O trabalho neste manuscrito foi apoiada por fundos do Departamento de Radioterapia Oncologia e Huntsman Cancer Institute e do Instituto Nacional de concessão de Saúde (R01-CA188520) para SB. Agradeço Danielle Johnson e Steven Bennett no meu laboratório para demonstrar o protocolo e explicando os seus benefícios. Sou grato ao Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) para comentários críticos sobre o manuscrito.

1. A cromatina imunoprecipitação (CHIP) seguinte BrdU Labeling <ol><li> Culturas de células NIH3T3 na presença de DMSO ou inibidores selectivos HDAC1,2-6, como descrito anteriormente. </li><li> A seguir ao tratamento com inibidores selectivos de DMSO ou HDAC1,2, adicionar BrdU para as células de uma cultura de tecido estéril capa. Incubar 2 x 10 6 NIH3T3 células plaqueadas em 10 ml de meio NIH3T3 com 20 uM de concentração final de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 min num estéril 37 ° C incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Proteínas intracelulares Crosslink ao DNA por adição de formaldeído directamente ao meio de cultura a uma concentração final de 1%. Incubar 2 X 10 6 células NIH3T3 com formaldeído à temperatura ambiente durante 10 minutos num agitador. </li><li> Extingue-se a ligação cruzada pela adição de glicina para uma concentração final de 125 mM. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min num agitador. </li><li> Remover os meios de comunicação e recolher células em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml. Spin cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lava-se a pelete de células duas vezes com PBS gelado. Remover o PBS do tubo. Armazenar o sedimento celular reticulada sem PBS (o sobrenadante) a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Prepara-se o lisado a partir do sedimento celular reticulada por adição de tampão de FA140 500 ul (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e desoxicolato de sódio a 0,1%) suplementado com cocktail inibidor de protease. </li><li> Distorcer a cromatina por sonicando as amostras de cinco vezes a 35% de energia e com um pulso de 15 segundos, 0,9 segundos em 0,1 segundos e fora configuração. Manter os tubos em gelo após cada rodada de sonicação para evitar o aquecimento das amostras. <ol><li> Verificar o corte num gel de ADN como a eficiência de cisalhamento vai variar entre diferentes sonicadores. Para verificar ultra-sons, reverter ligações cruzadas pela adição de NaCl a uma concentração de 0,16 M e executar etapas 1.17.1. - 1.22. Run eluída 10 ul DNA em gel de agarose 1,5% para verificar se o corte éentre 300-700 pb com uma intensidade média de 500 pb. </li></ol></li><li> Após sonicação, amostras de centrifugação durante 10 min a 17.949 xg, a 4 ° C, e transferir o sobrenadante para um novo tubo. <ol><li> Executar a estimativa de proteína utilizando o kit de ensaio de proteínas comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Use igual quantidade de lisado para Chip de controle e amostras experimentais. De um modo geral, usar 1 mg de lisado total por reacção de chip. </li></ol></li><li> Preparar pasta a 50% de proteína A-agarose usando tampão contendo FA140 cocktail inibidor de protease. Adicionar 1/10 volume de cocktail inibidor de protease. Calcular o volume de grânulos necessário com base no número de amostras no total. <ol><li> Lavar os grânulos de proteína A-agarose com tampão FA140 duas vezes para remover o tampão de armazenamento e adicionar um volume igual de tampão FA140 aos grânulos para fazer pasta a 50%. </li><li> Para remover as proteínas que se ligam de forma não específica às pérolas, adicionar 50 ul de pasta a 50% de Proteína A-agarose e emCubate as amostras a 4 ° C com rotação constante extremidade-sobre-extremidade num misturador espeto rotativo durante 30 min. </li></ol></li><li> Rotação das amostras a 956 xg, a 4 ° C durante um minuto. Recolhe-se o sobrenadante e