولتر MACS العازلة في 1X10 7 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 1-2 × 10 5 خلايا وتمييع لهم في 100 ميكرولتر FACS العازلة للتحقق من وضع العلامات من خلال تحليل FACS. وهناك حاجة إلى أي إضافات أخرى لهذه الخطوة. تأكد أن هناك suffiالفرق cient في سطوع لVδ1 - والخلايا Vδ1 +. إذا لم تكن هذه هي الحالة، كرر الخطوات من 2.3) و 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر بلي لمكافحة FITC في 1 × 10 7 الخلايا إلى الخلايا المتبقية، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، وغسل الخلايا باستخدام 10 مل على الأقل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 x ج، 8 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الطرد المركزي، تتوازن العمود المغناطيسي تبرد قبل وضعها في مغنطيس مع MACS 500 ميكرولتر العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة (للأرقام الخلية أعلى من 1 × 10 8، توسيع نطاق هذا الكتاب وفقا لذلك) وتطبيق خلايا بعناية على العمود. جمع من خلال تدفق تحتوي على Vδ1 - الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر MACS العازلة وجمع من خلال تدفق مرة أخرى في نفس الأنبوب. لاحظ أن الخزان يجب أن تكون فارغة قبل تطبيق عازلة على العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العمود من الجهاز المغناطيسي ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل. تدفق بسرعة العمود مع 1 مل MACS العازلة عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود. جمع شطافة في أنبوب. ملاحظة: من أجل الحصول على نقاء&gt; 98٪، فإنه عادة ما يكون من الضروري تكرار الخطوات 2،7-2،9) مع العمود الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من نقاء الخلايا عن طريق تحليل FACS 18 مع نفس الفريق الضد كما كان من قبل (انظر 2.1.2) وعدد الخلايا. </li></ol> 3. عزل Vδ1CD4 + T الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend 25 ميكرولتر من الخرز CD4 مع دوامة ل&gt; 30 ثانية. تغسل حبات (الحد الأدنى كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة) في 1 مل MACS العازلة في أنبوب 1.5 مل رد فعل عن طريق وضع أنبوب إلى المغناطيس لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف بعناية مع ماصة صغيرة الحجم (200 ميكرولتر) و resuspend الخرز في حجم الأصلي للMACS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلتيز Vδ1 خلايا + (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة. في 300 x ج) ونضح طاف و resuspend كل Vδ1 + الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة وإضافتها إلى أنبوب يحتوي على حبات. مزيج بقوة واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية مع إمالة ثابتة (على سبيل المثال، في المدورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا في مغناطيس لمدة 2 دقيقة. تأكد من عدم وجود أي بقايا في الغطاء. ملاحظة: خلايا CD4 + وربطت حبات مغناطيسية ونعلق على جانب الأنبوب تواجه المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح بعناية الغطاء مع الحفاظ على أنبوب داخل الجهاز المغناطيسي وجمع طاف التي تحتوي على CD4 - Vδ1 + الخلايا باستخدام ماصة على نطاق صغير. وضع CD4 - Vδ1 + خلايا في أنبوب منفصل ووضع هذا الأنبوب إلى المغناطيس مرة أخرى لتجنب ربما تبقى خلايا CD4 أو حبات من السكان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل CD4 - الخلايا في 5 مل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 x ج) لالثانية و resuspend لهم في تركيز 1 × 10 5 خلايا لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام. CD4 - خلايا يمكن زراعتها بسهولة تحت ظروف معينة أقل من (4.