המחבר מבקש להודות מתיו קלי, Tiziana Cogliati, ג&#39;סיקה Gumerson, Uwe Wolfrum, רבקה לברון, ויולה קרצ&#39;מר וזואי מאן להערכה ביקורתית שלהם של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי בפרס Sofja Kovalevskaya (קרן Humbodlt) ואת יוהנס-גוטנברג אוניברסיטת מיינץ, גרמניה.

<ol>
	<li>Waters, A. M., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliopathies:+an+expanding+disease+spectrum.">Ciliopathies: an expanding disease spectrum.</a> Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).</li><li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia,+Wnt+signaling,+and+the+cytoskeleton.">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1, 7 (2012).</li><li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates.">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).</li><li>Ezan, J., Montcouquiol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+planar+cell+polarity+in+the+inner+ear.">Revisiting planar cell polarity in the inner ear.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 24, 499-506 (2013).</li><li>Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Noncanonical+Wnt+Signaling+Pathways.">SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways.</a> Cell. 131, 1378 (2007).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway.">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37, 980-985 (2005).</li><li>Montcouquiol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Vangl2+and+Scrb1+as+planar+polarity+genes+in+mammals.">Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals.</a> Nature. 423, 173-177 (2003).</li><li>May-Simera, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+Bbs8+and+Ift20+promote+planar+cell+polarity+in+the+cochlea.">Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea.</a> Development. 142, 555-566 (2015).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation.">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nat Genet. 40, 69-77 (2008).</li><li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+of+the+organ+of+Corti:+a+review.">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hearing research. 22, 117-146 (1986).</li><li>Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+hair+bundle+and+mechanotransduction.">Development of the hair bundle and mechanotransduction.</a> The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).</li><li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+deveoping+vestibular+system+of+the+mouse.">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse.</a> J. Neurocytol. , 821-835 (1999).</li><li>Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinocilium+of+auditory+hair+cells+and+evidence+for+its+morphogenetic+role+during+the+regeneration+of+stereocilia+and+cuticular+plates.">The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates.</a> Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).</li><li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+developing+vestibular+system+of+the+mouse.">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse.</a> Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).</li><li>van Dam, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SYSCILIA+gold+standard+(SCGSv1)+of+known+ciliary+components+and+its+applications+within+a+systems+biology+consortium.">The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium.</a> Cilia. 2, 7 (2013).</li><li>Blacque, O. E., Sanders, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+within+a+compartment:+what+C.+elegans+can+tell+us+about+ciliary+subdomain+composition,+biogenesis,+function,+and+disease.">Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease.</a> Organogenesis. 10, 126-137 (2014).</li><li>Wallingford, J. B., Mitchell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strange+as+it+may+seem:+the+many+links+between+Wnt+signaling,+planar+cell+polarity,+and+cilia.">Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia.</a> Genes &amp; development. 25, 201-213 (2011).</li><li>Borovina, A., Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFT88+plays+a+cilia-+and+PCP-independent+role+in+controlling+oriented+cell+divisions+during+vertebrate+embryonic+development.">IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development.</a> Cell reports. 5, 37-43 (2013).</li><li>Huang, P., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dampened+Hedgehog+signaling+but+normal+Wnt+signaling+in+zebrafish+without+cilia.">Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia.</a> Development. 136, 3089-3098 (2009).</li><li>Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+not+required+for+normal+canonical+Wnt+signaling+in+the+mouse+embryo.">Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo.</a> PloS one. 4, e6839 (2009).</li><li>Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy:+preparation+and+imaging+for+SEM.">Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM.</a> Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Celsr1+disrupts+planar+polarity+of+inner+ear+hair+cells+and+causes+severe+neural+tube+defects+in+the+mouse.">Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse.</a> Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).</li><li>Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Frizzled3+and+Frizzled6+in+neural+tube+closure+and+in+the+planar+polarity+of+inner-ear+sensory+hair+cells.">The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).</li><li>Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+planar+polarity+proteins+in+mammalian+cochlea.">Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).</li><li>May-Simera, H., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+planar+cell+polarity+in+the+mammalian+cochlea.">Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).</li><li>Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+phenotypes+between+different+vangl2+mutants+demonstrates+dominant+effects+of+the+Looptail+mutation+during+hair+cell+development.">Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development.</a> PloS one. 7, e31988 (2012).</li><li>Rachel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Cep290+and+Mkks+ciliopathy+alleles+in+mice+rescues+sensory+defects+and+restores+ciliogenesis.">Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis.</a> J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).</li><li>Jagger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alstrom+Syndrome+protein+ALMS1+localizes+to+basal+bodies+of+cochlear+hair+cells+and+regulates+cilium-dependent+planar+cell+polarity.">Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity.</a> Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alstrom+Syndrome+Protein,+ALMS1,+Interacts+with+alpha-Actinin+and+Components+of+the+Endosome+Recycling+Pathway.">The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway.</a> PloS one. 7, e37925 (2012).</li><li>Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+refinement+of+auditory+hair+cell+planar+polarity+deficits+occurs+in+the+absence+of+Vangl2.">Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).</li><li>Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usher+syndrome+protein+network+functions+in+the+retina+and+their+relation+to+other+retinal+ciliopathies.">Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies.</a> Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).</li><li>Hebert, J. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+cre+to+the+Foxg1+(BF-1)+locus+mediates+loxP+recombination+in+the+telencephalon+and+other+developing+head+structures.">Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures.</a> Dev Biol. 222, 296-306 (2000).</li><li>Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8,+Measurement+of+the+auditory+brainstem+response+(ABR)+to+study+auditory+sensitivity+in+mice.">Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B (2006).</li><li>Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8,+Assessment+of+cochlear+function+in+mice:+distortion-product+otoacoustic+emissions.">Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C (2006).</li><li>Finetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+is+required+for+polarized+recycling+of+the+TCR/CD3+complex+to+the+immune+synapse.">Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse.</a> Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).</li><li>Sedmak, T., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+molecules+in+ciliary+and+nonciliary+cells+of+the+retina.">Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina.</a> J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+horizons:+ciliary+proteins+reach+beyond+cilia.">Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia.</a> Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).</li><li>Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+blueprint+at+the+apical+surface+establishes+planar+asymmetry+in+cochlear+hair+cells.">A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells.</a> Developmental cell. 27, 88-102 (2013).</li><li>Ezan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+migration+depends+on+G-protein+signalling+control+of+subapical+cytoskeleton.">Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton.</a> Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).</li></ol>