realizar a imunoprecipitação pela adição de 8 pi de anticorpo quer H4K16ac ou 5 ul (5 ug) de 1 mg / ml de anticorpo SMARCA5 para o sobrenadante. Incubar a 4 ° CO / N com uma rotação de extremidade sobre extremidade constante num misturador de assador. </li><li> Salve o 1 / 10th do extrato para o controle &#39;input&#39; e configure-o como de lado a -20 ° C. A entrada tem de ser inversa reticulada juntamente com as amostras IP. </li><li> Usar uma quantidade igual de IgG de coelho (5 ul de 1 mg / ml) tal como a amostra de controlo negativo imunoprecipitação. </li><li> No dia seguinte, adicionar 50 ul de 50% de proteína A-agarose slurry ao extracto e incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação. </li><li> Pellet pérolas de agarose por centrifugação a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, remover cuidadosamente o sobrenadante e wash os grânulos com os seguintes tampões sequencialmente. Em preparações de buffer, adicione os inibidores da protease direita antes de usar. <ol><li> Lavar com Baixo Sal complexo imune tampão de lavagem (FA140; concentração final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e 0,1% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade. </li><li> Lavar com alto de sal complexo imune tampão de lavagem (FA500; concentração final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 e 0,1% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade. </li><li> Lava-se com LiCl complexo imune tampão de lavagem (concentração final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% NP40 e 0,5% de desoxicolato de sódio) durante 5 min a 4 ° C com rotação de extremidade sobre extremidade. </li></ol></li><li> Após lavagens, tal como descrito acima, adicionar 200 ul de solução de eluição (concentração final de SDS a 1% e bicarbonato de sódio 100 mM) e incubate à temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação de extremidade sobre extremidade à TA. </li><li> Rotação das amostras a 956 xg à temperatura ambiente e transferir o eluato para um novo tubo de 1,5 mL. Repetir o passo 1.15 com solução de eluição adicional de 200 ul. </li><li> A 400 ul do eluato, adicionar NaCl a uma concentração de 0,16 M e misturar bem. <ol><li> Além disso, adicionar solução de eluição de 400 uL a 10 uL de entrada que foi posto de lado (passo 1.11) e adicionar a uma concentração de NaCl de 0,16 M a inverter amostras de entrada de reticulação bem. Inverter a ligação cruzada das amostras por incubação a 65 ° C em banho de água durante 5 horas. </li></ol></li><li> Adicione 1 ml de EtOH a 100% para o produto de eluição inversa reticulado. Misturar bem e incubar à temperatura de -80 ° C durante 2 - 3 h a -20 ° ou CO / N. Rodar as amostras a 17.949 xg durante 15 min e descartar etanol. </li><li> Adicionar 800 ul de etanol a 70% para lavar o sedimento. Rotação em 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C e descartar etanol. Rotação brevemente para remover o etanol residual qualquer. Secar as amostras a 37 ° C durante 10 min para remover o etanol residual. </li><li> Dissolve-se o ADN em 90 ul de ARNase e ADNase isenta de água e adiciona-se 2 ul de 10 mg / ml de RNase com uma solução a 0,2 mg / ml de concentração final. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 30 min. </li><li> Adicionar 10 ul de Tampão Proteinase K 10x (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM de EDTA, pH 8,0, SDS a 5%). Misturar bem e adicionar 1 ml de Proteinase K. Incubar a 42 ° C durante 1 h. </li><li> Purificar DNA de entrada e chip usando kit comercial de purificação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante e eluir DNA em 50 ul de água. ADN Armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Slot de Blot Análise de DNA ChIP <ol><li> Medir o rendimento de ADN de entrada e ChIP eluída em 50 ul de água, tal como descrito na etapa 1,22 utilizando um espectrofotómetro a 280 nm de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Aqui volumes iguais (50 ul) de entrada ou de ADN imunoprecipitado que estão dentro do intervalo linear de detecção. <ol><li> Por exemplo, se a entradaRendimento de DNA é de 1,5 ng / mL, em seguida, tomar 30 ul (ou 45 ng de DNA total) e fazer volume para 50 mL com água. Para o fator Chip, tomar todo o fluido 50 ul do Passo 2.1 e vá para a etapa 2.3. </li></ol></li><li> Desnaturar 50 ul de entrada ou de ADN imunoprecipitado pela adição de 2,5 volumes de NaOH 0,4 N, vortex brevemente e centrifuga-se durante 956 xg durante 10 seg, e incubar à TA durante 30 min. </li><li> Neutraliza-se a ADN desnaturado através da adição de 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugar para 956 xg durante 10 seg e colocar as amostras em gelo. </li><li> Prepara-se uma diluição em série de entrada e de ADN imunoprecipitado para o ensaio de transferência de entalhe, conforme descrito abaixo. <ol><li> Siga passos 2.3 - 2.4 para obter um volume total de amostra de 350 uL (ou seja, 50 ul de entrada / ADN Chip, 125 uL de NaOH 0,4 N, 175 ul de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8). Nota: Para o exemplo acima referido, 45 ng de DNA de entrada vai acabar sendo 0,129 ng / mL. </li><li> Para DNA de entrada, rotular três tubes como 100, 50 e 25 e adiciona-se 100 ul, 50 ul e 25 ul da amostra de DNA desnaturada e neutralizada. Completar o volume final de 100 ul com água isenta de nuclease. Para chip de ADN, a etiqueta como três tubos 200, 100 e 50 e adicionar 200 ul, 100 ul e 50 ul da amostra de DNA desnaturada e neutralizada. Faça volume final para 200 mL com água livre de nuclease. </li></ol></li><li> Cortar a membrana com o tamanho do aparelho de slot blot. Pré-molhou a membrana e papéis mata-borrão em 20x SSC antes e antes da adição do DNA. Montá-los no aparelho de slot blot de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> DNA Pipet do passo 2.5.2 em slots apropriados. Aplicar vácuo para puxar lentamente o ADN sobre a membrana Zeta-probe. Pare de vácuo depois de todas as amostras passaram pelo aparelho. <ol><li> Desmontar o aparelho e imobilizar imediatamente o ADN para a membrana utilizando um reticulador de UV. Ter a cara da DNA-se no reticulador UV e usar o autocrosslink configuração em que o agente reticulante. Siga o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Detectar BrdU no blot ranhura através da realização de transferência de western. <ol><li> Bloquear a membrana com 5% de leite seco não gordo em PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 h à TA, para impedir a ligação não específica de anticorpos contra a membrana. </li><li> Adicionar anticorpo primário anti-BrdU (diluição 1: 500) diluída em 1% de leite seco não gordo em PBST e incubar o blot com o anticorpo primário durante 3 horas à temperatura ambiente num agitador. Lava-se a membrana com PBST três vezes após a incubação do anticorpo primário. </li><li> Adicionar anticorpo conjugado com HRP anti-ratinho secundário para o blot (1: 5000 de diluição) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lava-se a membrana com PBST três vezes após a incubação do anticorpo secundário. NOTA: Use um volume suficiente de anticorpos para cobrir completamente a membrana durante incubações de anticorpos primários e secundários. </li></ol></li><li> Preparar a mistura de ECL e adicioná-lo à ac blotgundo o protocolo do fabricante. Incubar a membrana com uma mistura de ECL durante 5 min à TA. <ol><li> Colocar a membrana em uma cassete de raios-X, expor a membrana a um filme de raios-X e desenvolver o blot utilizando o protocolo do fabricante. </li><li> Quantificar o sinal obtido para entrada e DNA chiped após a digitalização das manchas usando o software Image J de acordo com o protocolo do fabricante. Para quantificação, usar o sinal que está dentro da gama linear de detecção, a fim de garantir a precisão da medição. </li></ol></li></ol>