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب مع أهداف خلية CD4 + خارج الحقل المغناطيسي للأرض، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة ووضعها مرة أخرى في الجهاز المغناطيسي. كرر الخطوات من 3،3-3،5 مرتين للحصول على نقاء أعلى. إزالة طاف قبل pipetting </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وCD4 + الخلايا في 100 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة (RPMI 1640، 10٪ FCS، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) وإضافة 10 ميكرولتر من حل فصل حبة. في احتضان RT لمدة 45 دقيقة مع إمالة ثابتة (على سبيل المثال، في المدورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا في المغناطيس لمدة 1 دقيقة. جمع بعناية طاف تحتوي على Vδ1 + CD4 + الخلايا الحرة حبة باستخدام ماصة على نطاق صغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج المغناطيس، resuspend والخرز مع وسائل الإعلام الثقافة 100 ميكرولتر وتكرارخطوات 3.6 و 3.7 ضعف للحصول على أرقام الخلية أعلى من خلايا CD4 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلتيز الخلايا (أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 12 دقيقة) وتجاهل طاف تماما من قبل pipetting. الخلايا resuspend في والإعلام قبل حرارة الطازجة والاعتماد عليها. فحص نقاء Vδ1 + CD4 + الخلايا عن طريق تحليل FACS يصور في الخطوات 2.1.1-2.1.3. </li></ol> استنساخ 4. وحيدة الخلية التي كتبها المحدودة التخفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) من متبرع خيفي كما هو مبين في 1،1-1،6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق 2.5 × 10 7 PBMCs خيفي مع 80 غراي في 25 مل سائل الإعلام والثقافة باستخدام جاما للإشعاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة IL-2 (200 U / مل)، IL-7 (20 نانوغرام / مل)، وجمعية المستشفيات الخاصة (2 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا المغذية المشع وتوزيعها في لوحات 96-جيدا U-النموذج، 5 × 10 4 التغذية الخلايا في 50 ميكرولتر لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا Vδ1 + CD4 + إلى تركيز 0.3 خلايا في 50 ميكرولتر. الماصةالشركة المصرية للاتصالات 50 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل بئر بإيواء الخلايا المعرضة للإشعاع والسيتوكينات. ملاحظة: وهكذا، وتضعف السيتوكينات إلى تركيز النهائي من 100 U / مل IL-2، 10 نانوغرام / مل IL-7 و 1 ميكروغرام / مل PHA. احتضان لوحات 96-جيدا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 مرطب الجو. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، زراعة المتبقية تنقية Vδ1 + CD4 + الخلايا كثقافة الأكبر في ظل نفس الظروف الثقافة باعتبارها الحيوانات المستنسخة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزويد خلايا كل 3-4 أيام مع السيتوكينات وسائل الإعلام الجديدة. لهذا، صرف نصف المتوسط ​​في الآبار مع 50 متوسطة جديدة ميكرولتر من قبل pipetting. إضافة تركيز 2 أضعاف السيتوكينات إلى كل مكملات. إضافة 5X10 4 الخلايا المغذية المشع لكل بئر في كل جولة أخرى من التغذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، ومراقبة الحيوانات المستنسخة الأولى تصبح مرئية بعد 3-4 أسابيع، لأنها استقلاب، وبالتالي تغيير لون المستعمرات مستنبت والشكل. ملاحظة: للحصول على الفراءزراعة ذر، resuspend واستنساخ جيدا ونقلها إلى فصل لوحات 96-جيدا. تحليل الخلايا عن طريق FACS كما هو مبين في 2.1.1-2.1.3. استنساخ أبقى في ظل هذه الظروف قد تتغير في نهاية المطاف TCR بهم من Vδ1 إلى αβTCR. النقطة الوقت لهذا transdifferentiation تختلف من استنساخ استنساخ. </li></ol>