The author declares no competing financial interests.

בעת הכנת רקמת שבלול לניתוח, יש כמה נקודות מפתח כדי לזכור. ראשית, בדלי רקע גנטי יכולים לשנות את הפנוטיפ השבלול, מה שהופך אותו הצורך לנתח ולהשוות שולט להמלטה בלבד. שנית, הסרה מלאה של קרום tectorial נדרש לקבל את התמונות הטובות ביותר עם אימונוהיסטוכימיה והוא חיוני SEM. קרום tectorial הוא מבנה אטום יכול לטשטש את תאי האפיתל חושית ישירות מתחתיו, מה שהופך הדמיה יותר מאתגר. לפעמים במהלך עיבוד, קרום tectorial עלול להתכווץ בחזרה, לחשוף את תאי השיער. גם במקרים אלה הסרה מומלצת בחום. שלב זה דורש סבלנות ותרגול. שלישית, אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים כנגד חלבונים ריסי, במיוחד אלה למקם את הגוף הבסיסי הדחוס מאוד, יכולה להיות מאתגרת ודורשת אופטימיזציה. שקול ביצוע אחזור אנטיגן, תוך הגברת permeabilization צעדים, או להקטין את הריכוז או הזמן של קיבעון. לבסוף, כאשר הדמית kinocilium (להלן cilium העיקרי שנמצא על תאי שיער שבלול) יש לזכור כי הוא מתחיל לחזור בו P0 - P1 ואילך שיפוע base-to-איפקס. לכן, כאשר מודדים את אורך kinocilium חשוב להשוות תאי שיער מאותו אזור של שבלול ובחיות גיל בהתאמה. תאי תמיכת intercalated גם cilia העיקרי, אשר לא חוזר בי. יש להקפיד להבחין בין תמיכה cilia התא kinocilia תא השיער. כמו עכברים בוגרים, הוא הופך להיות יותר ויותר קשה לבודד את epithelia חושי השבלול למשעי, בשל ההסתיידות של עצמות הזמניות מבוכים גרמיים. Decalcification של הרקמות נדרשת, וזה תמיד לא תואם עם טכניקות immunolocalization נוספות אבל אין מאפשר לבחון את הפנוטיפ הברוטו, והוא גם תואם עם הכנת SEM. str העכבר המולדains מפגין לעתים קרובות פגמי שמיעה כגון אובדן תא שיער או בדיקה ABR הגבוהה (ABRs), בשל מוטציות בגני שמיעה ידועות או גנים משנים. לכן זה חיוני כדי להשוות שולטת להמלטה גילאים או להתרבות על רקע גנטי חלופי. אחת המגבלות של ניתוח זה היא כי, שנעשו בעכברים, kinocilium מתחיל לחזור הלידה פוסט והוא כבר לא קיים על תאי השיער הבוגרים. מסיבה זו מדידות kinocilia יכולות להיעשות רק בפיתוח רקמות. כמו כן יש צורך לבחור בקפידה שולטת לפי גילאים להשוואות בין דגימות מוטציה ושליטה. מגבלה נוספת הוא כי עכברים מוטנטים ריסי נתחו עד כה אינו מציגים תפקוד לקוי שמיעה חמור (כלומר., בדיקה ABR, ABRs או פליטת otoacoustic, OAEs) גם כאשר פיתוח שבלול נפגע. בקנה אחד עם זו, פגמים שמיעה אינם פנוטיפ ciliopathy אנושית נפוצה. באופן יוצא דופן, אובדן שומעG הוא אחד המאפיינים העיקריים של תסמונת Alstrom, נגרמת על ידי מוטציות בחלבון הגוף הבסיסי ALMS1 28,29. הדבר מצביע על כך מורפולוגיה צרור stereociliary אינו קשור בהכרח תפקוד לקוי השמיעה מוטנטים cilia, סביר בגלל ארגון מחדש מתקנת של צרורות בהמשך הפיתוח כפי דווחה עבור מוטציות Vangl2 CKO 30. אם קשת ciliopathy הוא התרחב לכלול תסמונת, הגורם המולד השכיח ביותר של חירש-עיוורון, אז תפקוד לקוי שמיעה הופך רלוונטי ביותר. נתונים אחרונים הראו כי מספר חלבונים הקשורים תסמונת גם למקם את cilium ומעורבים בתהליכים הקשורים ריסי 31, אבל אם חלבונים אלה מתייחסים איתות PCP לא נבחנה עדיין. עד עכשיו רוב מוטנטים עכבר ריסי נתחו עבור פגמי PCP שבלול כבר רק בדקו במעורפל. הטכניקות המתוארות בכתב היד הזה