העבודה בכתב יד זה נתמכה על ידי כספים מחוג לאונקולוגיה הקרינה וצייד מכון הסרטן והמכון הלאומי לבריאות מענק (R01-CA188520) לSB. אני מודה דניאל ג&#39;ונסון וסטיבן בנט במעבדה שלי עבור הוכחה בפרוטוקול ומסביר את היתרונות שלה. אני אסיר תודה לד&quot;ר מאהש Chandrasekharan (צייד מכון הסרטן) להערות ביקורתיות על כתב היד.

1. immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הבאים תיוג BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי NIH3T3 תרבות בנוכחות או DMSO או מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול במעכבים סלקטיביים DMSO או HDAC1,2, להוסיף BrdU לתאים בתרבית רקמת מכסה המנוע סטרילי. דגירה 2 x 10 6 NIH3T3 תאים מצופים ב 10 מיליליטר תקשורת NIH3T3 עם 20 מיקרומטר ריכוז סופי של bromodeoxyuridine (BrdU) במשך 60 דקות בתרבית רקמת חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני Crosslink תאיים ל- DNA על ידי הוספת פורמלדהיד ישירות לתקשורת והתרבות בריכוז סופי של 1%. דגירה 2 x 10 6 תאי NIH3T3 עם פורמלדהיד ב RT במשך 10 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הקישור הצולב על ידי התוספת של גליצין לריכוז סופי של 125 מ&quot;מ. לדגור על RT במשך 5 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולאסוף תאים בPBS בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. cel ספיןLS 956 בXG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS קר כקרח. הסר PBS מהצינור. אחסן את התא גלולה צולבים ללא PBS (supernatant) ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את lysate מהתא גלולה crosslinked על ידי הוספת חיץ FA140 500 μl (50 מ&quot;מ של HEPES KOH 7.5 pH, 140 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגזירה הכרומטין ידי sonicating דוגמאות חמש פעמים ב -35% כוח ועם דופק 15 שניות, 0.9 שניות ובהגדרה 0.1 שניות מ. שמור את הצינורות על קרח לאחר כל סיבוב של sonication כדי למנוע חימום של הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הגז על ג&#39;ל DNA כיעילות הגז תנוע בין sonicators שונה. כדי לבדוק sonication, הפוך crosslink ידי הוספת NaCl בריכוז של 0.16 M ולבצע צעדים 1.17.1. - 1.22. הפעלת eluted 10 DNA μl על ג&#39;ל agarose 1.5% כדי לבדוק אם הגז הואבין 300-700 נקודות בסיס בעוצמה ממוצעת על 500 נקודות בסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות sonication, דגימות צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 17949 XG ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הערכת חלבון באמצעות ערכת assay החלבון המסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש בכמות שווה של lysate לשבב של שליטה ודגימות ניסוי. בדרך כלל, להשתמש 1 מ&quot;ג של lysate הכולל לכל תגובת שבב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרחיף 50% מ- agarose חלבון באמצעות חיץ FA140 המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל. להוסיף 1/10 נפח של מעכבי פרוטאז הקוקטייל. חשב את הנפח של חרוזים צורך מבוסס על מספר הדגימות בסך הכל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים-agarose חלבון לשטוף עם חיץ FA140 פעמיים כדי להסיר את חיץ האחסון ולהוסיף נפח שווה לחיץ FA140 לחרוזים לעשות slurry 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר חלבונים שאינם במיוחד לאגד את חרוזים, להוסיף 50 μl של תרחיף 50% מ- agarose חלבון ובcubate הדגימות ב 4 ° C עם רוטציה הסוף-על-קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות ב956 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך דקה. לאסוף את supernatant ולבצע immunoprecipitation על ידי הוספה או נוגדן H4K16ac 8 μl או 5 μl (5 מיקרוגרם) של 1 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדן SMARCA5 לsupernatant. דגירה על 4 מעלות CO / N עם סיבוב קצה על קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסכים 1/10 בתמצית לשליטה &#39;קלט&#39; ולהגדיר אותו כצד ב -20 ° C. הקלט צריך להיות הפוך צולבים יחד עם דגימות ה- IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמות שווה של IgG ארנב (5 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר) כמדגם immunoprecipitation ביקורת השלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 50 μl של 50% תרחיף-agarose חלבון לתמצית דגירה עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים agarose ידי צנטריפוגה ב956 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant וwa זהירותsh חרוזים עם המאגרים ברצף הבאים. בהכנות חיץ, להוסיף מעכבי פרוטאז ממש לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מלח נמוך מורכבת הצפת לשטוף חיסונית (FA140; ריכוז סופי של 50 מ&quot;מ של HEPES KOH pH 7.5, 140 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מלח גבוה קומפלקס הצפת לשטוף חיסונית (FA500; ריכוז סופי של 50 מ&quot;מ של HEPES KOH pH 7.5, 500 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם LiCl מורכב הצפת לשטוף חיסונית (ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ של טריס-Cl pH 8.0, 250 מ&quot;מ של LiCl, 0.5% ו -0.5% NP40 deoxycholate נתרן) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה הסוף-על-קצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שטיפות כפי שתואר לעיל, להוסיף 200 פתרון elution μl (ריכוז סופי של SDS 1% ויקרבונט 100 מ&quot;מ נתרן) וincubatדואר ב RT במשך 15 דקות עם סיבוב קצה על קצה על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות ב956 XG ב RT ולהעביר את eluate לצינור 1.5 מיליליטר חדש. חזור על שלב 1.15 עם פתרון elution 200 μl נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 μl של eluate, להוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M ומערבבים היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, להוסיף פתרון elution 400 μl 10 קלט μl שלהפריש (שלב 1.11) ולהוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M להפוך דגימות קלט crosslink גם כן. הפוך crosslink הדגימות ידי דוגרים באמבט המים C ° 65 במשך 5 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 100% EtOH לeluate ההפוך-crosslinked. מערבבים היטב דגירה ב -80 ° C 2 - 3 שעות או ב -20 CO ° / N. ספין הדגימות ב17949 XG במשך 15 דקות וזורקי אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 800 אתנול 70% μl ללשטוף את הכדור. ספין ב17949 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקי אתנול. ספין בקצרה כדי להסיר כל אתנול שיורית. האוויר יבש הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר אתנול שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים DNA ב -90 RNase μl ומים חופשיים DNase ולהוסיף 2 μl 10 מ&quot;ג / מיליליטר RNase ב0.2 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז סופי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl 10x proteinase K הצפת (100 מ&quot;מ טריס pH-Cl 8.0, 50 מ&quot;מ EDTA pH 8.0, 5% SDS). מערבבים היטב ומוסיף μl 1 proteinase ק לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA קלט והשבב באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR על פי הפרוטוקול של היצרן וelute DNA במי 50 μl. DNA החנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. חריץ ניתוח כתם של השבב ה- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את התשואה של קלט ושבב ה- DNA eluted במי 50 μl כמתואר בשלב 1.22 באמצעות ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמויות שווה (50 μl) של קלט או DNA immunoprecipitated שנמצאים בטווח ליניארי של זיהוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, אם קלטתשואת DNA היא 1.5 ng / μl, ואז לקחת 30 μl (או 45 ng DNA סך הכל) ולהפוך את נפח 50 μl עם מים. לשבב גורם, לקחת את כל eluate 50 μl משלב 2.1 והמשיכו לשלב 2.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל 50 קלט μl או DNA immunoprecipitated ידי הוספת 2.5 כרכים של 0.4 N NaOH, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות לXG 956 במשך 10 שניות, ולדגור על RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את ה- DNA מפוגל ידי הוספת 175 μl של 1 M טריס- HCl, pH 6.8, מערבולת, צנטריפוגות במשך 956 XG במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול סדרתי של קלט וDNA immunoprecipitated עבור assay כתם חריץ כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 2.3-2.4 כדי לקבל נפח דגימה כולל של 350 μl (כלומר, 50 קלט μl / השבב ה- DNA, 125 μl 0.4 N NaOH, 175 μl 1 M טריס- HCl, pH 6.8). הערה: הדוגמא האמורה לעיל, 45 ng של DNA הקלט יהיה בסופו .129 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לDNA קלט, תווית שלושה צינורשל 100, 50 ו -25 ולהוסיף 100 μl, 50 μl ו -25 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך את הנפח הסופי 100 μl עם מים nuclease חינם. לשבב ה- DNA, תווית שלושה צינורות 200, 100 ו -50 ולהוסיף 200 μl, 100 μl ו -50 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך נפח סופי 200 μl עם מים nuclease חינם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרום לגודל של מנגנון כתם חריץ. טרום להרטיב את הקרום וניירות סופג ב20x SSC לפני ולפני הוספת ה- DNA. להרכיב אותם למנגנון כתם חריץ על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA Pipet מצעד 2.5.2 לחריצים מתאימים. החל ואקום לאט למשוך את ה- DNA על הממברנה זטה-בדיקה. תפסיק ואקום לאחר כל הדגימות שעברו במנגנון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את המנגנון ולשתק באופן מיידי את ה- DNA על הממברנה באמצעות crosslinker UV. יש צד DNA בcrosslinker UV ולהשתמש autocrosslink ההגדרה בcrosslinker. עקוב הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי BrdU על כתם החריץ על ידי ביצוע מערבי סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם 5% חלב יבש ללא שומן PBS המכילים 0.1% Tween-20 (PBST) במשך שעה 1 ב RT כדי למנוע שאינו ספציפי המחייב של נוגדנים לממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדן ראשוני נגד BrdU (1: 500 דילול) בדילול מלא בחלב 1% יבשים ללא שומן בPBST דגירה הכתם עם הנוגדן הראשוני עבור 3 שעות ב RT על שייקר. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה הנוגדן הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן המשני אנטי עכבר HRP-מצומדות לכתם (1: דילול 5000) ולדגור על RT עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה נוגדנים משני. הערה: השתמש בנפח מספיק של הנוגדנים כדי לכסות את הקרום במהלך incubations נוגדן הראשוני והמשני לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת ECL ולהוסיף אותו לAC הכתםcording לפרוטוקול של היצרן. דגירה הממברנה עם תערובת ECL במשך 5 דקות על RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרום בקלטת רנטגן, לחשוף את הקרום לסרט X-ray ולפתח את הכתם באמצעות הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את האות המתקבל עבור קלט וDNA ChIPed לאחר סריקת הכתמים באמצעות תוכנת J תמונה על פי הפרוטוקול של היצרן. לכימות, להשתמש באות שנמצאת בטווח ליניארי של זיהוי על מנת להבטיח דיוק של מדידה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability.">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression.">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability.">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li><li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC1,2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li><li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair:+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers.">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li><li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains.">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li><li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+dynamics+at+active,+stalled,+and+collapsed+replication+forks.">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li></ol>