<ol>
	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

لدراسة النمط الظاهري والبيولوجيا وظيفة من ندرة (T-) كيان الخلية، وهي خلايا CD4 + Vδ1 + T، استخدمنا اثنين علامات: Vδ1 وCD4 لعزل الخلايا المغناطيسية الإيجابية. Vδ1 هو مستقبل الأيتام، في حين يتم التعبير عن CD4 على الخلايا التائية المساعدة، على مستوى أدنى في وحيدات الخل...

في الفقاريات، والحصانة التكيفية التي يتمحور في الخلوية وجزء الخلطية الحصانة تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. وتوسط الاعتراف مجموعة واسعة من مولدات المضادات التي كتبها T- hyperpolymorphic وB مستقبلات الخلايا (TCR / BCR)، الذي فيما يتعلق خلايا T يفترض أن تنتج بشكل رئيسي في الغدة الصعترية 1. بذلك، الجذعية الخلايا المكونة للدم (HSCs)، المشتقة من نخاع العظام، والبذور الغدة الصعترية والتفريق على مراحل محددة جيدا يعطي في النهاية إلى ظهور كل الأنساب الخلايا التائية. الغدة الصعترية الأسلاف بذر هي CD4 - وCD8 - وبالتالي تشكل غير ناضجة، النفي المزدوج (DN) خلية توتية الكسر. إشارات التوتة المشتقة ثم حمل التزام نسبهم والتمايز إلى أي خلايا T αβ أو γδ. التعبير عن ترتيبها وظيفيا TCR-γ وTCR-δ الجينات سلسلة في DN2 / 3 thymocytes يؤدي إلى جاما δTCR المجمعات، التي تدفع الخلوي تكاثرد تعزيز التمايز إلى خلايا γ δT 2،3. في المقابل، فإن إعادة ترتيب وظيفية سلسلة TCR-β، التي يمكن أن الزوج مع preTα لبناء preTCR حزب العمال، الحث على إسكات النسخي من سلسلة TCR-γ في thymocytes DN3 وانتقالها إلى CD4 + CD8 + نقرا مزدوجا إيجابية thymocytes 4 . في هذه المرحلة، إعادة التركيب من سلسلة TCR-α يحدث، وحذف موضع TCR-δ التي يعشعش داخل مكان TCR-α، وبالتالي إلغاء إنتاج وγδTCR في هذه الخلايا لا رجعة فيه 5-9. ويتم اختيار αβTCRs ترتيبها بعد ذلك لقدرتها على ربط MHC الذاتي ضعيف (اختيار الإيجابية)، والتي قد لا تتجاوز عتبة معينة لتجنب المناعة الذاتية (اختيار السلبية). وفقا لقدرتها على الطبقة MHC ملزم الأول أو الثاني، فإن الخلايا αβT المختارة تتطور إلى واحدة إيجابية CD4 + أو CD8 + T الخلايا، والتي الخروج الغدة الصعترية خلايا T ساذجة كما. ومع ذلك، ارتداد من الغدة الصعترية يبدأ في الحياة مما أدى إلى انخفاض أضعافا مضاعفة الناتج من الخلايا T السذاجة أن يسقط تقريبا بعد سن المراهقة 10 في وقت مبكر. ومع ذلك، يظل حجم تجمع الخلايا T المستمر طوال الحياة، والتي يمكن تفسيرها إلا في جزء من انتشار التماثل الساكن بعد التوتة الخلايا T وانتشار ذاكرة مناعية طويلة العمر 11. ونتيجة لذلك، يجب أن يحدث نمو الخلايا T extrathymic. وقد اكتسب البحوث التي أجريت مؤخرا الجذب الكبير الذي تتميز الأسلاف خلية αβT، التي، في extrathymic مواقع أدت إلى αβ وظيفية الخلايا التائية 12-17. ومع ذلك، ومعرفة تفصيلية حول extrathymic السلائف الخلية αβT التي مستقلة من الغدة الصعترية التمايز إلى خلايا αβT مجزأة مثل الخلفية التي لدينا على الطريق أنها تأخذ بذلك. حددنا مؤخرا الكيان T-خلية صغيرة من Vδ1 + </suP&gt; خلايا CD4 + γδT باعتبارها extrathymic αβT خلية prognitor 18، والتي عندما عزل من الدم المحيطي من المانحين البشرية السليمة يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في بيئة التهابات خفيفة. ومن المثير للاهتمام، وخلافا لانتشار استتبابي من الخلايا T بعد الغدة الصعترية، transdifferentiation من Vδ1 CD4 + الخلايا يولد مستقبلات الخلايا التائية جديدة، وبالتالي توسيع التنوع ذخيرة، بحيث مستضدات جديدة محتملة يمكن الاعتراف بها ويجوز حماية المضيف ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. وهذا يضيف إلى ليونة من الخلايا T ويضيف مسارا جديدا لذلك محل تقدير بعيدا عن تطوير الخلايا T extrathymic. العزلة الكمية من مصادر مفاوي، جيل من الحيوانات المستنسخة وحيدة الخلية وتوسعها كفاءة ضرورية لتحقيق الهدف لتحديد تلك العلامات والجزيئات التي تؤدي هذه الخلية αβT precursor`s تطوير extrathymic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biocoll Solution</td>
			<td style="width:93px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L 6113</td>
			<td style="width:361px;">lymphocyte separating solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing Buffer</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>lysis of erythrocytes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>supplement with BSA and pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human Vd1 FITC (clone:&#160; TS8.2)</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td>TCR2730</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>345766</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555548</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-333</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>641400</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Anti-FITC MultiSort Kit</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-058-701</td>
			<td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS columns</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CD4 Positive Isolation Kit</td>
			<td style="width:93px;">life technologies</td>
			<td>11331D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

الغدة الصعترية، الجهاز الرئيسي لتوليد αβ T الخلايا والعمود الفقري للنظام المناعي التكيفي في الفقاريات، منذ فترة طويلة تعتبر المصدر الوحيد للخلايا αβT. ومع ذلك، وارتداد الغدة الصعترية يبدأ في وقت مبكر في الحياة مما يؤدي إلى انخفاض شديد في انتاج الخلايا αβT ساذجة في الهامش. ومع ذلك، يمكن حتى المعمرين بناء مناعة ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. تشير الأبحاث الحديثة إلى تطوير خلية αβT extrathymic، لكن فهمنا للمسارات التي يمكن أن تعوض عن فقدان الغدة الصعترية وظيفة لا تزال اولى. خلايا T γδ هي الخلايا الليمفاوية الفطرية التي تشكل فرعية T-الخلية الرئيسية في الأنسجة. نحن المسند في الآونة الأخيرة وظيفة العالقة حتى تأخذ حقها من الآن إلى γδ الخلايا التائية فرعية من خلال إظهار أن الكيان نادرة من CD4 + Vδ1 + γδ خلايا T يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في حالات الالتهابات. هنا، نحن صrovide بروتوكول لعزل هذه السلف من الدم المحيطي وزراعته لاحقة. يتم إثراء خلايا Vδ1 إيجابيا من PBMCs من المانحين البشرية السليمة باستخدام حبات مغناطيسية، تليها الخطوة الثانية التي نحن فيها استهداف جزء نادرة من CD4 + الخلايا مع مزيد من تقنية وضع العلامات المغناطيسية. القوة المغناطيسية لوضع العلامات الثاني تجاوز واحدة من التسمية المغناطيسية الأولى، وبالتالي تسمح للعزلة إيجابية فعالة، والكمية المحددة للسكان الفائدة. نحن ثم إدخال هذه التقنية والثقافة الشرط المطلوب لاستنساخ وكفاءة توسيع الخلايا والتعرف على الحيوانات المستنسخة الناتجة عن تحليل FACS. وهكذا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنقية والثقافة وفيفو السابقين توسيع CD4 + Vδ1 + γδ خلايا T. هذه المعرفة هي شرط أساسي للدراسات التي تتصل هذا αβT progenitor`s خلية البيولوجيا وبالنسبة لأولئك الذين يهدفون إلى بيئة تطوير متكاملةntify مشغلات الجزيئية التي تشارك في transdifferentiation لها.

الشكل 1 يصور المراحل المختلفة ونتائج عزل الخلايا Vδ1 T من الدم المحيطي. ويبين الشكل 1A توزيع نموذجي من Vδ1 + الخلايا في CD3 + الخلايا الليمفاوية، فضلا عن التعبير شارك في مستقبلات السكان Vδ1 +. في هذا المانحة، وتواتر Vδ1 خلايا +</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÎ´1+CD4+Î³Î´ T Cells, an Extrathymic Î±Î²T-cell Progenitor at JoVE.com

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

العزلة و<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; ثقافة Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; خلايا T γδ، وهو Extrathymic αβT خلايا السلف

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Views.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

توسيع فيفو السابقين الخلايا T ورم التفاعل من قبل وسائل 1/Ionomycin Bryostatin وصياغة سلسلة غاما المشتركة السيتوكينات

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

عزل مزدوج السلبية خلايا T αβ من الكلى

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...