פרוטוקולים אלה יסייעו לכל חוקר לשלב את השימוש בקווי תאים Drosophila כדי לנהוג או להשלים את סדר היום המחקרי שלהם. רוב אם לא כל תרבות התא Drosophila להחיות, להתרבות, קריו לשמר היטב כאשר מטופלים על פי הנחיות אלה. לאחר ניגוב משטח העבודה של מכסה המנוע לזרימה למינארית עם 70%אתנול, מחלקים חמישה מיליליטר של המדיום המתאים לתוך 25 ס"מ בריבוע T-בקבוק.
מנגבים את מיכל קו התאים הקפואים עם 70% אתנול ומשחררים בזהירות ומשחררים את המכסה. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר בינוני מן הבקבוקון כדי cryo-vial בעדינות לערבב להפשיר את התאים הקפואים. טיפול כי ההשעיה התא אינו עולה על גדותיו, להעביר את כל נפח ההשעיה תא מופשר לבקבוק ולשטוף את ההקפאה-בקבוקון עם מדיום טרי.
אפשר לתאים להתיישב לתחתית הבקבוק לפחות שעתיים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס. אין להחזיר תאים קפואים הארוזים לנסיעה חזרה למקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס לתקופה ממושכת או לחנקן נוזלי. במקום זאת להפשיר את התאים בהקדם האפשרי.
לאחר אישור התקשרות תחת מיקרוסקופ אור, בעדינות להחליף את supernatant עם חמישה מיליליטר של מדיום טרי לפני החזרת הבקבוק לאנקובטור. לחלופין, לאחר הפשרה, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום טרי לפני הזריעה לתוך בקבוק T-25 כפי שהודגם רק. כדי לקבוע אם התאים מוכנים למעבר, בחן את המורפולוגיה והמלומה של התרבות תחת מיקרוסקופ.
בהתחשב בצפיפות התאים ובזמן ההכפלה, בפעם האחרונה התאים היו בתת-תרבת, וכל סימן לזיהום מיקרואורגניזם בתרבות. אם התרבות נראית מאוד confluent, להשתמש עשרה מיליליטר של supernatant התרבות בעדינות לנתק את התאים מלמטה צלחת התרבות ולקבוע את צפיפות התא על ידי ספירת מספר התאים קיימא המתלים תא יחיד וכתוצאה מכך. תת-תרבת את התאים אם צפיפות התאים היא בין חמש לעשר פעמים עשר לתא השישי למיליליטר במדיום המתאים.
הוסף לפחות פעם אחת עשר לתאים השישיים לריכוז מיליליטר בצלחת תרבות חדשה כדי להשיג את צפיפות תאי הזריעה הרצויה. לאחר מכן לכסות ולתייג את הצלחות עם ראשי התיבות של האופרטור, תאריך, יחס פיצול, צפיפות תא זריעה, מזהה קו התא, בינוני, מספר המעבר, וכל תוספות בינוניות כגון אנטיביוטיקה, ולמקום את הצלחות לתוך מיכל פלסטיק עבור הדגירה המתמשכת שלהם ב 25 מעלות צלזיוס אינקובטור. כדי לנטרל תאים חסידים טופס צלחת תרבות 100 מילימטר התחתון, תחילה להעביר את כל העל טבעי לתוך בקבוק סטרילי ולשטוף את התאים עם תוספת איטית של מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA.
בעדינות מערבולת כדי להבטיח כי פתרון טריפסין מכסה את פני השטח הצמיחה כולה לפני השלכת הפתרון. לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 1-2 מיליליטר של 0.05% טריים טריים טריים EDTA לצלחת ומ מניחים את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד עשר דקות. כאשר ניתן לראות את שכבת התא מתנתקה ומחליקה מפני השטח הגדלים, הפסק את פעילות הטרפסין עם תוספת של תשעה מיליליטר של העל-טבעי שנשמר וערבב את מתלי התא ביסודיות כדי לנתק את גושי התאים.
כאשר כל התאים כבר נקע, פני השטח הגדלים יהיו ברורים. כדי לספור ידנית את התאים באמצעות שקופית ספירת תאים של Neubauer, נגב תחילה את פני השטח של מגלשת המוציטים וכיסוי עם 70% אלכוהול. לאחר הערבוב, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של התאים לכל קצה מחוריץ של ההמוציטומטר כדי למלא את שני התאים.
השעיית התא תימשך לתא הספירה על ידי פעולה נימית. באמצעות מטרת מיקרוסקופ 10x, לספור בין 100 ל 200 תאים בתוך אזור בריבוע מילימטר אחד באמצע הרשת מאוגד על ידי הקווים המקבילים. לאחר מכן חזור על הספירה עם התא השני ולהשתמש בממוצע של שני הספירות כדי לקבוע את צפיפות התא על פי הנוסחה.
עבור שימור קריו קו תא Drosophila, להשעות מחדש את גלולת התא בנפח של מדיום הקפאה שתביא צפיפות התא הסופי של לפחות ארבע פעמים עשר לתאים השביעי למיליליטר. הוסף נפח מתאים של מגן קריו, דימתיל sulfoxide או DMSO, לתוך ההשעיה התא טיפה חכם, כך ריכוז DMSO הסופי הוא 10% בעדינות לערבב את ההשעיה התא. לאחר מכן, בזהירות להוסיף 0.5 aliquots מיליליטר של ההשעיה התא לתוך הקפאה שכותרתו מראש בקבוקונים ומניחים את ההקפאה בקבוקונים לתוך מיכל הקפאה מלא isopropanol.
לאחר מכן מעבירים את מיכל ההקפאה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי לאפשר לטמפרטורה של הבקבוקונים ההקפאה לרדת לאט לטמפרטורת המקפיא. לאחר מכן, מעבירים במהירות את ההקפאה-בקבוקונים למ מקלות להכנסה לתוך מיכל חנקן נוזלי. לחלופין, מעבירים את הבקבוקונים הקפואים לקופסת הקפאה מקורר מראש ומאחסנים את בקבוקוני ההקפאה הקפואים בשלב הנוזלי של מקפיא חנקן.
ההתכנסות של קו תא יכולה להיקבע על ידי מיקרוסקופ אור. קווי תאים הגדלים במהירות ולהגיע להתכנסות מוקדם צריכים לעבור באופן קבוע, עד פעמיים בשבוע. לעומת זאת, תאים הגדלים לאט ניתן לעבור לפחות פעם בשבועיים או יותר, אם כי תאים אלה צריכים להיות מוזן בינוני טרי מדי שבוע.
קווי תאים הנגזרים ממקורות רקמה משתנים שונים במורפולוגיה שלהם, במאפייני הדבקה, בדרישות המדיה ובזמנים הכפלתיים. עבור ניסויים כמותיים, ספירת תאים היא חיונית. ניתן לספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה חלקיקים אוטומטי.
התכנסות תאים היא קו עזר חזותי למתי לתת-תרבות עבור האופרטור המנוסה. עם זאת, ספירת תאים מובילה ללוח זמנים צפוי של תת-תרבות ומאפשרת זיהוי של חריגות צמיחה. היזהר ולהשתמש בציוד המגן המתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