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	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability.">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression.">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability.">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li><li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC1,2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li><li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair:+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers.">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li><li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains.">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li><li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+dynamics+at+active,+stalled,+and+collapsed+replication+forks.">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li></ol>

I have no competing financial interests.

O protocolo descrito neste manuscrito é um método relativamente rápido para demonstrar a presença das proteínas ou as suas formas modificadas pós-tradução de DNA recentemente replicado ou nascente. Além disso, esta técnica permite um para medir a cinética da associação, dissociação de uma proteína ou a sua forma modificada com o ADN nascente. Esta técnica é complementar da tecnologia elegante iPOND 13. Na tecnologia iPOND, ADN sintetizado de novo é marcado com acetato de desoxiuridina (EdU)...

Reparação de ADN defeituosos e / ou a replicação de DNA são uma das principais causas de instabilidade do genoma, o que pode provocar a morte celular. Uma única quebra de cadeia dupla unrepaired é suficiente para causar morte celular 1. Organização da cromatina é transitoriamente alterada durante a replicação e reparar 2,3, e falha em manter a informação epigenética durante esses processos irão resultar em uma ameaça à integridade do genoma. Perda de HDAC3 ou função HDAC1,2 impede a progressão da fase S, replicação e reparação do ADN, levando ao estresse genotóxico (dano ao DNA) e morte celular 4-9. É, por conseguinte, uma estratégia prático utilizar os inibidores de HDAC selectivos para interromper a replicação, reparação e cromatina em células cancerosas e causar danos no ADN, que por sua vez pode parar o crescimento e induzir a morte celular selectiva, em que crescem rapidamente células cancerosas. Durante a replicação do DNA, cromatina é rapidamente desmontada e remontada em seguida, seguir a duplicação do DNA. Recém-synthesized histona H4 acetilada é a K5 e K12 (H4K5K12ac resíduos) e a seguir para a deposição de cromatina, são rapidamente desacetilado por histona desacetilases (HDACs) 10,11. A falha das células para manter a integridade da cromatina nascente pela histona desacetilação pode conduzir ao colapso da forquilha, que por sua vez pode resultar em danos no ADN e morte celular. Nós recentemente mostrou que a inibição seletiva de HDAC1,2 aumenta acetilação das histonas (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibe a atividade SMARCA5 cromatina remodeler na cromatina nascente, que se correlaciona com a redução da progressão da forquilha de replicação, maior colapso garfo e aumento da replicação do estresse induzido por danos no DNA 6 . Assim, o tratamento com inibidor de HDAC podem alterar a estrutura da cromatina nascente para provocar danos no ADN e morte muito rapidamente em células de cancro, uma vez que estas células ciclo rapidamente e muitas vezes passar através da fase-S. Por isso, é importante entender como HDACs funcionar para regular acetilação das histonas e bindi proteínang de manter replicação de ADN em células de mamífero. Para medir quantitativamente a quantidade de acetilação das histonas e SMARCA5 remodeler cromatina associada à DNA durante a replicação do DNA nascente, eu inventei um ensaio ChIP modificada chamada a técnica de BrdU-chip-Slot-ocidental. Após imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de uma modificação da proteína ou histona desejado, a quantidade de ADN nascente (marcado utilizando análogo da timidina, BrdU) na amostra de chip pode ser detectada por meio de análise ocidental da marcadas com BrdU chip de ADN transferido para uma membrana utilizando um entalhe Aparelho Blot. Usando esta técnica, nós mostramos que H4K16ac (a marca envolvido em embalagem cromatina) eo membro da família ISWI SMARCA5 (dependente de actina regulador associada à matriz relacionada com o SNF SWI / da cromatina) remodeler cromatina estão associados com DNA nascente em células em fase S 6. Também descobrimos que a marca H4K16ac nascente é desacetilada por HDAC1,2 durante a replicação do DNA 6. Inibe H4K16acatividade remodeler cromatina do membro da família ISWI SMARCA5 12. Assim, usando a técnica de-BrdU-CHIP-Slot Ocidental, podemos conectar as funções para HDAC1,2 na regulação da remodelação da cromatina durante a replicação do DNA. Assim, a técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot é uma abordagem poderosa para medir quantitativamente a associação e dissociação dinâmica de proteínas ou suas modificações pós-traducionais que são obrigados a DNA nascente.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

Histona-desacetilases 1 e 2 (HDAC1,2) localizam os sítios de replicação do ADN. No estudo anterior, utilizando-se um inibidor selectivo e um sistema genético knockdown, que mostrou novos funções para HDAC1,2 na replicação garfo progressão e manutenção nascente cromatina em células de mamífero. Além disso, usamos uma técnica BrdU-chip-Slot-ocidental que combina imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) DNA marcado com com slot blot e análise Ocidental para medir quantitativamente proteínas ou modificação da histona associadas com DNA nascente. Activamente células em divisão foram tratados com HDAC1,2 inibidor selectivo ou transfectadas com ARNsi contra HDAC1 e HDAC2 e, em seguida, o ADN recém-sintetizado foi marcado com o análogo de timidina bromodesoxiuridina (BrdU). A marcação com BrdU foi realizada em um ponto de tempo quando não havia paragem do ciclo celular ou apoptose significativa devido à perda de funções HDAC1,2. Seguindo lAbeling de células com BrdU, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de marcas de acetilação de histonas ou da cromatina-remodeler foi realizada com anticorpos específicos. Entrada de ADN marcadas com BrdU e o imunoprecipitado (ou chiped) DNA foi então manchado para uma membrana utilizando a técnica de fenda blot e imobilizada utilizando UV. A quantidade de ADN nascente em cada slot foi depois avaliado quantitativamente usando análise de Western com um anticorpo anti-BrdU. O efeito da perda de funções HDAC1,2 sobre os níveis de histonas recentemente sintetizadas marcas de acetilação associado com ADN e cromatina remodeler foi então determinada através da normalização do sinal de BrdU-chip obtidos a partir das amostras tratadas para as amostras de controlo.

Para determinar a especificidade dos inibidores selectivos HDAC1,2, foram usadas Hdac1,2 FL / FL e FL HDAC3 / FL células de fibrossarcoma. Foi utilizado a recombinase Cre (Ad-Cre) contendo adenovírus para excluir Hdac1,2 e HDAC3 nestas células. Após a infecção Ad-Cre de Hdac1,2 FL / FL células, foi observado um aumento robusto na H4K5ac. O tratamento de células ...

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Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

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Biology

9.1K visualizações.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

Vídeo: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Genética

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Bioquímica

Medição de ligações cruzadas de DNA-proteína ubiquitiladas, SUMOiladas e ribosiladas com ADP

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autor em destaque: Detecção quantitativa de ligações cruzadas de proteínas de DNA e suas modificações pós-traducionais  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Biologia

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

Resumo

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Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular