この原稿での作業は、放射線腫瘍学科とハンツマン癌研究所とSBに健康補助金の国立研究所（R01-CA188520）からの資金によってサポートされていました。私はプロトコルを実証し、その利点を説明するための私の研究室でのダニエル・ジョンソンやスティーブン・ベネットに感謝します。私は原稿の批判的なコメント博士マヘシュChandrasekharan（ハンツマン癌研究所）に感謝しています。

1.クロマチン免疫沈降（チップ）は、次のBrdU標識<ol><li> DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤のいずれかの存在下で培養NIH3T3細胞は、先に説明したように6。 </li><li> DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤で処理した後、滅菌組織培養フード中の細胞にBrdUを追加します。無菌の37℃の組織培養インキュベーター中で60分間ブロモデオキシウリジン20μMの最終濃度（のBrdU）を10ミリリットルNIH3T3培地にプレーティングし、2×10 6のNIH3T3細胞をインキュベートします。 </li><li> 1％の最終濃度で培養培地に直接ホルムアルデヒドを添加することによりDNAの架橋は、細胞内タンパク質。シェーカー上で室温で10分間ホルムアルデヒドと2×10 6 NIH3T3細胞をインキュベートします。 </li><li> 125mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋をクエンチしました。シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。 </li><li>メディアを取り出し、15 ml遠心チューブにPBSで細胞を集めます。スピンCEL4℃で5分間、956×gでのls。氷冷PBSで2回細胞ペレットを洗浄します。チューブからPBSを削除します。使用するまで-80℃でPBS（上清）なしの架橋された細胞ペレットを保管してください。 </li><li> 500μlのFA140緩衝液を添加することにより架橋細胞ペレットから溶解物を調製し（50 HEPES KOHのmMのpHは7.5、NaClを140 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）に、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウム）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。 </li><li>サンプルを35％の電力で、15秒のパルスで5回、0.9秒、0.1秒オフの設定を超音波処理することによってクロマチンをせん断。サンプルの加熱を避けるために、超音波処理のすべてのラウンド後、氷上でチューブを保管してください。 <ol><li>断片化の効率が異なる超音波処理間で変化するようなDNAのゲル上でせん断を確認してください。超音波処理を確認するには、0.16 Mの濃度に塩化ナトリウムを加えることによって、架橋を逆転し、手順1.17.1を実行します。 - 1.22。ランは、剪断があるかどうかを確認するために、1.5％アガロースゲル上に10μlのDNAを溶出しました500塩基対での平均強度との塩基対700から300の間。 </li></ol></li><li> 4℃、17949×gで10分間、超音波処理、遠心分離サンプルに従い、上清を新しいチューブに移します。 <ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質の推定を行います。対照及び実験サンプルのチップ用の溶解物の同量を使用してください。一般的に、チップの反応あたりの総溶解液1mgを使用しています。 </li></ol></li><li>プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むFA140緩衝液を用いてプロテインAアガロースの50％スラリーを調製。プロテアーゼ阻害剤カクテルの1/10量を追加します。総サンプル数に基づいて、必要とされるビーズの量を計算します。 <ol><li>二回保存バッファーを除去し、50％のスラリーを作るためにビーズにFA140バッファに等しい容量を追加するFA140緩衝液でプロテインAアガロースビーズを洗浄します。 </li><li> 、非特異的にビーズに結合するタンパク質を除去するプロテインAアガロースの50％スラリーと50μLを追加します30分間のロティサリーミキサーに一定の転倒回転させながら4℃でサンプルをcubate。 </li></ol></li><li>分間、4℃で956×gでサンプルをスピン。上清を収集し、上清に1 mg / mlのSMARCA5抗体8μlのH4K16ac抗体または5μL（5μgの）のいずれかを追加することにより、免疫沈降を行います。ロティサリーミキサーに一定の転倒回転で4度のCO / Nでインキュベートします。 </li><li> 「入力」制御のための抽出物の1/10を保存し、-20℃のような横に置いておきます。入力は、逆IPサンプルと一緒に架橋される必要があります。 </li><li>陰性対照免疫沈降サンプルとしてウサギIgG（1 mg / mlの5μlの）の同量を使用してください。 </li><li>次の日に、抽出物を50％のプロテインAアガローススラリー50μlのを追加し、回転させながら4℃で1時間インキュベートします。 </li><li> 4℃で2分間、956×gの遠心分離によってアガロースビーズをペレット化、慎重に上清とWAを削除順次以下の緩衝液でビーズをshに。バッファの準備では、使用直前にプロテアーゼ阻害剤を追加します。 <ol><li>低塩免疫複合体洗浄緩衝液で洗浄し（FA140、pH7.5のHEPES KOHの最終濃度50mM、NaClを140 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）で、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウムの）のためにエンド - オーバー - エンド回転で4℃で5分間。 </li><li>高塩免疫複合体洗浄緩衝液で洗浄し（FA500、pH7.5のHEPES KOHの最終濃度50mM、NaClを500 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）で、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウムの）のためにエンド - オーバー - エンド回転で4℃で5分間。 </li><li> LiClの免疫複合体の洗浄バッファー転倒回転させながら4℃で5分間（トリス-Cl pH8.0の、塩化リチウムの250 mMの、0.5％NP40および0.5％デオキシコール酸ナトリウムの最終濃度10mM）で洗浄します。 </li></ol></li><li>上記のように回洗浄した後、200μlの溶出溶液（1％SDSおよび100 mMの重炭酸ナトリウムの最終濃度）とincubatを追加RTで転倒回転で15分間、室温での電子。 </li><li>室温で956×gでサンプルをスピンし、新しい1.5 mlチューブに溶出液を移します。追加の200μlの溶出溶液との手順を繰り返し1.15。 </li><li>溶出液の400μlに、0.16 Mの濃度になるように塩化ナトリウムを加え、よく混ぜます。 <ol><li>また、取っておいた10μlの入力（ステップ1.11）に400μlの溶出溶液を追加し、同様に架橋入力サンプルを逆に0.16 Mの濃度に塩化ナトリウムを加えます。 5時間、65℃の水浴中でインキュベートすることによって、サンプルを架橋逆転。 </li></ol></li><li>逆架橋溶出液に、100％エタノールを1mlを追加します。よく混ぜ、2のために-80℃でインキュベート - 3時間またはCO / N°-20で。 15分間17949×gでサンプルをスピンし、エタノールを捨てます。 </li><li>ペレットを洗浄するために800μlの70％エタノールを追加します。 4℃で15分間、17949×gでスピンし、エタノールを捨てます。すべての残留エタノールを除去するために簡単にスピン。 1 37℃でサンプルを風乾し0分、残留エタノールを除去します。 </li><li> 90μlのRNaseおよびDNaseを含まない水でDNAを溶解し、0.2 mg / mlの最終濃度で2μLの10mg / mlのRNaseを追加します。 30分間、水浴中で37℃でインキュベートします。 </li><li> 10μlの10倍プロテイナーゼKバッファー（100mMのトリス-Cl pH8.0の、50mMのEDTA pH8.0の、5％SDS）を追加します。よく混ぜ、1時間42℃で1μlのプロテ​​イナーゼKインキュベートを追加します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って商業PCR精製キットを使用して入力し、チップDNAを精製し、50μlの水中にDNAを溶出します。さらに使用するまで-20℃で保存するDNA。 </li></ol> ChIPのDNAの2スロットブロット分析<ol><li>製造業者のプロトコルに従って、280nmで分光光度計を用いて、ステップ1.22で説明したように50μlの水中に溶出入力、チップDNAの収量を測定します。 </li><li>検出の直線範囲内にある入力の等容量（50​​μL）または免疫沈降したDNAを取ります。 <ol><li>例えば、入力の場合DNA収量は1.5 ngの/μlのは、その後（全DNA ngのまたは45）の30μlを取り、水で50μlにボリュームを作ることです。要因チップには、ステップ2.1からの全体の50μlの溶出液を取り、2.3に進みます。 </li></ol></li><li> 0.4 N NaOHを、短時間ボルテックスし、10秒間956 XGのための遠心分離機の2.5容量を追加することにより、50μlの入力または免疫沈降したDNAを変性させ、そして室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 10秒間956 XGのための1 Mトリス塩酸175μlの、pHが6.8、ボルテックス、遠心機を追加することにより、変性したDNAを中和し、氷上にサンプルを置きます。 </li><li>以下に説明するように、スロットブロットアッセイのために、入力の段階希釈し、免疫沈降したDNAを準備します。 <ol><li> 350μL（ すなわち 、50μlの入力/チップ、DNA、125μlの0.4 N NaOHを、175μlの1 Mトリス塩酸、pHは6.8）の総サンプル体積を得るために2.4 -手順2.3に従ってください。 注：上記の例では、入力されたDNAの45 ngが0.129 NG /μLになってしまうでしょう。 </li><li>インプットDNAの場合は、3チューブにラベルを付けますS 100、50、25と100μL、50μLと変性し、中和したDNAサンプルの25μlを添加するように。ヌクレアーゼフリー水を用いて100μlの最終容量にしてください。 ChIPのDNA、ラベルに200、100、50と200μlを添加するように3本のチューブ、100μlの、変性し、中和DNAサンプルを50μl。ヌクレアーゼを含まない水を用いて200μlの最終容量にします。 </li></ol></li><li>スロットブロット装置のサイズに膜をカットします。前の20倍のSSC中膜およびブロッティングペーパーをプリウェットとDNAを追加する前に。製造業者のプロトコルに従って、スロットブロット装置にそれらを組み立てます。 </li><li>適切なスロットにステップ2.5.2からのピペットのDNA。ゼータプローブ膜上にDNAを引っ張ってゆっくり真空を適用します。全てのサンプルが装置を通過した後、真空を停止します。 <ol><li>装置を分解し、直ちに紫外線架橋剤を用いて膜上にDNAを固定化します。 UVクロスリンカーでのDNA側を持って、AUを使用架橋剤に設定tocrosslink。製造業者のプロトコルに従ってください。 </li></ol></li><li>ウェスタンブロッティングを行うことにより、スロットブロット上のBrdUを検出します。 <ol><li> PBS中脱脂粉乳5％が膜への抗体の非特異的結合を防ぐために、RTで1時間、0.1％のTween-20（PBST）を含有する膜をブロックします。 </li><li> PBST中脱脂粉乳1％に希釈し、シェーカー上で室温で3時間、一次抗体でブロットをインキュベート（1：500希釈）一次抗BrdU抗体を追加します。一次抗体のインキュベーション後PBSTで3回膜を洗ってください。 </li><li>ブロットをHRP結合抗マウス二次抗体を加える（1：5000希釈）と1時間室温でインキュベートします。二次抗体のインキュベーション後PBSTで3回膜を洗ってください。 注：完全に一次および二次抗体のインキュベーション中に膜をカバーするために抗体の十分な量を使用してください。 </li></ol></li><li> ECLミ​​ックスを調製し、ブロット交流に追加製造業者のプロトコルによれ。 RTで5分間ECLミックスで膜をインキュベートします。 <ol><li> 、X線カセットに膜を配置し、X線フィルムに膜を露出させ、製造業者のプロトコルを使用してブロットを開発。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってイメージJソフトウェアを使用してブロットをスキャンした後、入力およびChIPedのDNAについて得られたシグナルを定量化します。定量化のために、測定の精度を確保するために、検出の直線範囲内にある信号を用います。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability.">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression.">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability.">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li><li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC1,2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li><li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair:+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers.">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li><li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains.">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li><li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+dynamics+at+active,+stalled,+and+collapsed+replication+forks.">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li></ol>

I have no competing financial interests.