I have no competing financial interests.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא שיטה מהירה יחסית להפגין הנוכחות של חלבונים או הצורות שונה לאחר translationally על DNA משוכפל או המתהווה חדשים. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת לאדם למדוד את קינטיקה עמותה-הניתוק של חלבון או צורה שונה שלה עם ה- DNA המתהווה. טכניקה זו היא משלימה את טכנולו?...

תיקון דנ&quot;א פגום ו / או שכפול ה- DNA הוא אחד גורמים עיקריים לחוסר יציבות הגנום, שיכול לגרום למוות של תאים. הפסקת גדיל בודדת מתוקנת כפולה מספיקה כדי לגרום לתא מוות 1. ארגון הכרומטין משתנה זמני במהלך שני השכפול ולתקן 2,3, ואי-שמירה על מידע אפיגנטיים בתהליכים אלה יביאו לאיום על שלמות הגנום. אובדן HDAC3 או פונקצית HDAC1,2 מעכב התקדמות S-שלב, שכפול הדנ&quot;א ותיקון מוביל ללחץ genotoxic (נזק לדנ&quot;א) ותא מות 4-9. לכן אסטרטגיה מעשית לשימוש במעכבי HDAC סלקטיבית לשבש שכפול, תיקון והכרומטין בתאי סרטן ולגרום נזק לדנ&quot;א, אשר בתורו יכול לעצור את הצמיחה ולגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי הסרטן גדלו במהירות. במהלך שכפול הדנ&quot;א, הכרומטין הוא מפורק במהירות ולאחר מכן מחדש הבא שכפול ה- DNA. חדש סאיH4 היסטון nthesized הוא acetylated בK5 ושאריות K12 (H4K5K12ac) והתצהיר הבא על הכרומטין, הם deacetylated במהירות על ידי deacetylases היסטון (HDACs) 10,11. כישלון של תאים כדי לשמור על שלמות הכרומטין המתהווה ידי deacetylation היסטון יכול להוביל לקריסת מזלג, אשר בתורו יכול לגרום לניזק לדנ&quot;א ומוות של תאים. לאחרונה הראה כי עיכוב סלקטיבי של HDAC1,2 מגביר acetylation היסטון (H4K5ac, H4K12ac וH4K16ac) ומעכב את פעילות remodeler הכרומטין SMARCA5 על הכרומטין המתהווה, שבקורלציה עם התקדמות מזלג שכפול מופחתת, הגדילו את קריסת מזלג והגדילו את הנזק לדנ&quot;א מתח מושרה שכפול 6 . לפיכך, טיפול מעכב HDAC יכול לשנות את מבנה הכרומטין המתהווה כדי לעורר נזק לדנ&quot;א ומוות מהר מאוד בתאי סרטן, כמו מחזור תאים אלה במהירות ועובר פעמים רבות דרך S-השלב. לכן חשוב להבין כיצד HDACs לתפקד להסדיר acetylation היסטון ובינדי החלבוןng לשמור שכפול ה- DNA בתאי יונקים. כמותית למדוד את כמות acetylation היסטון וremodeler הכרומטין SMARCA5 קשורה עם DNA המתהווה בעת שכפול ה- DNA, שהמצאנו assay שבב שונה נקרא טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבית. בעקבות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של שינוי חלבון או היסטון רצוי, כמות ה- DNA המתהווה (שכותרתו באמצעות אנלוגי תימידין, BrdU) במדגם השבב ניתן לאתר באמצעות ניתוח מערבי של שכותרת BrdU השבב ה- DNA מועבר על גבי קרום באמצעות חריץ מנגנון כתם. שימוש בטכניקה זו, הראינו כי בן משפחת ISWI SMARCA5 (רגולטור אקטין תלויה הקשורים מטריצה ​​הקשורות SNF SWI / של הכרומטין) remodeler הכרומטין H4K16ac (סימן המעורב באריזת הכרומטין) וקשורים עם ה- DNA בתאים המתהווה S-שלב 6. מצאנו גם כי סימן H4K16ac המתהווה הוא deacetylated ידי HDAC1,2 במהלך שכפול הדנ&quot;א 6. מעכב H4K16acפעילות remodeler הכרומטין בן משפחת ISWI 12 SMARCA5 של. לפיכך, שימוש בטכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי, אנחנו יכולים לחבר את הפונקציות לHDAC1,2 בויסות שיפוץ הכרומטין בעת ​​שכפול ה- DNA. לפיכך, טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי הכתם היא גישה רבת עוצמה למדידת כמותית דינמיקת העמותה וניתוק של חלבונים או לאחר translational שינוייהם שקשורים ל- DNA המתהווה.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

deacetylases היסטון 1 ו -2 (HDAC1,2) בתרגום לאתרים של שכפול הדנ&quot;א. במחקר הקודם, באמצעות מערכת מציאה גנטית מעכב וסלקטיבי, הראינו פונקציות חדשניות לHDAC1,2 בהתקדמות מזלג שכפול ותחזוקת הכרומטין המתהווה בתאי יונקים. בנוסף, השתמשנו בטכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי המשלבת immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של bromo-deoxyuridine DNA -labeled (BrdU) עם כתם חריץ ומערבי מנתחת למדוד כמותית חלבונים או שינוי היסטון קשור עם DNA המתהווה. פעיל טופלו תאי החלוקה עם מעכב סלקטיבי HDAC1,2 או transfected עם siRNAs נגד Hdac1 וHdac2 ולאחר מכן DNA מסונתז חדש תויג עם bromodeoxyuridine האנלוגי תימידין (BrdU). תיוג BrdU נעשה בנקודת זמן שבו לא הייתה עצירת מחזור התא משמעותית או אפופטוזיס עקב האובדן של פונקציות HDAC1,2. l הבאabeling של תאים עם BrdU, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של סימני acetylation היסטון או הכרומטין-remodeler בוצע עם נוגדנים ספציפיים. ה- DNA הקלט שכותרת BrdU וimmunoprecipitated (או ChIPed) DNA אז הבחינו על קרום באמצעות טכניקת כתם חריץ ומשותק באמצעות UV. כמות ה- DNA המתהווה בכל חריץ אז כמותית הוערכה באמצעות ניתוח מערבי עם נוגדן אנטי BrdU. ההשפעה של אובדן של פונקציות HDAC1,2 ברמות של סימנים מסונתזים חדש הקשורים DNA היסטון acetylation וremodeler הכרומטין הייתה אז נקבעה על ידי נרמול אות BrdU-השבב המתקבלת מהדגימות שטופלו על דגימות השליטה.

כדי לקבוע את הספציפיות של מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי, תאי fibrosarcoma Hdac1,2 פלורידה / פלורידה וHdac3 פלורידה / פלורידה היו בשימוש. recombinase Cre (Ad-Cre) המכיל אדנווירוס שימש למחוק Hdac1,2 וHdac3 בתאים אלה. זיהום Ad-Cre הבא של Hdac1,2 פלורידה / פלור...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique at JoVE.com

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

Video: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Genetics

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemistry

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

מדידת קישורים מוצלבים של DNA-PROTEIN Ubiquitylated, SUMOylated ו-ADP-Ribosylated

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Author Spotlight: זיהוי כמותי של הצלבות חלבוני DNA והשינויים שלאחר התרגום  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם Precision סמוך לבסיס זוג

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג'ין

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ"א עם Precision סמוך לבסיס זוג

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא