נתיחת השק האנדולימפטי מעכברים

השק האנדולימפטי נדרש להתפתחות תקינה של האוזן הפנימית. מכיוון שהוא אינו נגיש באתרו למחקרים מבניים, פיזיולוגיים ומולקולריים, הנתיחה שלו ממודלים של בעלי חיים, במיוחד מודלים של עכברים, היא חיונית. דיסקציה והכנה של השק האנדולימפטי קשים ביותר בשל מבנה האפיתל הדק והעדין שלו, וקרבתו והיצמדות שלו לרקמות סמוכות.

הגישה שלנו מאפשרת הדמיה וזיהוי של שק והפרדתו מרקמות סמוכות. מחלות והפרעות המשפיעות על תפקוד תקין של השק האנדולימפטי עלולות להוביל לאובדן שמיעה ושיווי משקל. הטכניקה שלנו חיונית כדי להבהיר את התהליכים התאיים, המולקולריים והפיזיולוגיים העומדים בבסיס תפקודי השק האנדולימפטי.

מי שתדגים את ההליך תהיה היון ג'יי לי, פוסט-דוקטורנטית אורחת מהמעבדה שלי. התחילו בסידור הכנת האוזן הפנימית בצלחת תרבית רקמה 35 מ"מ המכילה PBS כאשר שורש עצב הגולגולת השמיני מכוון כלפי מעלה. בעזרת מלקחיים מס' 4 מחזיקים את הרקמה בשבלול ומזהים את אמת שיווי המשקל, את התעלות החצי עגולות הקדמיות והאחוריות, את הקרוס המשותף ואת הסינוס הסיגמואיד.

לאחר מכן השתמש במחט 27 מד המורכבת על מזרק של מיליליטר אחד כדי לחתך את הדורה מאטר ואת אמת שיווי המשקל, כמו גם את רקמות החיבור הבסיסיות המקיפות את השק האנדולימפטי. לאחר ביצוע חתך ברקמת החיבור הצידית לשק האנדולימפטי, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את רקמת החיבור ולקלף אותה על ידי משיכתה מהעצם הרקתית. בזהירות להסיר את כל הפסולת שנותרה ולהפריד את אפיתל השק endolymphatic מן הרקמות שמסביב.

לדיסקציה של השק האנדולימפטי הפתוח, החזיקו את חלק הגבעול של ההכנה כדי לצפות בחתך הרוחב של הלומן. לאחר מכן הכנס מחט 27 מד לתוך לומן ולהעביר אותו לחתוך את השק endolymphatic לשני סדינים. החזק את הקצה של כל רקמה דמוית יריעה עם מלקחיים והפרד אותם זה מזה.

בניתוח המייצג, קטע באמצע הגולגולת של עכברים אלה לפני ואחרי הסרת חצי המוח הודגם עם פלואורסצנטיות tdTomato. השק האנדולימפטי נראה בקלות גם ללא נתיחה. אוזניים פנימיות של עכברים ביום העוברי 16.6 וכן ביום 5 ו-30 לאחר הלידה בודדו.

השקים האנדולימפטיים נצפו בהגדלה גבוהה יותר. עבור עכברי P30, קשה לבודד את הצינור האנדולימפטי בשל הקפסולציה שלו בעצם. אימונוהיסטוכימיה של שקיות אנדולימפטיות שלמות מ-E16.5 ו-P5 נחקרה עם תיוג נוגדנים אנטי-SLC26A4 ופאלואדין.

פאלואדין שימש להדגשת השק האנדולימפטי ורקמת הלחמית סביבו. תמונות בהגדלה גבוהה של אפיתל שק אנדולימפטי פתוח ב-P5 מראות SLC26A4 המסומן בירוק ממוקם באזור האפי של תת-קבוצה של תאים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא להיות עדין מאוד כדי למנוע פגיעה בשק האנדולימפטי.

רקמת שק אנדולימפטי קבועה המבודדת בגישה זו יכולה לשמש להכלאה באתר, היקף RNA ואימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש ברקמה חיה להכנת RNA לניתוח שעתוק ולפיזיולוגיה. גישה זו שימשה לחקר התעתיק של השק האנדולימפטי, כשלם או בניתוח RNA-seq של תא בודד כדי לתרום לאפיון סוגי התאים השונים שלו.