この原稿に記載されているプロトコルは、新たに複製または新生DNA上のタンパク質またはそれらの翻訳後修飾された形態の存在を実証するために、比較的迅速な方法です。さらに、この技術は、タンパク質又は新生DNAとその改変体の会合、解離速度を測定するために1つを可能にします。この技術は、エレガントiPOND技術13に相補的です。 iPOND技術では、新たに合成されたDNAは、エチルデオキシウリジン（EDU）で標識されます。ビオチン複合体は、その後、クリックケミストリーを使用して、EDUに追加されます。ビオチンタグ付き新生DNAをウェスタンブロッティングによって検出されたストレプトアビジンビーズと同時精製タンパク質を用いて免疫沈降されます。一方、私たちのBrdUのChIP-スロット西洋の技術では、発生期のDNAに関連するタンパク質またはその改変体は、タンパク質特異的または修飾型特異的抗体とに結合されたBrdU標識新生DNAの量用いて免疫沈降され、タンパク質は番目です抗BrdU抗体を用いて、スロットウェスタンブロッティングによって定量アン。 特別な注意が必要である。このプロトコルにおける重要なステップがあります。これは、目的の抗体を高効率で標準のChIPアッセイでうまく動作することを確認するために非常に重要です。これは、BrdUを-CHIP-スロット西洋アッセイを行う前に、定量的-PCRでのChIPアッセイにおいて抗体の有効性をテストすることが重要です。正確であるとのBrdU-CHIPスロット西洋技術の定量のために、BrdUで標識されたDNAの連続希釈は、最初にするために行われるべきスロットブロットし、抗BrdU抗体を用いたウェスタン分析に適用されるべきです検出の直線範囲を決定します。チップのDNA濃度を決定し、入力DNAは、BrdUで標識されたDNAの量はウェスタンブロッティングでの検出の直線範囲内にあることを保証することを可能。例えば、我々は、となるように入力されたDNAの12.5 ngの50 ngの決定しました私たちのパイロット実験における線形範囲。 ChIPサンプルの濃度が非常に高い場合にも、それはスロットを実行する前のChIP DNAを希釈するために不可欠です。この技術の限界は、クロマチン断片化の効率に依存してその解像度、です。超音波処理によるクロマチンのせん断は、新たに合成されたDNAに所定のタンパク質またはその改変形態の近接性を決定します。 過去には、哺乳動物細胞におけるDNA複製時のクロマチンとクロマチン修飾酵素の変化の研究は、適切な技術の使用不能のために対処するための難しい問題のまま。また、G1期におけるHdac1,2ヌル細胞の逮捕ので、S相内Hdac1,2ための機能を検討することは困難でした。私たちの研究では、S相及び新規のBrdUのChIP-S内の活動を抑制するためにファーストインクラスの選択的阻害剤の組み合わせを使用して、DNA複製の間にこれらの2のHDACのための関数を示しました多くの西洋技術。将来的には、この技術は、フォークでのヒストン修飾およびクロマチン修飾酵素を研究することに加えて失速フォークにおけるDNA損傷応答およびDNA修復タンパク質の動態を研究するために使用することができます。また、この技術は、マウスNIH3T3細胞に限定されるものではありません。この技術は、正常な酵素またはタンパク質の他の阻害剤は、複製フォークでのDNAの複製および複製ストレス誘導クロマチンの変化にどのように影響するかを調べるために他の細胞系において使用することができます。

欠陥のあるDNA修復および/またはDNAの複製は、細胞死を引き起こすことができ、ゲノムの不安定性の主要な原因です。単一の未修復の二本鎖切断は、細胞死の1を引き起こすのに十分です。クロマチン組織は一過性複製および修復2,3の両方中に変更され、これらのプロセスの間にエピジェネティックな情報を維持するために失敗は整合性をゲノムに対する脅威になります。 HDAC3またはHDAC1,2機能の喪失は、遺伝毒性ストレス（DNA損傷）および細胞死をもたらす4-9 S期の進行、DNA複製および修復を妨げます。したがって、癌細胞において複製、修復およびクロマチンを崩壊し、順番に成長を止めることができ、急速に成長する癌細胞において選択的に細胞死を誘導するDNA損傷を引き起こすために選択的HDAC阻害剤を使用する実用的な戦略です。 DNA複製時には、クロマチンは急速に分解され、その後のDNA複製次再組み立て。新しくSYnthesizedヒストンH4がクロマチン上にK5とK12残基（H4K5K12ac）、以下の堆積でアセチル化され、それらは急速にヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）10,11によって脱アセチル化されています。ヒストン脱アセチル化により新生クロマチンの完全性を維持するために、細胞の障害は、次に、DNA損傷および細胞死をもたらすことができ、フォークの崩壊をもたらすことができます。我々は最近、HDAC1,2の選択的阻害が増加し、ヒストンアセチル化（H4K5ac、H4K12acとH4K16ac）と減少した複製フォークの進行と相関する初期のクロマチン、上SMARCA5クロマチンremodeler活性を阻害することが示されたフォークの崩壊を増加させ、複製ストレスによって誘導されるDNA損傷6を増加します。したがって、HDAC阻害剤治療は、急速に、これらの細胞サイクルとして、癌細胞中で非常に迅速にDNA損傷および死を誘発し、S期を通して何度も通過する新生クロマチン構造を変化させることができます。これは、HDACはヒストンアセチル化とタンパク質ビンディを規制するように機能する方法を理解することが重要ですNGは、哺乳動物細胞におけるDNAの複製を維持します。 定量的にDNA複製時に発生期のDNAに関連するヒストンアセチル化とSMARCA5クロマチンremodelerの量を測定するために、我々は、変更されたChIPアッセイを考案したBrdU・チップ・スロット西洋技術と呼ばれます。所望のタンパク質またはヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（チップ）以下、チップサンプルにおける（チミジンアナログのBrdUを用いて標識）新生DNAの量は、スロットを使用して膜上に移したBrdU標識のChIP DNAのウェスタン分析を用いて検出することができますブロット装置。この技術を用いて、我々はH4K16ac（クロマチンパッケージングに関与マーク）とISWIファミリーメンバーSMARCA5（クロマチンのSWI / SNF関連マトリックス関連アクチン依存調節因子）クロマチンremodelerは、S期細胞における発生期のDNAと関連していることが示されました6。我々はまた、新生H4K16acマークがDNA複製6中HDAC1,2によって脱アセチル化されることがわかりました。 H4K16acの阻害ISWIファミリーメンバーSMARCA5 12のクロマチンremodeler活動。したがって、BrdUを-CHIP-スロット西洋の技術を用いて、我々は、DNA複製の際にクロマチンリモデリングの調節にHDAC1,2ための機能を接続することもできます。したがって、BrdUでのChIP-スロットウエスタンブロット法は、定量的に発生期のDNAに結合しているタンパク質またはそれらの翻訳後修飾の会合および解離のダイナミクスを測定するための強力なアプローチです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-BrdU (westerns)</td>
			<td style="width:107px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">B555627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SMARCA5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab3749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-H4K16ac</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td>39167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeta-Probe GT Membrane</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">162-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protein A agarose</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">16-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase A</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BrdU</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NP40</td>
			<td style="width:107px;">USB Corporation</td>
			<td style="width:119px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S-4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:107px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">04-355-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DEPC-treated water</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP-152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:107px;">Mallinckrodt GenAR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAL7772-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20X SSC</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15557-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:107px;">Lab Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">M0841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-ray film</td>
			<td style="width:107px;">Genesee Sci</td>
			<td style="width:119px;">30-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Developer</td>
			<td style="width:107px;">Konica Minolta</td>
