ברצוננו להודות לפטרישיה Wadsworth על המתנה של מבנה kinesin-5. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (5 R01 GM107026) לTJM ועל ידי מענק מחקר מס &#39;5-FY13-205 מהמצעד הפרוטות קרן לTJM, כמו גם תמיכה מקרן צ&#39;רלס ה&#39; הוד, Inc, בוסטון, מסצ&#39;וסטס. לTJM

1. תאי transfecting S2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ25 סנטימטר 2 בקבוק תרבית בעבר, להוסיף GFP-להביע טובולין α תאי S2 10 עד נפח סופי של 2 מיליליטר ב 100% confluency, ולאפשר להם חצי לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ ל כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהצלחת. Transfect 2 מיקרוגרם של Eg5-mCherry לבנות 11 עם 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר בתוספת 10% FBS (המכונה להלן בתקשורת של שניידר) וTransfection מגיב, בעקבות הפרוטוקול של היצרן. לאטום את הצלחת עם Parafilm ו דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר. חזור תאים 25 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 לאחר transfection, להעביר 500 μl של תאי transfected לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה 35 מ&quot;מ המכילה 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לאינדוקצית מבחן. לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO </sub&gt; לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. חותם את הצלחת בParafilm ולדגור על 25 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip כדי להפוך coverslips מצופה concanavalin, מספיק נפח פיפטה של concanavalin פתרון (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר מומס בH 2 O) למעייל חומצה שטפה, להסיר את העודפים, ולאפשר את coverslip לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip מצופה concanavalin x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ בצלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ נקייה, אז זרע 500 μl ב 100% confluency של התאים המושרה על coverslip ולאפשר לתאים לדבוק במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לביטוי Eg5-mCherry, להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי הדמיה מתאימים) עם תקשורת להדמיה ב RT על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש במקורות אור מתאימים ומערכות סינון לדמיין את התאים. לדוגמא, יש מיקרוסקופ השתמש במחקר זה מקור LED לבן אור וEGFP (FITC / Cy2) וDsRed (TRITC / Cy3) קוביות מסנן. Eg5-mCherry localizes לmicrotubules ומועשר Neaקטבי כישור r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שווידאת כי התאים מביעים שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, להעביר את שארית תאי transfected, uninduced לבקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים המכיל 4 מיליליטר של התקשורת של שניידר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Blasticidin S HCL בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מיליליטר לבקבוק של תאי transfected ולהמשיך פיצול בנוכחות של 25 מיקרוגרם / מיליליטר Blasticidin S HCl עד המוות של תאים מפסיק להיות בטוח כדי לבדוק ביטוי של Eg5-mCherry מעת לעת. דגירה שורות תאים ב 25 מעלות צלזיוס חממה. הערה: אחוז התאים לבטא עליות Eg5-mCherry לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי transfected ביציבות, תמשיך לפצל בהעדר התרופה ולהקפיא 12 תאים לשימוש עתידי. </li></ol> הפרעת 2. RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר אזור נ&quot;ב ~ 500 של Klp61F מcDNA (LD15641) באמצעות פריימר עם רצף הוסיף אמרגן T7 (רצף שנקבע בחומרי רשימה) להיותמשמש כתבנית לסינתזת dsRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ארבע תגובות PCR, 50 μl כל, המכילות DNA של תבנית 100 ng, 25 מיקרומטר של כל צבע יסוד, מאגר מתאים, ופולימראז. הגדר את פרוטוקול ה- PCR על thermocycler על פי הפרוטוקול של היצרן של פולימראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה וארבע תגובות נקיות PCR באמצעות PCR לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. אחסן את התבנית נקייה ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RNA גדילים הכפול (dsRNA) מתבנית בעזרת ערכת שעתוק RNA T7, הבאים להוראות היצרן. מצפה ~ ריכוז 5-15 מ&quot;ג / מיליליטר של dsRNA. אחסן dsRNA ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למציאת Klp61F עם dsRNA, מאפשר לתאים S2 להביע Eg5-mCherry בconfluency 25% ללמחצה לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהמנות ולהוסיף 5 מיקרוגרם של dsRNA נגד Klp61F (דרוזופילה kinesin-5) מדולל ל1 מיליליטר של שניידר סרום ללא &#39;תקשורת של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT עבור שעה 1, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר עם 10% FBS. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר טיפול dsRNA, לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה עוד 24. </li></ol> 3. הדמיה של תא חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ concanavalin coverslip מצופה לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 500 μl של התאים שטופלו בdsRNA ומושרה O / N על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי מתאים) להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תאי mitotic להביע שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין. הערה: תאי mitotic להביע GFP-α-טובולין רק צריך צירים monopolar מאז Klp61F, אשר נדרש לדו-קוטבי ציר, הוא הפיל 10,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות של צירים דו קוטביים (למשל, 1 מסגרת לדקה) זמן לשגות בתאים המבטאים את שני Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה, להסיר את המדיה מתא הוורד, ולהחליף אותו בתקשורת של שניידר מכילה STLC 1 מיקרומטר מעל 3 חילופים רצופים תקשורת (~ 5 מיליליטר סה&quot;כ) לתוך התא לדמיין קריסת ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכישלון התרופה ולהפוך את קריסת הציר, להסיר בזהירות את התקשורת המכילה STLC מתא הוורד, ולשטוף בתקשורת של שניידר 4x (סה&quot;כ 6-8 מיליליטר) לפני מילוי תא הוורד בפעם האחרונה עם תקשורת טרי. תמשיך הדמיה. </li></ol> Assay תיקון 4. שגיאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ concanavalin coverslips מצופה לתרבות מנות רקמה 35 מ&quot;מ נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 500 μl של תאים שטופלו בKlp61F dsRNA על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאי adherאד, להוסיף 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לכל מנה להביא את הנפח הסופי עד 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התאים במיטוזה, להוסיף MG132 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר לכל אחד מהכלים, ודגירה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף STLC 1 מיקרומטר דגירה עבור שעה 1 כדי לאפשר ליצירת מונופולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את STLC על ידי שטיפת coverslips פי 3 עם 2 מיליליטר של התקשורת של שניידר הטרי בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עם התקשורת של שניידר, בנוסף לכל תרופות תרופתיות (למשל, מעכבי קינאז אורורה) או DMSO כביקורת. הערה: ריכוזי מונעי להשתנות וריכוזים סופיים נכונים צריכים להיקבע על ידי הנסיין. פתרונות מניות נעשים בדרך כלל כזה שהמעכב מדולל 1: 1,000 לתקשורת. במקרה זה דילול 1: 1000 של DMSO (או ממס מתאים) משמש כשליטה ברכב. אנו משתמשים ב מעכב אורורה Binucleine 2 בריכוז סופי של 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאי T בנקודתי זמן שונהo לבחון את ההתקדמות של היווצרות ציר דו קוטבית ולהעריך מדינות מצורפים kinetochore. לתקן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות לשטוף את coverslips עם 2 מיליליטר של 1x BRB-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של paraformaldehyde 10% בדילול מלא 1x BRB-80 במשך 10 דקות. paraformaldehyde Pipet זהירות במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 1% Triton-X במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips תא-צד עם הפנים כלפי מעלה על גבי גיליון של Parafilm (השתמש סמן כדי לתייג Parafilm כראוי כדי לעקוב אחר השקופיות) בצלחת פטרי 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את coverslips עם 150 סרום μl מבושל חמור (BDS) ולדגור על RT עבור שעה 1 לחסום נוגדן שאינו ספציפי מחייב. שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. כדי להפוך את תא הלחות, בשורה על שפת צלחת 150 מ&quot;מעם מעבדה רטובה לנגב ומכסה במכסת צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בלוק, ודגירת coverslips עבור שעה 1 ב RT עם 150 μl של נוגדנים עיקריים מדולל כראוי בBDS להכתים לkinetochores וmicrotubules לריכוזים סופיים של 2 מיקרוגרם / מיליליטר (או על פי המלצות יצרן) ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה . שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips במשך 30-60 דקות ב RT עם נוגדני fluorophore מצומדות המתאימים המשניים המדולל בBDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עם 150 μl של ה- BDS המכיל 1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI ריכוז סופי למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 2x עם 1x PBS + 0.1% Triton-X, והר גoverslips צד תא על שקופית 3x1 &quot;עם 8 μl של ההרכבה תקשורת. צבע הפינות עם לק כדי לשתק את coverslips על גבי שקופיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה עם צירים דו קוטביים שמביעים Eg5-mCherry. קח סדרת Z בהיקף של 30 מטוסים במרווחים 0.2 מיקרומטר בכל הערוצים באמצעות מטרת 100X. לנתח בזהירות את kinetochores וmicrotubules כדי לקבוע את המדינות מצורפים (bioriented או קבצים מצורפים syntelic). </li></ol>

