この原稿での作業は、放射線腫瘍学科とハンツマン癌研究所とSBに健康補助金の国立研究所（R01-CA188520）からの資金によってサポートされていました。私はプロトコルを実証し、その利点を説明するための私の研究室でのダニエル・ジョンソンやスティーブン・ベネットに感謝します。私は原稿の批判的なコメント博士マヘシュChandrasekharan（ハンツマン癌研究所）に感謝しています。

1.クロマチン免疫沈降（チップ）は、次のBrdU標識<ol><li> DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤のいずれかの存在下で培養NIH3T3細胞は、先に説明したように6。 </li><li> DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤で処理した後、滅菌組織培養フード中の細胞にBrdUを追加します。無菌の37℃の組織培養インキュベーター中で60分間ブロモデオキシウリジン20μMの最終濃度（のBrdU）を10ミリリットルNIH3T3培地にプレーティングし、2×10 6のNIH3T3細胞をインキュベートします。 </li><li> 1％の最終濃度で培養培地に直接ホルムアルデヒドを添加することによりDNAの架橋は、細胞内タンパク質。シェーカー上で室温で10分間ホルムアルデヒドと2×10 6 NIH3T3細胞をインキュベートします。 </li><li> 125mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋をクエンチしました。シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。 </li><li>メディアを取り出し、15 ml遠心チューブにPBSで細胞を集めます。スピンCEL4℃で5分間、956×gでのls。氷冷PBSで2回細胞ペレットを洗浄します。チューブからPBSを削除します。使用するまで-80℃でPBS（上清）なしの架橋された細胞ペレットを保管してください。 </li><li> 500μlのFA140緩衝液を添加することにより架橋細胞ペレットから溶解物を調製し（50 HEPES KOHのmMのpHは7.5、NaClを140 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）に、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウム）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。 </li><li>サンプルを35％の電力で、15秒のパルスで5回、0.9秒、0.1秒オフの設定を超音波処理することによってクロマチンをせん断。サンプルの加熱を避けるために、超音波処理のすべてのラウンド後、氷上でチューブを保管してください。 <ol><li>断片化の効率が異なる超音波処理間で変化するようなDNAのゲル上でせん断を確認してください。超音波処理を確認するには、0.16 Mの濃度に塩化ナトリウムを加えることによって、架橋を逆転し、手順1.17.1を実行します。 - 1.22。ランは、剪断があるかどうかを確認するために、1.5％アガロースゲル上に10μlのDNAを溶出しました500塩基対での平均強度との塩基対700から300の間。 </li></ol></li><li> 4℃、17949×gで10分間、超音波処理、遠心分離サンプルに従い、上清を新しいチューブに移します。 <ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質の推定を行います。対照及び実験サンプルのチップ用の溶解物の同量を使用してください。一般的に、チップの反応あたりの総溶解液1mgを使用しています。 </li></ol></li><li>プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むFA140緩衝液を用いてプロテインAアガロースの50％スラリーを調製。プロテアーゼ阻害剤カクテルの1/10量を追加します。総サンプル数に基づいて、必要とされるビーズの量を計算します。 <ol><li>二回保存バッファーを除去し、50％のスラリーを作るためにビーズにFA140バッファに等しい容量を追加するFA140緩衝液でプロテインAアガロースビーズを洗浄します。 </li><li> 、非特異的にビーズに結合するタンパク質を除去するプロテインAアガロースの50％スラリーと50μLを追加します30分間のロティサリーミキサーに一定の転倒回転させながら4℃でサンプルをcubate。 </li></ol></li><li>分間、4℃で956×gでサンプルをスピン。上清を収集し、上清に1 mg / mlのSMARCA5抗体8μlのH4K16ac抗体または5μL（5μgの）のいずれかを追加することにより、免疫沈降を行います。ロティサリーミキサーに一定の転倒回転で4度のCO / Nでインキュベートします。 </li><li> 「入力」制御のための抽出物の1/10を保存し、-20℃のような横に置いておきます。入力は、逆IPサンプルと一緒に架橋される必要があります。 </li><li>陰性対照免疫沈降サンプルとしてウサギIgG（1 mg / mlの5μlの）の同量を使用してください。 </li><li>次の日に、抽出物を50％のプロテインAアガローススラリー50μlのを追加し、回転させながら4℃で1時間インキュベートします。 </li><li> 4℃で2分間、956×gの遠心分離によってアガロースビーズをペレット化、慎重に上清とWAを削除順次以下の緩衝液でビーズをshに。バッファの準備では、使用直前にプロテアーゼ阻害剤を追加します。 <ol><li>低塩免疫複合体洗浄緩衝液で洗浄し（FA140、pH7.5のHEPES KOHの最終濃度50mM、NaClを140 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）で、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウムの）のためにエンド - オーバー - エンド回転で4℃で5分間。 </li><li>高塩免疫複合体洗浄緩衝液で洗浄し（FA500、pH7.5のHEPES KOHの最終濃度50mM、NaClを500 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）で、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウムの）のためにエンド - オーバー - エンド回転で4℃で5分間。 </li><li> LiClの免疫複合体の洗浄バッファー転倒回転させながら4℃で5分間（トリス-Cl pH8.0の、塩化リチウムの250 mMの、0.5％NP40および0.5％デオキシコール酸ナトリウムの最終濃度10mM）で洗浄します。 </li></ol></li><li>上記のように回洗浄した後、200μlの溶出溶液（1％SDSおよび100 mMの重炭酸ナトリウムの最終濃度）とincubatを追加RTで転倒回転で15分間、室温での電子。 </li><li>室温で956×gでサンプルをスピンし、新しい1.5 mlチューブに溶出液を移します。追加の200μlの溶出溶液との手順を繰り返し1.15。 </li><li>溶出液の400μlに、0.16 Mの濃度になるように塩化ナトリウムを加え、よく混ぜます。 <ol><li>また、取っておいた10μlの入力（ステップ1.11）に400μlの溶出溶液を追加し、同様に架橋入力サンプルを逆に0.16 Mの濃度に塩化ナトリウムを加えます。 5時間、65℃の水浴中でインキュベートすることによって、サンプルを架橋逆転。 </li></ol></li><li>逆架橋溶出液に、100％エタノールを1mlを追加します。よく混ぜ、2のために-80℃でインキュベート - 3時間またはCO / N°-20で。 15分間17949×gでサンプルをスピンし、エタノールを捨てます。 </li><li>ペレットを洗浄するために800μlの70％エタノールを追加します。 4℃で15分間、17949×gでスピンし、エタノールを捨てます。すべての残留エタノールを除去するために簡単にスピン。 1 37℃でサンプルを風乾し0分、残留エタノールを除去します。 </li><li> 90μlのRNaseおよびDNaseを含まない水でDNAを溶解し、0.2 mg / mlの最終濃度で2μLの10mg / mlのRNaseを追加します。 30分間、水浴中で37℃でインキュベートします。 </li><li> 10μlの10倍プロテイナーゼKバッファー（100mMのトリス-Cl pH8.0の、50mMのEDTA pH8.0の、5％SDS）を追加します。よく混ぜ、1時間42℃で1μlのプロテ​​イナーゼKインキュベートを追加します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って商業PCR精製キットを使用して入力し、チップDNAを精製し、50μlの水中にDNAを溶出します。さらに使用するまで-20℃で保存するDNA。 </li></ol> ChIPのDNAの2スロットブロット分析<ol><li>製造業者のプロトコルに従って、280nmで分光光度計を用いて、ステップ1.22で説明したように50μlの水中に溶出入力、チップDNAの収量を測定します。 </li><li>検出の直線範囲内にある入力の等容量（50​​μL）または免疫沈降したDNAを取ります。 <ol><li>例えば、入力の場合DNA収量は1.5 ngの/μlのは、その後（全DNA ngのまたは45）の30μlを取り、水で50μlにボリュームを作ることです。要因チップには、ステップ2.1からの全体の50μlの溶出液を取り、2.3に進みます。 </li></ol></li><li> 0.4 N NaOHを、短時間ボルテックスし、10秒間956 XGのための遠心分離機の2.5容量を追加することにより、50μlの入力または免疫沈降したDNAを変性させ、そして室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 10秒間956 XGのための1 Mトリス塩酸175μlの、pHが6.8、ボルテックス、遠心機を追加することにより、変性したDNAを中和し、氷上にサンプルを置きます。 </li><li>以下に説明するように、スロットブロットアッセイのために、入力の段階希釈し、免疫沈降したDNAを準備します。 <ol><li> 350μL（ すなわち 、50μlの入力/チップ、DNA、125μlの0.4 N NaOHを、175μlの1 Mトリス塩酸、pHは6.8）の総サンプル体積を得るために2.4 -手順2.3に従ってください。 注：上記の例では、入力されたDNAの45 ngが0.129 NG /μLになってしまうでしょう。 </li><li>インプットDNAの場合は、3チューブにラベルを付けますS 100、50、25と100μL、50μLと変性し、中和したDNAサンプルの25μlを添加するように。ヌクレアーゼフリー水を用いて100μlの最終容量にしてください。 ChIPのDNA、ラベルに200、100、50と200μlを添加するように3本のチューブ、100μlの、変性し、中和DNAサンプルを50μl。ヌクレアーゼを含まない水を用いて200μlの最終容量にします。 </li></ol></li><li>スロットブロット装置のサイズに膜をカットします。前の20倍のSSC中膜およびブロッティングペーパーをプリウェットとDNAを追加する前に。製造業者のプロトコルに従って、スロットブロット装置にそれらを組み立てます。 </li><li>適切なスロットにステップ2.5.2からのピペットのDNA。ゼータプローブ膜上にDNAを引っ張ってゆっくり真空を適用します。全てのサンプルが装置を通過した後、真空を停止します。 <ol><li>装置を分解し、直ちに紫外線架橋剤を用いて膜上にDNAを固定化します。 UVクロスリンカーでのDNA側を持って、AUを使用架橋剤に設定tocrosslink。製造業者のプロトコルに従ってください。 </li></ol></li><li>ウェスタンブロッティングを行うことにより、スロットブロット上のBrdUを検出します。 <ol><li> PBS中脱脂粉乳5％が膜への抗体の非特異的結合を防ぐために、RTで1時間、0.1％のTween-20（PBST）を含有する膜をブロックします。 </li><li> PBST中脱脂粉乳1％に希釈し、シェーカー上で室温で3時間、一次抗体でブロットをインキュベート（1：500希釈）一次抗BrdU抗体を追加します。一次抗体のインキュベーション後PBSTで3回膜を洗ってください。 </li><li>ブロットをHRP結合抗マウス二次抗体を加える（1：5000希釈）と1時間室温でインキュベートします。二次抗体のインキュベーション後PBSTで3回膜を洗ってください。 注：完全に一次および二次抗体のインキュベーション中に膜をカバーするために抗体の十分な量を使用してください。 </li></ol></li><li> ECLミ​​ックスを調製し、ブロット交流に追加製造業者のプロトコルによれ。 RTで5分間ECLミックスで膜をインキュベートします。 <ol><li> 、X線カセットに膜を配置し、X線フィルムに膜を露出させ、製造業者のプロトコルを使用してブロットを開発。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってイメージJソフトウェアを使用してブロットをスキャンした後、入力およびChIPedのDNAについて得られたシグナルを定量化します。定量化のために、測定の精度を確保するために、検出の直線範囲内にある信号を用います。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC1,2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li><li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair:+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers.">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li><li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains.">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li><li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+dynamics+at+active,+stalled,+and+collapsed+replication+forks.">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li></ol>

I have no competing financial interests.

この原稿に記載されているプロトコルは、新たに複製または新生DNA上のタンパク質またはそれらの翻訳後修飾された形態の存在を実証するために、比較的迅速な方法です。さらに、この技術は、タンパク質又は新生DNAとその改変体の会合、解離速度を測定するために1つを可能にします。この技術は、エレガントiPOND技術13に相補的です。 iPOND技術では、新たに合成されたDNAは、エチル...

欠陥のあるDNA修復および/またはDNAの複製は、細胞死を引き起こすことができ、ゲノムの不安定性の主要な原因です。単一の未修復の二本鎖切断は、細胞死の1を引き起こすのに十分です。クロマチン組織は一過性複製および修復2,3の両方中に変更され、これらのプロセスの間にエピジェネティックな情報を維持するために失敗は整合性をゲノムに対する脅威になります。 HDAC3またはHDAC1,2機能の喪失は、遺伝毒性ストレス（DNA損傷）および細胞死をもたらす4-9 S期の進行、DNA複製および修復を妨げます。したがって、癌細胞において複製、修復およびクロマチンを崩壊し、順番に成長を止めることができ、急速に成長する癌細胞において選択的に細胞死を誘導するDNA損傷を引き起こすために選択的HDAC阻害剤を使用する実用的な戦略です。 DNA複製時には、クロマチンは急速に分解され、その後のDNA複製次再組み立て。新しくSYnthesizedヒストンH4がクロマチン上にK5とK12残基（H4K5K12ac）、以下の堆積でアセチル化され、それらは急速にヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）10,11によって脱アセチル化されています。ヒストン脱アセチル化により新生クロマチンの完全性を維持するために、細胞の障害は、次に、DNA損傷および細胞死をもたらすことができ、フォークの崩壊をもたらすことができます。我々は最近、HDAC1,2の選択的阻害が増加し、ヒストンアセチル化（H4K5ac、H4K12acとH4K16ac）と減少した複製フォークの進行と相関する初期のクロマチン、上SMARCA5クロマチンremodeler活性を阻害することが示されたフォークの崩壊を増加させ、複製ストレスによって誘導されるDNA損傷6を増加します。したがって、HDAC阻害剤治療は、急速に、これらの細胞サイクルとして、癌細胞中で非常に迅速にDNA損傷および死を誘発し、S期を通して何度も通過する新生クロマチン構造を変化させることができます。これは、HDACはヒストンアセチル化とタンパク質ビンディを規制するように機能する方法を理解することが重要ですNGは、哺乳動物細胞におけるDNAの複製を維持します。 定量的にDNA複製時に発生期のDNAに関連するヒストンアセチル化とSMARCA5クロマチンremodelerの量を測定するために、我々は、変更されたChIPアッセイを考案したBrdU・チップ・スロット西洋技術と呼ばれます。所望のタンパク質またはヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（チップ）以下、チップサンプルにおける（チミジンアナログのBrdUを用いて標識）新生DNAの量は、スロットを使用して膜上に移したBrdU標識のChIP DNAのウェスタン分析を用いて検出することができますブロット装置。この技術を用いて、我々はH4K16ac（クロマチンパッケージングに関与マーク）とISWIファミリーメンバーSMARCA5（クロマチンのSWI / SNF関連マトリックス関連アクチン依存調節因子）クロマチンremodelerは、S期細胞における発生期のDNAと関連していることが示されました6。我々はまた、新生H4K16acマークがDNA複製6中HDAC1,2によって脱アセチル化されることがわかりました。 H4K16acの阻害ISWIファミリーメンバーSMARCA5 12のクロマチンremodeler活動。したがって、BrdUを-CHIP-スロット西洋の技術を用いて、我々は、DNA複製の際にクロマチンリモデリングの調節にHDAC1,2ための機能を接続することもできます。したがって、BrdUでのChIP-スロットウエスタンブロット法は、定量的に発生期のDNAに結合しているタンパク質またはそれらの翻訳後修飾の会合および解離のダイナミクスを測定するための強力なアプローチです。

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

ヒストンデアセチラーゼ1と2（HDAC1,2）は、DNA複製の部位に局在化します。以前の研究では、選択的阻害剤や遺伝子ノックダウンシステムを使用して、我々は複製フォークの進行および哺乳動物細胞における発生期のクロマチン維持にHDAC1,2のための新規な機能を示しました。さらに、当社は、スロットブロットでブロモデオキシウリジン（BrdUの）標識DNAのクロマチン免疫沈降（チップ）を組み合わせた、西洋を定量的に発生期のDNAに関連するタンパク質やヒストン修飾を測定するために分析したBrdU・チップ・スロット西洋技術を使用していました。 活発に分裂する細胞がHDAC1,2選択的阻害剤で処理されたか、HDAC1とHDAC2に対するsiRNAをトランスフェクトし、その後、新たに合成されたDNAはチミジンアナログブロモデオキシウリジン（BrdUの）で標識したました。有意な細胞周期停止またはHDAC1,2機能の喪失によるアポトーシスが存在しない場合は、BrdU標識の時点で行いました。続いリットルBrdUで細胞をabeling、ヒストンアセチル化マークまたはクロマチンremodelerのクロマチン免疫沈降（チップ）は、特異的抗体を用いて行きました。 BrdUで標識された入力DNA及び免疫沈降（またはChIPed）次に、DNAをスロットブロット法を用いて膜上にスポットし、UVを使用して固定化しました。各スロット内の新生DNAの量を定量的に抗BrdU抗体を用いてウエスタン分析を用いて評価しました。新たに合成されたDNAに関連するヒストンのアセチル化とクロマチンマークremodelerのレベルにHDAC1,2機能の損失の影響は、その後、対照サンプルに処理されたサンプルから得られたBrdUチップ信号を正規化することによって決定しました。

HDAC1,2選択的阻害剤の特異性を決定するために、Hdac1,2 FL / FLおよび HDAC3 FL / FL線維肉腫細胞を用いました。アデノウイルス含有Creリコンビナーゼ（AD-のCre）は、これらの細胞においてHdac1,2とHDAC3を削除するために使用されました。 Hdac1,2 FL / FLの広告-Creを感染後 細胞は、H4K5acでロバストな増加が?...

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Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

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Biology

9.1K ビュー.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

ビデオ: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

遺伝学

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

生化学

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

生物学

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

要約

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この動画の章

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

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DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

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