לאפשר נרחב המפרט שלפנוטיפ שבלול, אשר ללא ספק להוביל להבנה מדויקת יותר של מעורבות ריסים בהקמת איתות PCP חוליות. למרות מספר גדול של מודלי עכבר ciliopathy זמינים, כמה מפתיע כבר נותחו מבחינת פגמי PCP שבלול. נופל בפח הקשורים המודלים האלה הוא קטלני עובריים. עם זאת, מאז שבלול המתפתח יכול להיבחן embryonically את התפקיד של הריסים ב PCP באוזן בפיתוח ניתן עדיין להיחקר. יתר על כן, הקטלניות עובריים בשלב מוקדם מאוד ניתן לעקוף באמצעות knockouts מותנה. Foxg1 Cre 32 עכברים, זמינים JacksonLaboratories, משמשים בדרך כלל כדי inactivategenes של עניין thedeveloping האוזן הפנימית ממועד E8.To, המאמצים התמקדו בעיקר על בחינת גנים ciliopathy גורמי מחלות חקר חלבונים הקשורים cilia אחרים וכיצד אלה משפיעים איתות PCP במהלך הפיתוח, אולם עשויה לספק תובנה רבה יותר CILביולוגיה ותפקוד IA. אם פנוטיפ שמיעה חשוד במודלי העכבר להיות מנותח, ניתוחים נוספים אפשריים כוללים בדיקות audiometric של ABRs 33 או OAEs 34. מבחני רחבת explant שבלול (כמתואר מאי-Simera et al., 2012 25), יכולים גם להתבצע ולאפשר זיהוי פגמים רחבים מתכנסים בנקודות זמן התפתחותי מוקדם יותר. Culturing של explants שבלול גם מאפשר טיפול activators או מעכבי איתות שונים, אשר יכול לשנות סיומת explant, ובכך תורם להבנה מכניסטית של תהליכים התפתחותיים מעורב. למרות זאת ידוע כי kinocilium חזר בו לאחר לידת 11,13,14, הכחשה זו לא טופלה ביסודיות בהקשר של מוטציות ריסים. זה יהיה עניין לקחת מדידות ספציפיות בזמן של הופעתה kinocilia ו הכחשה ב cilia mutants.Considering כי תפקיד עיקרי עבור פרו ריסיםחלבונים הם תנועה של מטענים לאורך microtubules, סביר מאוד כי חלבונים אלה עשויים גם להסדיר היבטים של סחר תאי לאורך 35-37 שלד התא. תת-קבוצה קטנה של חלבונים cilia הוכחו להשפיע סחר ולוקליזציה סימטרית של מולקולות PCP 8. לוקליזציה על ידי אימונוהיסטוכימיה של מולקולות PCP, במיוחד הקשורים חלבונים בממברנה כגון Vangl2, Frz3 ו DSH, ולכן מומלץ לקבוע אם מולקולות PCP הם mislocalized. הקמת הקוטביות שנראית בפרשה רבה פנים, ויש עדויות שהלכו והצטברו מסלול אוטונומי תא נוסף, אשר נדרשו גם עבור PCP הנכון בתאי שיער חושי 38. נייר לאחרונה הראה כי איתות חלבון תלוי G שולטת ההגירה של cilium באופן תא אוטונומי 39. עולה בקנה אחד עם תפקיד עבור חלבונים ריסי בלוקליזציה של מולקולות קוטביות, אלפא-i G-חלבון heterotrimeric למקטע 3 (Gαi3) localization מופרת ב Bbs8 ו Bbs6 בנוקאאוט שבלול 8,39. הבחן את התפקיד של רכיבי ריסי פרט ואפקטים השונים שלהם על איתות PCP ייתן לנו להבין טוב יותר את תפקידו של cilium בהקמת קוטביות נכונה. חשיבות מיוחדת הוא להבחין בין חלבונים ריסי מתפקדים בהקשר ריסים, לעומת פונקציות שאינם ריסי חלבונים ריסי נחשבים באופן מסורתי, כגון תפקידם ויסות ריסים שאינם קשורים סחר תאי. רמה גבוהה של סדירות בהיבטים רבים של מבנה השבלול, כולל דפוסים הסלולר והכיוון צרור stereociliary, מאפשרת לזהות שינויים עדינים בפיתוח PCP בתגובה או להפרעות גנטיות או מולקולרי בחלבונים הקשורים cilia. בהתחשב בכך שיש הרבה מודלי עכבר ריסים זמינים וכי שבלול העכבר המתפתח הוא אחד המקומות הטובים ביותר כדי לבחון PCPאיתות, זה עניין רב ללמוד מה מוטציות חלבון פרט במידה מפריעות להתפתחות שבלול.

cilia ראשי הם נספחי microtubule מבוסס ארוכים שמרחיבים מפני שטח של רוב בתאי יונקים. cilia הראשי מבולבלים לעתים קרובות עם cilia ניע, אשר יש תמיד מרובים לכל תא, ואשר מטרתו הוא להעביר נוזל על פני משטחים הממברנה. cilia היסודי, לעומת זאת, לאמץ תפקידים חושיים ובשל כך הן גם התייחסו cilia החושית כמו. לאחר שאבד עליהם כלח, אברון זה כבר &quot;מחדש&quot; לאחרונה כתוצאה ההתאגדות שלה עם שפע של מחלות גנטיות האדם 1. באופן אידיאלי מיקומו בתור אברון איתות, את cilium העיקרי הוכח לווסת מסלולים רבים איתות, שרבים מהם חשובים לא רק הומאוסטזיס רקמה ומחלות, אלא גם במהלך הפיתוח 2. אחד מסלולי איתות הראשונה הראו להיות הקשורות בתפקוד cilia היה מסלול איתות Wnt קאנונית, הידוע גם בשם הקוטביות בתא מישוריים (PCP) מסלול <sup<html> &gt; 3. מפל איתות זה בתחילה זיהה תסיסנית, הוא קריטי עבור עובר; בפרט עבור תהליכי התכנסות ארכה את הכיוון הנכון של תאי המטוס של אפיתלים 4. את האיתות הרציפה של גרעין המוגדר של חלבונים רגולטוריים מתרגם רמזים כיוונית אשר בסופו של הדבר להוביל rearrangements cytoskeletal ולגרום הקיטוב המתואם של תאי אפיתל במטוס 5. תהליך ההתכנסות והסיומת הוא דרוש לחלוטין את צינור השבלול להאריך ועבור דפוסים הסלולר נכונים 6. כמו זה מוסדר באמצעות שפעול מסלול PCP, אחד פנוטיפים הבולטים ביותר של מוטציות שבלול PCP הוא צינור שבלול יקוצר epithelia החושית מאורגנת 7. באופן דומה, מוטנטים עכבר, אשר חסר cilia, גם תערוכה כגון פנוטיפ התכנסות ורחב 8,9, למרות בדיוק איך זה מוסדר נותר הובהר. ve_content &quot;&gt; מכיוון תהליכי התכנסות והרחבה הם קריטיים עבור התולדה של צינור השבלול, דפוסים הסלולר של epithelia החושית בתוך צינור השבלול, השבלול המתפתח הוא איבר אידיאלי שבו לבחון איתות PCP במהלך ההתפתחות החולייתנים. הביטאון קורטי, השם שניתן האפיתל החושית המיוחדת המרפדת את צינור השבלול, מורכבת ותאי תומכים שאינם חושיים ותאי שיער mechanosensory אשר חייב להיות מכוונות באופן אחיד עבור השבלול לתפקד 10. תאי שיער mechanosensory נקראים כך בגלל חבילות stereociliary שמרחיבות מצלחת cuticular (למשטח פסגה) של כל תא שיער חושי 11. אלה משמשות מתמרים עיקריים של mechanosensation ולמרות המינוח שלהם כמו stereocilia, מורכבות למעשה של microvilli מבוסס נימה תקטין שונה. בתוך כל שיער בצורת שברון צרור, שלוש שורות של stereocilia מאורגנים רשות הורה מאוד ורגילttern באופן במקרה דמוי מדרג. Cilia microtubule מבוססי ריאל, כינה kinocilia, נדרשים לפיתוח והכיוון של חבילות stereociliary 12. עם כל תא שיער, kinocilium אחת מחוברת פיזית את צרור stereocilia, הממוקמת בסמוך מרכזי לשורה הגבוהה של stereocilia. הפונקציה מדויק של kinocilium אינה ברורה, אחת ההשערות היא כי kinocilium &#39;מושך&#39; את stereocilia לכושר כשהם מתבגרים מן microvilli 12. בבעלי החוליות, kinocilia בשבלול נוכח רק זמנים לסגת מתאי השיער בעכברים לפני תחילת שמיעת 11,13,14. אובדן מוחלט של השיער בתוצאות שבלול המתפתח צינוריות שבלול מקוצר קשות, יצרו אי ו MIS מוכווני חבילות stereociliary, וכן גופים הבסיס ממוקם mis 8,9. Cilium תפקודית אינה מורכבת רק של axoneme ריסי. חלבונים רבים הקשורים ciliaפונקציה להתרחש מתחמים מקומיים תחומיים משנה הקשורות cilia כמו גוף בסיסי, אזור מעבר, או ריסי axoneme 15. הגוף הבסיסי, נגזר אמא צנטריול של centrosome, היא גם המרכז מתארגן microtubule עבור microtubules הארכה הרחק cilium לתוך גוף תא יכול לווסת סחר תאי וכן סחר ריסים. אזור מעבר הריסים הוא אזור אחר שבו פונקצית ריסי מוסדר מבחינת ארגון יבוא ויצוא של תרכובות ריסי 16. מחקרים רבים זיהו קשר בין הריסים ו קאנונית Wnt (איתות PCP), אם כי המנגנון המדויק אינו ברור 17. יתירות של גני ריסים ו PCP ואת הרגישות של קוטביות בתא לאי תקינות הסלולר כללית, להקשות לקשר מוטציה ישירות גירעונות ספציפיים PCP. אחד פסקי לקריאה של איתות PCP הוא המיקום של הגוף הבסיסי ו primarcilium y, ולכן ההפרדה העיקרית מן הפגמים המשניים הם מאתגר. כמה מחקרים מוטנטים דג הזברה והעכבר הציעו שום קשר בין הריסים ו Wnt איתות 18-20. אי-התאמות בנתונים עשויות לשקף מינים, רקמות, או בדלים זמניים תלויים תרומות ריסים לקראת איתות Wnt. יתר על כן, היענות Wnt רגיל עלולים להיעזר במידת גופים הבזליים להישאר פונקציונליים. תובנה עמוקה יותר לתוך התפקיד של חלבונים ריסי במסלולי איתות הסלולר תופעות ביולוגיות אחרות חיונית להבנת ביולוגיה תאית והתפתחותית, וכן לפיתוח אסטרטגיות טיפול ממוקד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tools/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomere - Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028-5EA</td>
			<td>See Note 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope.</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uncoated glass microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slips (22 mm &#215; 40 mm &#215; 0.15 mm)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM sample holder</td>
			<td>tousimis</td>
			<td>8762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy studs</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs: Carbon adhesive</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>16084-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe Tissue&#160;</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160; (PFA) (EM Grade Required for EM)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 4% solution in 1&#215; PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyde Grade1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl 2</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215; Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide (OsO4 )</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Fluka Analytical</td>
			<td>75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Arl13b</td>
			<td>Protein Tech</td>
			<td>17711-1-AP</td>
			<td>Suggested concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti acetylated tubulin (611-B1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6793</td>
			<td>Suggested concentration 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti gamma tubulin (GTU-88)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6557</td>
			<td>Suggested concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Zo_1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2300</td>
			<td>Suggested concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin VI</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6791</td>
			<td>Suggested concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin VIIa</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td>Suggested concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Vangl2</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>ABN373</td>
			<td>Suggested concentration 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti G&#945;i3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4040</td>
			<td>Suggested concentration 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Suggested concentration 1:300-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 568 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Suggested concentration 1:300-1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of planar-cell-polarity phenotypes in ciliopathy mouse mutant cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

שבלול Dissection והכן רקמות לאחר הסרת המוח, דיסקציה sagittal באמצע הקו לתפקיד ראש עכבר P0, המבוך הגרמי, במבט מאחור, ניתן דמיינו (איור 1A, חץ לבן) והוסר. איור 1B מציגה את המבוכים גרמיים המבודדים עם שיער השבלול כלפי מעלה, גחון, (מהשמאל) מאחור, הגבה (מימין). נקודות חץ הלבנות אל החלון הסגלגל שממנו אפשר להתחיל הסרת הסחוס החיצוני. לאחר הסחוס החיצוני הוסר לחלוטין, את צינור השבלול החשוף, עדיין שלם, ניתן לצפות (איור 1 ג). מיצוב של סיכה דרך אזור שיווי המשקל כדי לסייע לנתיחה מוצגת. שתי סיכות, הניח בזוויות שונות יכול לשמש גם כדי לעגן את הרקמה. 1D איור מראה את צינור שבלול לאחר הסרת רייסנר &#39;הממברנה של הממברנה tectorial (משמאל) הספירלה אפיתל השבלול המבודדת פעם אחת זה כבר מבודדת באזור שיווי המשקל לקראת הרכבת אימונוהיסטוכימיה (מימין);. כדי לתת מושג כללי על מה את שיער השבלול החשוף נראה כמו, הכנת שלמי SEM מוצגת באיור 1E. מורפולוגיה Immunofluorescence בבקרת שבלול לאחר הכנה של רקמת השבלול, המשטח הגבי של צינור השבלול המכיל את האיבר של קורטי חשוף ויכול נצפה באמצעות SEM או מכתים immunofluorescent. נצפה כהכנה כל הר, ארבעת שורות של תאי שיער mechanosensory (שורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים) ניתן להבחין. איור 2 א מראה נוף בהגדלה נמוכה של בתורו הבסיסי מתוך שבלול עכבר עוברי f, הכיןאו SEM. הערת האורינטציה והיישור האחידה של חבילות stereociliary מבוססות תקטנה. בנוסף המורפולוגיה של חבילות stereociliary עולה בקנה אחד, בכל אחת מהחבילות יש מקלאסיקות &quot;)&quot; (על תאי שיער פנימיים) או &quot;W&quot; (על תאי שיער חיצוניים) צורה. עם הגדלה קרובה בגיל הזה microvilli נוסף ניתן לראות לא רק על פני שטח הפסגה של התאים שיער, אלא גם-בין תאי השיער על ותאי התומכים (איור 2 ב). אלה יהיה לסגת ומשאיר רק שלוש שורות של חבילות stereociliary על תאי השיער החיצוניים ושני על תאי השיער הפנימיים אצל מבוגרים. כפי שניתן לראות בתרשים 2C (חץ לבן) חברת kinocilium microtubule מבוסס יחיד (א cilium עיקרי אמיתי) ממוקמת בסמוך לשורת stereocilia הגבוהה על הקודקוד של כל צרור stereociliary. אלה מחוברים הצרור דרך קישורי kinocilia. תיוג פלורסנט עם phalloidin, אשר מעבדהאלס יקטין, מדגיש את הכיוון וצורה האחידות של החבילות ברקמת ביקורת (איור 2 ד). תקטין קורטיקלי מסומן גם, וזה שימושי כדי לקבוע את היקף הפסגה של כל תא שיער בודד. Co-תיוג עם phalloidin ו נוגדן כנגד 7 א שרירן (איור 2E), סמן תא השיער, גם עוזר להבדיל בין תאי השיער ותאי תמיכה. 7 א שרירן הוא גם סמן שימושי למדידת הארכת צינור שבלול (ראה איור 3 א). נוגדן נגד acetylated-α-טובולין משמש בדרך כלל כדי לזהות את kinocilium microtubule מבוססי (איור 2F). ככל שהתאים תמיכה גם הנמל cilia העיקרי, חשוב להבחין בין השערות האלה שמקורם בתאי השיער לעומת intercalating תאי תמיכה. סמנו קרום נוסף כגון נוגדנים נגד ZO-1 (Zona Occludens 1), אשר בבירור מתאר דפוסי הפסיפס של קרום apical של צינור השבלול, ולכן מועיל (&lt;strong&gt; איור 2F). מתוך תמורה נוספת היא כי נוגדנים נגד acetylated-α-טובולין גם תווית microtubules פנימי ולכן יש להיזהר כאשר הדמיה להתמקד למשטח הפסגה תא השיער. Microtubules בתאי העמוד במיוחד צפוף (איור 2G, כוכבית לבנה). שילוב של phalloidin וסימון אנטי acetylated-α-טובולין משמש לעתים קרובות לזהות חבילות stereociliary בו זמנית kinocilia השכנות (2G איור, חץ לבן). הפנוטיפ שבלול ב צילה מוטאנטים התארכות של צינור השבלול היא אחד פסקים לקרוא הטוב ביותר של פגמי התכנסות ורחבים, ותעלות שבלול קצרו הם נצפו בדרך כלל מוטציות PCP קלסיות. שבלול מוטנטים ריסי לעתים קרובות שהתקצר צינוריות שבלול ולהראות רחבה ניכרת של epithe החושיתליה על השיא, כפי שניתן היה לראות Ift20 cko / cko עכברים (איור 3 א). עוד פגם PCP הקלאסית היא הפרעה לאוריינטציה אחידה של תאים שיער שבלול, כפי שניתן לראות ב Bbs8 - / - עכברים שניהם עם אימונוהיסטוכימיה (איור 3B, ימינה) ועם SEM (איור 3 ג). בנוסף חבילות מוכווני mis, שטוח חבילות מעוות גם הם נצפו בדרך כלל (איור 3B, באמצע החץ; איור 3D). פעמים רבות חוזר צרורות, כפי שניתן היה לראות באיור 3E, נוכחים, במיוחד בתאי השיער לחלוטין נטול kinocilia. Mis-לוקליזציה של kinocilium מקובלת גם. Kinocilium-מקומי mis יכול או לא יכול להיות קשור אליה צרור stereociliary (איור 3B, חץ שמאלה; איור 3F). דוגמאות כיצד לכמת buהתמצאות kinocilia ndle או מיצוב צרור מוצגים באיור 3G ו 3H. האורינטציה של כל צרור בודד אז יכולה להיות מוערכת על ידי קביעת הסיבוב של של יחסי צרור קו הארכת בניצב בשורה של תאי עמוד שמפרידה בין תאי שיער הפנימיים והחיצוניים. תאים עם אורינטציה נורמלית מיושרים לאורך ציר בניצב זה ולכן יש רוטציה של 0 ° (איור 3G). עמדת kinocilium, או במרכז צרור stereociliary, ניתן להתוות ידי שכיסה רשת מיקומית על פני השטח lumenal של תאי השיער ולאחר מכן לקבוע את מיקומו של kinocilia או צרור בתוך הרשת (איור 3I). מוטציות בגנים cilia לעתים קרובות להשפיע אורך הריסים, ולכן אורך kinocilium ניתן להעריך. בשנת Cep290 מוטציות rd16 / rd16, kinocilia ארוכים מאשר בקבוצת הביקורת (איור 3J). כמו חזר בו cilium,זה קריטי יש זוג המלטה גילאים וכדי לקחת מידות מאותו אזור של שבלול. כדי לקבל תמונות טובות לניתוח וכימות, היא אימונוהיסטוכימיה ו SEM, הוא קריטי כדי להסיר את קרום tectorial. איור 3F מראה מיקרוסקופ SEM שבו הקרום tectorial לא הוסר לחלוטין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection של שבלול העכבר המתפתח (P0). (א) אמצע קו לנתיחה sagittal של ראש P0 עכבר עם מוח מוסר. נקודות חץ הלבנות לעמדת המבוך הגרמי. (ב) גחון (משמאל) הגבה (מימין) נופים של מבוכים גרמיים גזור. שבלול ממוקם לכיוון החלק העליון עם חלק שיווי המשקל בנקודות החץ הלבן התחתון אל החלון הסגלגל. (ג) ומאחור המבוך הגרמיהסרת אה של הסחוס החיצוני של שבלול. סיכה הושמה באמצעות מערכת שיווי משקל. (ד) שמאל, אותה השקפה כמו C לאחר הסרת קרום קרום tectorial של רייסנר. נכון, צינור שבלול מבודד מוכן גובר. (ה) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של ספירלת שבלול ללא פגע, חשופי חשיפת רצפת צינור השבלול, כולל האפיתל החושי. בר סולם הוא 100 מיקרומטר. . (א - ד) מותאם ממאי-Simera ואח &#39;, 2012 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53559/53559fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig2.jpg" /> איור 2. מורפולוגיה Immunofluorescence בבקרת השבלול (A - C). סריקת micrographs אלקטרונים של הטור הבזלייםn ב עוברי (E18.5) cochleae הסוג בר. שורה אחת של תאי שיער פנימיים (למטה) ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (למעלה) מופרדת intercalated ידי תאי תמיכה. שברון בצורת חבילות stereociliary לכוון באופן אחיד כלפי לקצה הלטרלי של כל תא שיער (בקצה העליון של התמונה). בשעת E18.5 microvilli הנוסף לכיסוי משטחי הפסגה של תאי שיער, מתחת צרורות stereociliary, ותאי תמיכת intercalated (B). (ג) kinocilium microtubule מבוסס יחיד (חץ לבן), ממוקם בקצה הקודקוד של הצרור, המוצג כאן מהקצה לרוחב. (D - G) מכתים Immunofluorescent של יום הלידה פוסט בתורו הבזליים 1 (P1) cochleae סוג בר. Phalloidin תוויות יקטינו פילמנטיות ב stereocilia יקטין קליפת המוח בשולי התא (D, E, G). שרירן 7 א הוא סמן בתאי שיער פנימיים וחיצוניים (E). Zo_1 תוויות צומת החזקים-בין תאים, מה שהופך אותו סמן מצוין להבחין תא boundaריס (F). Acetylated טובולין α משמש כסמן עבור kinocilium על קודקוד של צרור (F, G חץ לבן). Microtubules פנימי מסומנים גם על ידי טובולין-α acetylated, אשר בפרט בשפע בתאי העמוד (אסטריקס לבן G). סולם bars ת: 10 מיקרומטר, B: 5 מיקרומטר, C: 1 מיקרומטר, DG:. 5 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53559/53559fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53559/53559fig3.jpg" /> איור 3. שבלול הפנוטיפ ב צילה מוטאנטים. (א) קיצור מסומן של Ift20 cko / cko צינוריות שבלול לעומת קבוצת ביקורת. צינוריות שבלול גזורות ב E18.5 מוכתמות טובולין acetylated. (B </תמונות strong&gt;) הר שלם של בתורו שבלול הבסיס ב Bbs8 - / - מוטציה (P0). Phalloidin שכותרתו אקטין פילמנטיות, stereocilia (אדום), טובולין acetylated, kinocilia (ירוק). חבילות Stereociliary ב Bbs8 - / - cochleae הם מסובבים variably (חץ ימינה), שטוח / או mislocalized (חץ באמצע). Kinocilia הוא mislocalized או axonemes חסר (חץ שמאלה). (C - F) גבוהה ההגדלה SEM של צרורות kinocilia stereociliary ב Bbs8 - / - OHCs. ב C, לסובב צרורות, ברה, בברוטליות צרורה, במי, חבילות מעגליות בפה mislocalized kinocilia. (G - I) ייצוגים סכמטי של כימות נורמליות צרורות. (G) שמאל, צרור קמירות (גובה); המרחק קצר בין הקודקוד של הצרור והקו משתרע דרך שני קצוות של הצרור &#39;הנשק&#39;. כמו דepicted ידי הקו השחור המוצק. באזור, ממש מתחת צרור; האזור. (H) ייצוגים סכמטי של הקריטריונים המשמשים לכמת את הכיוון של חבילות stereociliary. זווית סיבוב של הצרור מחושבת ביחס קו הארכת בניצב בשורה של תאי עמוד. (I) ייצוג סכמטי של הקריטריונים לניתוח מיקומית של kinocilia וצרורות stereociliary. רשת מפולחת מונחת על ההיקף של תא שיער ואת המיקום ציין. (י) תמונת-הגדלה גבוהה של חבילות stereocilia שכותרתו phalloidin (אדום) ו acetylated kinocilia שכותרתו טובולין (ירוק) של תאי השיער החיצוניים ב שבלול P0. בחלונית מונוכרומטי הסמוך, קווים אדומים לזהות את kinocilia, שהן כבר מוטנטים rd16 / Cep29 rd16 לעומת קבוצת ביקורת (חצים לבנים). (K) SEM מיקרוסקופ של השבלול עוברי עם הסרה חלקית של קרום tectorial. סוּלָםbars ת: 100 מיקרומטר, B: 5 מיקרומטר, C - F: 2.5 מיקרומטר, אני: 5 מיקרומטר, J: 50 מיקרומטר. (A - F)... שונה ממאי-Simera ואח 2015 8, J הדפס באישור רחל ואח &#39;, 2012 27 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53559/53559fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea at JoVE.com

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Views.  Johannes Gutenberg-Universität Mainz. Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Video: Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher frequency of fractures 1. As these fractures often occur in regions that have lost normal sensory function, the patient is at a greater risk of fracture-dependent pathologies, including death. SCI-dependent loss in both bone mineral density (BMD, grams/cm2) and bone mineral content (BMC, grams) has been attributed to mechanical disuse 2, aberrant neuronal signaling 3 and hormonal changes 4. The use of rodent models of SCI-induced osteoporosis can provide invaluable information regarding the mechanisms underlying the development of osteoporosis following SCI as well as a test environment for the generation of new therapies 5-7 (and reviewed in 8). Mouse models of SCI are of great interest as they permit a reductionist approach to mechanism-based assessment through the use of null and transgenic mice. While such models have provided important data, there is still a need for minimally-invasive, reliable, reproducible, and quantifiable methods in determining the extent of bone loss following SCI, particularly over time and within the same cohort of experimental animals, to improve diagnosis, treatment methods, and/or prevention of SCI-induced osteoporosis.
An ideal method for measuring bone density in rodents would allow multiple, sequential (over time) exposures to low-levels of X-ray radiation. This study describes the use of a new whole-animal scanner, the IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) that can be used to provide low-energy (1-3 milligray (mGy)) high-resolution, high-magnification X-ray images of mouse hind limb bones over time following SCI. Significant bone density loss was seen in the tibiae of mice by 10 days post-spinal transection when compared to uninjured, age-matched control (na&iuml;ve) mice (13% decrease, p&lt;0.0005). Loss of bone density in the distal femur was also detectable by day 10 post-SCI, while a loss of density in the proximal femur was not detectable until 40 days post injury (7% decrease, p&lt;0.05). SCI-dependent loss of mouse femur density was confirmed post-mortem through the use of Dual-energy X-ray Absorptiometry (DXA), the current "gold standard" for bone density measurements. We detect a 12% loss of BMC in the femurs of mice at 40 days post-SCI using the IVIS Lumina XR. This compares favorably with a previously reported BMC loss of 13.5% by Picard and colleagues who used DXA analysis on mouse femurs post-mortem 30 days post-SCI 9. Our results suggest that the IVIS Lumina XR provides a novel, high-resolution/high-magnification method for performing long-term, longitudinal measurements of hind limb bone density in the mouse following SCI.

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

A longitudinal examination of bone loss in the femurs and tibiae of adult mice was performed following spinal cord injury using sequential low-dose X-ray scans. Tibia bone loss was detected throughout the study, while bone loss in the femur was not detected until 40 days post injury.

הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Stroke is the third cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic stroke accounts for approximately 80% of all strokes. However, the thrombolytic tissue plasminogen activator (tPA) is the only treatment of acute ischemic stroke that exists. This led researchers to develop several ischemic stroke models in a variety of species. Two major types of rodent models have been developed: models of global cerebral ischemia or focal cerebral ischemia. To mimic ischemic stroke in patients, in whom approximately 80% thrombotic or embolic strokes occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), the intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is quite relevant for stroke studies. This model was first developed in rats by Koizumi et al. in 1986 1. Because of the ease of genetic manipulation in mice, these models have also been developed in this species 2-3.
	Herein, we present the transient MCA occlusion procedure in C57/Bl6 mice. Previous studies have reported that physical properties of the occluder such as tip diameter, length, shape, and flexibility are critical for the reproducibility of the infarct volume 4. Herein, a commercial silicon coated monofilaments (Doccol Corporation) have been used. Another great advantage is that this monofilament reduces the risk to induce subarachnoid hemorrhages. Using the Zeiss stereo-microscope Stemi 2000, the silicon coated monofilament was introduced into the internal carotid artery (ICA) via a cut in the external carotid artery (ECA) until the monofilament occludes the base of the MCA. Blood flow was restored 1 hour later by removal of the monofilament to mimic the restoration of blood flow after lysis of a thromboembolic clot in humans. The extent of cerebral infarct may be evaluated first by a neurologic score and by the measurement of the infarct volume. Ischemic mice were thus analyzed for their neurologic score at different post-reperfusion times. To evaluate the infarct volume, staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) was usually performed. Herein, we used cresyl violet staining since it offers the opportunity to test many critical markers by immunohistochemistry. In this video, we report the MCAO procedure; neurological scores and the evaluation of the infarct volume by cresyl violet staining.

The intraluminal middle cerebral occlusion model in mice is herein presented. The extent of cerebral infarct is evaluated by a neurologic score and cresyl violet staining, an alternative staining to TTC, offering the great advantage to test in parallel many interest markers.

מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining endocochlear potential, ion transport, and fluid balance. Different forms of hearing disorders are reported to involve abnormal microcirculation in the cochlea. Investigation of how cochlear blood flow (CoBF) pathology affects hearing function is challenging due to the lack of feasible interrogation methods and the difficulty in accessing the inner ear. An open vessel-window in the lateral cochlear wall, combined with fluorescence intravital microscopy, has been used for studying CoBF changes in vivo, but mostly in guinea pig and only recently in the mouse. This paper and the associated video describe the open vessel-window method for visualizing blood flow in the mouse cochlea. Details include 1) preparation of the fluorescent-labeled blood cell suspension from mice; 2) construction of an open vessel-window for intravital microscopy in an anesthetized mouse, and 3) measurement of blood flow velocity and volume using an offline recording of the imaging. The method is presented in video format to show how to use the open window approach in mouse to investigate structural and functional changes in the cochlear microcirculation under normal and pathological conditions.

An open vessel-window approach using fluorescent tracers provides sufficient resolution for cochlear blood flow (CoBF) measurement. The method facilitates the study of structural and functional changes in CoBF in mouse under normal and pathological conditions.

מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

דגימת דם חוזרת מהווריד הסובקלבי של חולדה מודעת

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת

הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה

מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

שיטה פשוטה של אינטובציה ריאות המאוסות

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

דגימת דם חוזרת מהווריד הסובקלבי של חולדה מודעת

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת

הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה

מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

דגימת דם חוזרת מהווריד הסובקלבי של חולדה מודעת

שיטה פשוטה של אינטובציה ריאות המאוסות