<ol>
	<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface.">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li><li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Welcome+to+a+new+kind+of+tension:+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal.">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li><li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors.">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li><li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division.">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site.">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li><li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors:+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms.">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li><li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol.">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).</li><li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis:+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line.">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li><li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay.">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells.">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חזותי תיקון שגיאות היא טכניקה רבת ערך כדי ללמוד את הצעדים כרוכים בתהליך תאי חשוב ומורכב זו. לשם כך, קבצים מצורפים שגויים נוצרים באמצעות מעכבים הפיכים, ותיקון שגיאות נצפה על כישלון של התרופה. assay זה היה במקור פותח באמצעות תאים בתרבית רקמת יונקים 5. עם זאת נוכחותם של מספר הגדול של kinetochores בסוגים רבים של תאי יונקים מודל מציבה אתגר בהתבוננות אירועי תיקון שגיאות בודדים. תאי תסיסנית S2 יש כמה כמו 4 זוגות של kinetochores, מה שהופך אותם שורת תאים עדיפה יותר להתבוננות תיקון שגיאות. עם זאת, חסרון עיקרי הוא שמעכבים רבים אינם יעילים בתאי תסיסנית S2. לפיכך, את היכולת ליצור שורת תאי תסיסנית S2 אנושית להביע kinesin-5 אנושיים מספקת כלי רב ערך כדי ללמוד תיקון שגיאות. למרות שתאי תסיסנית S2 יכולים להיותשורת תאים טובה יותר ללמוד תיקון שגיאות, השלבים המרובים הכרוכים בהשגת שורת התאים ודריסת גנים חיוניים מציבה כמה אתגרים לטכניקה זו. לדוגמא, יעילות transfection יכולה להיות נמוכה למדי. אם פחות מ -20% מהתאים המבטאים את Eg5-mCherry, transfection יש לחזור כתהליך הבחירה ייקח זמן רב יותר. כמו כן, אחוז תאי המבטאים שני חלבוני הניאון עלול להפחית לאורך זמן. זה ניתן להתגבר על ידי פיצול תאים בנוכחות Blasticidin S HCl וhygromycin B כדי לבחור עבור תאים לבטא Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, בהתאמה. כמו כן, חשוב לשים לב שיש לי תאי תסיסנית S2 orthologues לחלבונים רבים ואנושיים; לכן, זה קריטי, כדי לייעל את התנאים למציאת החלבונים אנדוגניים. תנאי מציאה אופטימליים עשויים להשתנות בסך של dsRNA ומשך טיפול. בהתחשב בהופעתה והשיפור המהיר של CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, דור של שורת תאי תסיסנית עם גן Klp61F הוחלף על ידי Eg5 אדם מציג חלופה רבת עוצמה שהיה להתגבר על המגבלות של transfection וגישת מציאה. העבודה שלנו מוכיחה כי לטוס לאדם החלפת גן צריך להיות אפשרות מעשית במקרה זה למרות שהחומרים כימיים הדרושים כדי לעשות זאת בתאי תסיסנית S2 כרגע בשלבי פיתוח. הליך זה אינו מוגבל לEg5, אבל יכול להיות מיושם ללמוד את הפונקציה של חלבונים אחרים בעלי עניין. אם באמצעות מעכבים שהעבר הוקם כדי להיות יעיל בתאי תסיסנית S2, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של מעכבים בתאים חיים חששות לגבי השפעות היעד בלי. שורת התאים הופקה באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש גם בהקרנת תפוקה גבוהה מנתח לזהות תרופות פוטנציאליות מיקוד חלבונים מעורבים בתיקון שגיאות.