			<td style="width:119px;">SRX-101A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:107px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">XLE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:107px;">Branson Sonifier&#160; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td>
			<td style="width:119px;">Model: 450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model: 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific Isotemp</td>
			<td style="width:119px;">Model: 2322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 1000 spectrophotometer</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">Model: 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Slot Blot apparatus&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Schleicher and Schuell Minifold II</td>
			<td style="width:119px;">44-27570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tissue Culture Incubator</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

ヒストンデアセチラーゼ1と2（HDAC1,2）は、DNA複製の部位に局在化します。以前の研究では、選択的阻害剤や遺伝子ノックダウンシステムを使用して、我々は複製フォークの進行および哺乳動物細胞における発生期のクロマチン維持にHDAC1,2のための新規な機能を示しました。さらに、当社は、スロットブロットでブロモデオキシウリジン（BrdUの）標識DNAのクロマチン免疫沈降（チップ）を組み合わせた、西洋を定量的に発生期のDNAに関連するタンパク質やヒストン修飾を測定するために分析したBrdU・チップ・スロット西洋技術を使用していました。 活発に分裂する細胞がHDAC1,2選択的阻害剤で処理されたか、HDAC1とHDAC2に対するsiRNAをトランスフェクトし、その後、新たに合成されたDNAはチミジンアナログブロモデオキシウリジン（BrdUの）で標識したました。有意な細胞周期停止またはHDAC1,2機能の喪失によるアポトーシスが存在しない場合は、BrdU標識の時点で行いました。続いリットルBrdUで細胞をabeling、ヒストンアセチル化マークまたはクロマチンremodelerのクロマチン免疫沈降（チップ）は、特異的抗体を用いて行きました。 BrdUで標識された入力DNA及び免疫沈降（またはChIPed）次に、DNAをスロットブロット法を用いて膜上にスポットし、UVを使用して固定化しました。各スロット内の新生DNAの量を定量的に抗BrdU抗体を用いてウエスタン分析を用いて評価しました。新たに合成されたDNAに関連するヒストンのアセチル化とクロマチンマークremodelerのレベルにHDAC1,2機能の損失の影響は、その後、対照サンプルに処理されたサンプルから得られたBrdUチップ信号を正規化することによって決定しました。

HDAC1,2選択的阻害剤の特異性を決定するために、Hdac1,2 FL / FLおよび HDAC3 FL / FL線維肉腫細胞を用いました。アデノウイルス含有Creリコンビナーゼ（AD-のCre）は、これらの細胞においてHdac1,2とHDAC3を削除するために使用されました。 Hdac1,2 FL / FLの広告-Creを感染後 細胞は、H4K5acでロバストな増加が観察されました。 233または898とHdac1,2ノックアウト細胞の処理は、233と898は、これらの細胞でHdac1,2なくHDAC3を阻害していることを確認H4K5ac内の任意のさらなる増加をもたらさありませんでした。対照的に、HDAC3ノックアウト細胞の233または898の添加は、Hdac1,2の阻害、したがって3の結果としてH4K5acレベルに対する添加剤の効果に起因するHDAC3ノックアウト細胞で見られる増加に比べH4K5acの有意な増加をもたらしました233及び898は、HDAC1は、2選択的阻害剤です。これらの結果に示されています図1。 BrdUでのChIP-スロット技術を検証するには、BrdUでパルスチェイス分析は、HeLa細胞における発生期のDNA上にPCNAの負荷の動態を調べるために実施しました。我々の結果は、新生DNAとPCNAの会合は15分以内に急速に発生し、以前に公表された結果13と一致して30分のチェイスの後に消えていることを示しました。これらの結果は、図2に示されています。 BrdUでH4K16acのChIPスロット西洋技術はHDAC1,2機能の非存在下で新生DNAに関連付けH4K16acの量を決定しました。ウサギIgG対照（ 図3Aおよび図3B）と比較した場合、新生DNAに関連付けH4K16acで堅牢な濃縮が観察されました。 HDAC1,2活動やHdac1,2のノックダウンの阻害後の新生DNA関連H4K16acの増加は、 図3Cに示されています</強い&gt;、3D、および3E。 新生DNA上SMARCA5クロマチンremodelerのレベルは、BrdUでSMARCA5のChIP-スロット西洋の技法を用いて測定しました。我々の結果は、哺乳動物細胞において新生DNAとそのSMARCA5仲間を示しました。 図4に示すように、また、Hdac1,2のHDAC1,2阻害またはノックダウンは、新生DNA関連SMARCA5クロマチンremodelerの量を変化させませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig1.jpg" /> HDAC1,2選択的阻害剤の特異性の 図1. 確認。898かとのAd-Creを感染および処置後のHDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FLまたはHDAC3 FL / FL線維肉腫細胞から調製した全細胞溶解物のウエスタン分析233細胞は、48時間のAd-Creを感染後3μM898または24時間233で処理しました。この数値は、当社の以前公開されたワーク 6に由来するものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53647/53647fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig2.jpg" /> 図 HeLa細胞における新生DNAとPCNA協会の 2 ダイナミクス。HeLa細胞を30分間ブロモデオキシウリジン（BrdUの）で標識しました。次いで、細胞を、時間の表示された期間（チェイス）のためのBrdUずに取り込まれていないのBrdUと培地で培養を除去するために洗浄しました。クロマチン免疫沈降（チップ）は、抗増殖細胞核抗原（PCNA）抗体を用いて行きました。入力DNAとPCNAと関連付けられたものに存在するのBrdU標識されたDNAは、抗BRDを用いて、スロットブロット分析で評価しました。U抗体図2に示すように。この図は、当社の以前公開されたワーク 6に由来するものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53647/53647fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig3.jpg" /> 新生DNA上のヒストン脱アセチル化酵素1及び2増加H4K16ac図3.損失。（AB）ブロモデオキシウリジン（BrdUの）パルスチェイスは、指示された時点での発生期のDNAとH4K16acの関連性を決定するために、HeLa細胞およびNIH3T3細胞で行いました。 （CD）NIH3T3細胞を、24時間、DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤（898または233）のいずれかで処理しました。 （E）NIH3T3細胞は、いずれの非標的（NT）またはHdac1,2（H12）siRNAでトランスフェクトしました。 （C - E）からの細胞をBrdUで標識し、使用されました抗H4K16acとチップ用のスロットブロット法を行いました。膜は、抗BrdU抗体でプローブしました。数値は、スポッティングのChIP DNAの高、中容量の平均のBrdU信号の画像Jの定量に示します。この数値は、当社の以前公開されたワーク 6に由来するものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53647/53647fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53647/53647fig4.jpg" /> 図4.新生DNAとSMARCA5アソシエイツ 。 HDAC1,2機能の喪失以下、新生クロマチン上SMARCA5の量が示されています。 NIH3T3細胞はどちらHDAC1,2選択的阻害剤（898）で処理した、または（NT）非標的またはHdac1,2（H12）siRNAでトランスフェクトしました。細胞は、上記の治療と抗SMARCA5またはウサギIgG（ネガティブCを有するチップ以下のBrdUで標識しましたontrol）を行いました。 ChIPのDNAの増加ボリュームはスロットブロットにスポットし、膜を抗BrdU抗体でプローブしました。この数値は、当社の以前公開されたワーク 6に由来するものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53647/53647fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K ビュー.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

生物学

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

要約

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広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールとしてSECM逮捕シーケンスを使用して、

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

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広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールとしてSECM逮捕シーケンスを使用して、