הפרדה שווה של הגנום בעת חלוקת תא דורשת אינטראקציות נכונות בין microtubules DNA והציר המשוכפל. Microtubules אינטראקציה פיזי עם הכרומוזומים באמצעות הרכב של חלבונים שמרכיב בcentromeres הידוע כkinetochore 1. הפצה נכונה של הכרומוזומים דורשת שkinetochores אחותם bioriented, שבו כל אחות קשורה microtubules מקורם קטבי ציר הפוכים. microtubule Kinetochore (KT-MT) קבצים מצורפים שאינם בקונפורמציה bioriented הם ערערו במהירות וביעילות כדי לספק את ההזדמנות להקים biorientation בתהליך המכונה תיקון שגיאות. Assay תיקון שגיאות שהוקם בעבר בתאי יונקים 5 דורש הרכבת צירים monopolar באמצעות מעכבי מולקולה קטנים הפיכים נגד Eg5 (kinesin-5). הטיפול התרופתי מייצר שפע של קבצים מצורפים syntelic שגויים שבבוטkinetochores אחות h לצרף לאותו מוט הציר. כישלון הבא של התרופה מאפשר להדמיה של תהליך תיקון השגיאות. Assay תיקון שגיאות יכול להיעשות בנוכחות של מעכבי מולקולה קטנים או knockdowns ללמוד את התרומה של חלבוני מועמד לתיקון קבצים מצורפים KT-MT שגויים. היכולת לדמיין תיקון שגיאות בתאים חיים היא כלי רב עוצמה כדי להבין את המנגנון המולקולרי מעורב בתהליך מורכב זה עוד יותר. עם זאת, המספר הגדול של כרומוזומים קיימים ברוב שורות תאים מציב אתגר בהתבוננות קבצים מצורפים KT-MT בודדים. תאי תסיסנית S2 יהיו אידיאליים ליישום assay תיקון שגיאות כפי שהם מכילים כמה כמו 4 כרומוזומים 6, אבל מעכבי מולקולה קטנים של kinesin 5 כגון S-trityl-L-ציסטאין (STLC) וmonastrol 7-9 אינו משפיע על הרכבה ציר או kinesin-5 תפקוד מוטורי בתאי תסיסנית. לכן אנו generaטד שורת תאי תסיסנית S2 להביע kinesin-5 האדם תחת אמרגן מושרה שהוא רגיש לkinesin-5 מעכבים. פרוטוקול זה מתאר כיצד מציאה homologue תסיסנית kinesin-5 אנדוגני, Klp61F, ולהשתמש בקו זה התא בassay תיקון שגיאות מבוססי התאים.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F נדרש כדי ליצור צירים דו קוטביים. Kinesin-5 האנושי, Eg5, יכול להציל את הפונקציה של Klp61F בתאי תסיסנית S2 (איור 1 א ו- D). עם תוספת של מעכב 5 kinesin (STLC), רמות microtubule הקשורים לירידה המוטורית (איור 1 ו- E), וקריסת הציר, וכתוצאה מכך מונופול (איור 1 ג וF) בתאים חסרי Klp61F אנדוגני על RNAi המוצלח (סרט נוסף 1). ראוי לציין כי צירים דו קוטביים יקרסו על תוספת של STLC בתאים אנושי S2 כי kinesin-5 פעילות אינה נדרשת לשמור על דו-קוטבי ציר בתאים אנושיים. פער זה עשוי להיות מעניין תוצאה מהבדלים בחפיפת microtubule interpolar ו / או יציבות במערכות מודל שני 14. ניתן Reve (איור 2 א ו- E) Kinesin-5 עיכוב<html> rsed על ידי שטיפה את התרופה וההתאוששות של ציר דו קוטבי ניתן בעקבות לאורך זמן. עם הסרת המעכב (איור 2 ו- F), Eg5-mCherry מחדש מקורבים עם microtubules כמרכיב ציר דו קוטבי (איור 2C ו- G), ותאים יכולים להתקדם לanaphase דו קוטבית (איור 2 ד ו H, סרט נוסף 2 ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> איור 1. תוספת של STLC 1 מיקרומטר מוביל לצירי monopolar בתאי תסיסנית S2. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (AC) וה- GFP-α-טובולין (DF) בתוספת של 1 מיקרומטר STLC. Eg5 המעכב נוסף בבית 3 דקות. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת = דקות: שניות.<html> &quot;Target =&quot; _ w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> איור 2. רפורמות ציר דו קוטביות עם הסרת STLC. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית 2 להביע Eg5-mCherry (AD) וה- GFP-α-טובולין (EH) במהלך ניסוי כישלון STLC. STLC היה דהוי ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת STLC. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת: דקות:. שניות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> &quot;Target =&quot; _ ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov blank &quot;&gt; סרט נוסף 1. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry ( משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). STLC 1 מיקרומטר התווסף ב -2 דקות, וצורות ציר מונופול בתוך 10 דקות לאחר תוספת של המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשנייה. בר סולם = 5 מיקרומטר. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">סרט נוסף 2. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a> הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). ומדיה המכילה STLC 1 מיקרומטר הוסרהלשטוף ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשניה. בר סולם = 5 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Views.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Video: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Neuroscience

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

וזמינותו מבוססת תא לחקור שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II Contractility ויה gastrulation מקופל איתות לשביל בתאים S2R + דרוזופילה

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Developmental Biology

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 בדרוזופילה

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

מחבר זרקור: עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

יצירה "אנושי"

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

וזמינותו מבוססת תא לחקור שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II Contractility ויה gastrulation מקופל איתות לשביל בתאים S2R + דרוזופילה

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

יצירה "אנושי"

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

וזמינותו מבוססת תא לחקור שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II Contractility ויה gastrulation מקופל איתות לשביל בתאים S2R + דרוזופילה

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל