עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_135278) לSST. MOP הוא המוטב של מענק דוקטורט מקרן מחקר AXA. אנו מודים פטרישיה Nigg לעזרה עם העיצוב של איור 1.

שים לב לפני התחלה: זרימה למינרית שימוש מכסה המנוע והביו-אטום המתאים בעת עבודה עם נגיף חי. כאן אנו מתארים תנאי גידול מתאימים ל/ WSN זן נגיף שפעת התרבות / 33. פעמים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) ודגירה עשויות להשתנות בהתאם לזן נגיף בשימוש. 1. הכנת / WSN וירוס Biotinylated / 33 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע מדין-דארבי kindey כלבים (MDCK) תאים לתוך בקבוק סנטימטר T175 2 באמצעות הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ופניצילין, סטרפטומיצין 1% (עט / סטרפטוקוקוס). תאי תרבות על 37 מעלות צלזיוס עד confluency כ -70% הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזיהום, להסיר בינוני ולשטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH7.0-7.3) על ידי הוספת נפח מספיק גדול כדי לכסות את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהדביק תאים עם / WSN / 33 עם משרד הפנים של 10 -4. לדלל וירוס בPBS בתוספת 0.02 מ&quot;ג Mg 2 +, 0.01 מ&quot;ג Ca 2 + &lt;/ Sup&gt;, 0.3% אלבומין בסרום שור (BSA), ו -1% פן / סטרפטוקוקוס (זיהום-PBS). השתמש בבידוד של 4 מיליליטר לבקבוק סנטימטר T175 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס. הסר הבידוד על ידי מיליליטר DMEM 10 שאיפה ופיפטה בתוספת 0.3% BSA, 20 מ&quot;מ HEPES, ו -1% פן / סטרפטוקוקוס לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 3 ימים עד השפעת cytopathic (CPE) הוא גלוי, ולאחר מכן supernatant קציר. יכול להיות מוכר כCPE עיגול של תאים ואחרי ניתוק ומוות של תאים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין supernatant ב 450 XG במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תא. העברת supernatant לתוך צינור בז חדש וחזור על שלב זה עוד פעם אחת. מחק את כדורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה supernatants לתוך צינורות ultracentrifuge וsupernatants יסוד עם 5 מיליליטר של סוכרוז 30% בדילול במאגר NTE (10 מ&quot;מ טריס [pH 7.4], 100 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA). לאזן צינורות לפני ultracentrifugation ולמלא את עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. superna ספיןtants ב112398 XG (המקביל ל 25,000 סל&quot;ד הרוטור SW28) למשך 90 דקות בultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות supernatant ידי pipetting ולספוג גלולה וירוס הלילה ב 4 מעלות צלזיוס ב250 μl PBS. Resuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. למדוד את תכולת חלבון של וירוס מטוהר על ידי assay ברדפורד 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת biotinylation ליצור biotinylated / WSN / 33. בצע את ההוראות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להוסיף את הכמות המתאימה של ביוטין לנגיף המטוהר ודגירה של 2H על קרח. העבר את הווירוס לצינור ultracentrifuge ולמלא את צינור עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. ספין וירוס ב112389 XG במשך 90 דקות בultracentrifuge. הסר supernatant ידי pipetting ולהוסיף 250 μl PBS. משרים גלולה במשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot ולאחסן את וירוס Biotinylated מאוחסן ב -80 ° C שבו יהיה יציב לפחות 24 חודשים. הערה: זה יכול להיות מועיל כדי לקבוע את כייל של p biotinylatedפיצוי של IAV ידי assay פלאק הסטנדרטי. עם זאת, יש לציין כי הפרוטוקול שלאחר מכן יהיה רק ​​למדוד חלקיקי נגיף biotinylated. נותר חלקיקי unbiotinylated בשל biotinylation שלם יתרום לכייל זיהומיות ידי assay פלאק אבל לא לאות שנמדדה בassay המצורף / ההפנמה. </li></ol> 2. לקבוע את הכמות הנדרשת של וירוס Biotinylated הערה: לפני assay המצורף / ההפנמה מתבצע, זה חשוב כדי לקבוע את כמות נגיף biotinylated הנדרשת כדי להדביק את כל התאים של מדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ותאי A549 trypsinize לפי הוראות היצרן. ספירת התאים באמצעות תא תא. תאי 200,000 A549 פיפטה לFACS deepwell צינורות. ספין 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלולה עם 200 μl PBS. תאים להתקרר על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי 5 דילולים סידוריים של biotiמניות וירוס nylated בזיהום-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין המכילים את התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול עם 100 המכיל וירוס זיהום-PBS μl. כשימוש שליטה מדומה זיהום-PBS ללא וירוס biotinylated. דגירה צינורות על קרח עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבעון, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בשל paraformaldehyde 3.7% (PFA) 100 μl. דגירה של 10 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpermeabilization, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב100 μl PBS המכיל 0.5% Triton X-100. דגירה של 6 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולאח בBSA 50 μl 2% בדילול מלא PBS המכיל STV-Cy3. (לתשומת לבך, את הריכוז המתאים של STV-Cy3 צריך להיקבע לפני תחילת הניסוי התחל עם ריכוז של 1:. 200 ובדיקת דילולים פי 2 עד 1:. 2,400 בידיים שלנו, דילול של 1: 1,000 הוכיח להיות אופטימלי.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שעה 1 בחושך ב RT. ואז, צעד כביסה חוזרת מתואר ב2.4 אבל resuspend גלולה בBSA 200 μl 2% בדילול מלא PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי cytometry זרימה 16. שער על אוכלוסיית Cy3-החיובית. בחר את הריכוז הנמוך ביותר של וירוס biotinylated כתוצאה מהמספר המרבי של תאי Cy3-חיוביים באוכלוסיית A549. </li></ol> 3. לקבוע את הכמות הנדרשת של streptavidin הערה: היעילות של חסימת האותות שמקורם וירוס תאי קובעת את טווח הגילוי של assay. לכן, חשוב לבטל את אות STV-Cy3 ככל האפשר. הדואר כמות הנדרשת של STV דרוש תלוי בכמות של מניות biotinylated וירוס משמשות (שנקבעו בסעיף 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלבים 2.1-2.4, אבל להשתמש בריכוז וירוס שנקבע בסעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים סידוריים פי חמישה של STV מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלולים בדילול STV 50 μl. כשימוש שליטה מדומה PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן מבלי STV. דגירה צינורות במשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב 2.5-2.9 צעדים. עבור assay ההפנמה, לבחור את הריכוז הנמוך ביותר של STV וכתוצאה מגוש חזק של Cy3-האות (בהשוואה למדגם שבו לא היה נוכח STV). לשם כך, ניתן להשתמש באחוז תאי CY3-חיובי או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. באופן אידיאלי, אות Cy3 של דגימות שטופלו STV צריכה להיות קרובה לאות ממדומה נגועתאים ככל האפשר. </li></ol> 4. קובץ מצורף / ההפנמה Assay הערה: הקפד להכין את כל חומרים כימיים לפני שמתחיל assay. לשלושת קבוצות הביקורת שהוצגו בסעיף התוצאות (תאים נגועים מדומים, תאים טרום שטופלו neuraminidase ותאים אזיד הנתרן שטופלו) שינויים קטנים לפרוטוקול נדרשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 16 צינורות deepwell כל המכילים 200,000 תאי A549. בסמוך לסט הניסיוני בהיקף של 4 צינורות, יש 3 תנאי שליטה, כל 4 צינורות הדורשים: תאים נגועים מדומים, neuraminidase (NA) תאים -pretreated ותאים שטופלו אזיד הנתרן. כל קבוצה מורכבת מ -4 צינורות שכותרתו &#39;דק&#39; 0 &#39;,&#39; דק &#39;0 + STV&#39;, &#39;30 דקות &#39;, &#39;30 דקות + STV&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין בC ° 4 ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולet 200 DMEM μl המכיל 0.3% BSA, 20 מ&quot;מ HEPES ו -1% (בינוני דגירה) פניצילין, סטרפטומיצין. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: לשליטה neuraminidase: neuraminidase חיידקי השימוש (למשל sialidase מVibrio כולרה) בריכוז של 200 mU / מדולל מיליליטר במדיום דגירה לresuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת, ולאחר מכן צינורות מגניבים על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב100 μl biotinylated וירוס (להשתמש בריכוז הווירוס שנקבע בסעיף 2 בדילול מלא בזיהום-PBS). דגירה שעה 1 על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4. הערה: לשליטה נגועות מדומה: השתמש זיהום-PBS ללא וירוס. לשליטה נתרן אזיד: השתמש וירוס בדילול מלא בזיהום-PBS בתוספת 0.1% אזיד הנתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Processing של הדגימות לאחר הזיהום על קרח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות &#39;0 דקות&#39;, בצע את דגימות שלב 2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס עד דוגמאות אחרות הם קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&#39;דק &#39;0 + STV&#39; דגימות, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות &#39;30 דקות &#39;, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור &#39;30 דקות + דגימות &#39;STV ספין צינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 2.6-2.8 ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. לקבוע את אחוז התאים Cy3-חיוביים בכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את וירוס אחוז מצורף וכמות היחסית של וירוס הפנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את כמות הנגיף מצורף, להשתמש באחוז Cy3-positiיש תאים מגודר או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. לשם השוואה, להגדיר תאים שלא טופלו עד 100% (איור 4). הערה: אחוז הווירוס המצורף מתוארת על ידי המדגם &quot;0 דקות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את כמות הנגיף הפנים, לקחת את היחס של &quot;30 דקות + STV&quot; מדגם מדגם &quot;30 דקות&quot; (איור 5). הערה: כפי שצוין לעיל, אחוז תאי Cy3 החיוביים מגודרות או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3 ניתן להשתמש. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+influenza+A+virus:+host+factors+and+antiviral+targets.">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virolog. 2, (2007).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN.">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li><li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans.">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li><li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry.">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li><li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication.">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li><li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu:+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy.">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li><li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes.">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li><li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death.">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Macey, M. G., Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).</li><li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול שלנו מתאר את דרך קלה של מדידה מצורף וירוס והפנמה על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר שימוש בוירוס wildtype שכותרת אשר מחקה באופן הדוק יותר זיהומי נגיף בהשוואה לשימוש בחלקיקים כמו וירוס (אן אל פי). בעוד הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למדידה מצורף והפנמה של IAV זה יכול בקלות להיות מותאם לוירוסים אחרים. בנוסף, כcytometry זרימה משמש לקריאת נתונים, ניתן להוסיף שיתוף stainings בקלות לדוגמא הפרוטוקול לבדוק רמות הביטוי הבאים מציאה או ביטוי יתר של חלבון של עניין. לפיכך, assay מאפשר לשינויים בפרוטוקול בהתאם לצרכים האישיים. ראוי לציין, assay יכול גם להתבצע לסדרה של נקודות זמן למדידת הפנמת וירוס לאורך זמן ולהשיג מידע קינטית. זה עשוי להיות חשוב במיוחד אם assay היה להיות מותאם לוירוס שונה עם קינטיקה הפנמה לא ידועה. האוVer, יש לציין כי החלון של גילוי הוא יחסית קטן כמו הבדלים בקובץ מצורף או הפנמה מתרחשים בקנה מידה ליניארי בשל העדר השכפול הנגיפי. כדי להגדיל את הביטחון העצמי וכדי להפחית את הרעש אנו ממליצים לרבות בקרות (למשל הבקרות לתאר לעיל) וכמה חזרות. למרות התוצאות הראו מתארות ניסוי נציג, צפינו עקביות טובה על פני ניסויים שונים: לדוגמא, עבור קובץ מצורף, אחוז Cy3 החיובי התאים נע בין 60-80%; לוירוס מופנם השגנו ערכים הנעים בין 40-60%. לפני assay הוא התחיל, חשוב לכיל ריכוזי העבודה של חומרים כימיים המשמשים כמו STV, STV-Cy3 ואת כמות נגיף biotinylated. שים לב שהכמות של חומרים כימיים ופעמים דגירה יכולה להשתנות בהתאם לקו התא וזן נגיף בשימוש. כדי להגדיל את החלון של איתור, אחוז התאים החיובי לווירוס attachmenלא צריך להיות גבוהים ככל האפשר ב&quot; המינימום 0 ו&quot; 30 דקות &quot;מדגם (תלוי בכמות נגיף biotinylated בשימוש) והנמוכה ככל האפשר ב&quot; דקות 0 + מדגם STV&quot; (בהתאם לכמות של STV השתמש ). בנוסף, רעש יכול להיות מופחת על ידי שמירה על התאים ב 4 מעלות צלזיוס במהלך צנטריפוגה ועל ידי שטיפה עם PBS קר כקרח.

הכניסה של וירוס שפעת (IAV) היא תהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של הווירוס לקולטנים על קרום הפלזמה של תאי המטרה 1. קולט לIAV הוא חומצת sialic אשר קיים במגוון גדול של גליקופרוטאינים וglycolipids. חלבון hemagglutinin (HA) של IAV אשר שוהה במעטפת הנגיפית נקשר לחומצת sialic ובכך מתווך קובץ מצורף של החלקיקים הנגיפיים על קרום הפלזמה של תאי המטרה 2. הווירוס נכנס לתאים באמצעות אנדוציטוזה תיווך clathrin אלא גם מסלולי כניסה חלופיים, כגון macropinocytosis, תוארו 3-6. האינטראקציה בין HA וחומצת sialic נראית מספיק לתיווך שניהם, מצורף ומפעיל הפנמה של חלקיקים נגיפיים 7. עם זאת, קולטני כניסה חלופית הוצעו ותפקידיהם בכניסת IAV כרגע נחקרים 1,8,9. כֶּלֶבrently, נעשים מאמצים לזהות גורמי מארח שמעורבים במחזור החיים של הנגיף במטרה לפתח טיפולים אנטי רומן צורך דחוף 10-12. כניסת וירוס תהיה צעד חיובי עבור מיקוד צמיחת IAV כדי לחסום זיהום ויראלי בשלב המוקדם ביותר שלה. מדידת שלבים שונים של כניסת IAV ניסוי היא מאתגרת כמו כמויות גדולות של וירוס בדרך כלל נדרשות לזהות את הווירוס הנכנס. בנוסף, טווח גילוי לשינויים בכניסת וירוס הוא ליניארי רק בשל חוסר השכפול נגיפי. זה מדגיש את הצורך במבחנים עם רגישות גבוהה. Assay אנו מציגים כאן מאפשר זיהוי של וירוס מצורף על פני השטח של התאים, כמו גם זיהוי של וירוס הפנים ביחס לסכום הכולל של הווירוס הקשורים תא. השימוש בוירוס wildtype biotinylated מאפשר מדידה נוחה באמצעות צביעה עם STV-Cy3 וreadout ידי cytometry זרימה. וירוס Biotinylated קר-קשור לתאים כדי לאפשר מצורף אבל למנוע הפנמה של חלקיקים נגיפיים. יכולים להיות קבועים תאים, permeabilized ומוכתמים בSTV-Cy3 למדוד וירוס מצורף. האות מvirions תאית, מצורף יכולה להיות מבוטלת אם צעד חסימה מיושם לפני הקיבעון שבו התאים הודגרו עם streptavidin ללא כותרת (STV). בשלב הבא, לאחר התקשרות של IAV biotinylated, טמפרטורה מוסטת עד 37 מעלות צלזיוס והפנמה של חלקיקים נגיפיים מותר לקחת מקום. חלקיקים הפנימו מוגנים מכריכה של STV ובכך מאפשר האפליה בין וירוסים שמחוץ ולתאיים. לתנאי ניסוי, ארבע דגימות נדרשות: &#39;דק&#39; 0 &#39;: המדגם הראשון, שכותרתו&#39; דק &#39;0&#39;, הוא למדוד וירוס הנכנס קר על פני התא. &#39;דק&#39; 0 + STV &#39;: המדגם השני, שכותרתו&#39; דק &#39;0 + STV&#39;, נותן את עוצמת האות הבסיסית של הניסוי. וירוס מצורף חסום שנינותSTV שעות והצביעה הבא האות עם STV-Cy3 צריך להיות נמוכים בהרבה בהשוואה למדגם &#39;0 דקות&#39;. &#39;30 דקות &#39;: המדגם השלישי, &#39;30 דקות&#39; מכילה מצורפים והפנימו וירוס עקב שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. &#39;30 דקות + STV &#39;: המדגם הרביעי, &#39;30 דקות + STV&#39; צעדי החלק תאיים של וירוסים. צעד חסימת STV מיושם לאחר תקופת הדגירה 30 דקות. כתוצאה מכך, חלקיקים נגיפיים בתא השטח כפופים STV עוזבים וירוסים רק הפנימו זמינים לצביעה עם STV-Cy3. הכמות היחסית של וירוס הפנים ניתן מחושבת כיחס של וירוס הפנים (נמדד בדקות &#39;30 + STV &#39;המדגם) מחולק בסכום הכולל של וירוס (שתואר על ידי &#39;30 דקות&#39; לדוגמא). כפקדים אנו מציעים לכלול תאים נגועים מדומים. האות הבאה מכתים STV-Cy3 של תאים נגועים מדומים נותנת רקעכתוצאה מהפרוטוקול מכתים. שליטה לקובץ מצורף IAV היא הטיפול מראש של תאים עם neuraminidase חיידקים (NA). דבק NA את חומצת sialic מגליקופרוטאינים סלולריים, ובכך להסיר קולטנים קובץ מצורף מתא השטח. אזיד הנתרן (SA) הוא מעכב חילוף חומרים חזק ובכך חוסם אנדוציטוזה 13. תאים שטופלו עם אזיד הנתרן צריכים להיות חיוביים לוירוס מחייב אך שליליים להפנמה.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

קריקטורה המתארת ​​את ארבעת תנאי ניסוי שונים מוצגת באיור 1 תוצאות של ניסוי נציג מוצגות באיורים 2 -. 5. במדגם &quot;0 דקות&quot;, וירוס biotinylated קר-מחויב למקד תאים שניתן דמיינו ידי מכתים STV-Cy3 (איורים 1 ו -2). כאשר צעד חסימה (ב&quot; דקות 0 + STV &quot;מדגם) מוחל, וירוס על פני התא כבר לא יכול להיות מזוהה על ידי צביעת STV-Cy3. כתוצאה מכך, עוצמת האות ב&quot; דקות 0 + STV &quot;מדגם חום מופחת בהשוואה למדגם&quot; 0 דקות &quot;(איורים 1 ו -2). עם העלאת הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס, וירוס מצורף הוא נלקח לתאים (לדוגמא &quot;30 דקות&quot;). הווירוס הפנים אינו רגיש לחסימה עם STV ללא תווית שתוצאת ירידה דרמטית פחות בעוצמת אות ב&amp; #8220; 30 דקות + STV &quot;דגימות ביחס ל&quot; מדגם 30 דקות&quot;, שבי אין חסימת STV יושמה (איורים 1 ו -2). כפקדים אנחנו מועסקים זיהום מדומה, טיפול NA וטיפול SA. איור 3 מציג את האחוזים של תאי Cy3-חיוביים לכל תנאי הניסוי מתוארים בסעיף 4. תאים נגועים במוק לתת את עוצמת אות רקע לניסוי ולפעול שליטה שלילית ל קובץ מצורף וירוס (איור 4). בקרה נוספת לקובץ מצורף וירוס היא טיפול עם NA הביע bacterially. NA מסיר חומצת sialic, קולט לקובץ מצורף IAV, מגליקופרוטאינים על פני התא ובכך מפחית מחייב של הווירוס למקד תאים 17. כפי שניתן לראות באיור 4, טיפול עם NA מאוד מבטל מצורף IAV בכ -90% בהשוואה לתאים שלא טופלו. לגבי הפנמה, השתמשנו SA כשליטה. TR SA<html> eatment מייד מכלה את רמות ה- ATP סלולריות ובכך מעכבות תהליכי אנרגיה רב כגון אנדוציטוזה 13. דגירה של תאים עם SA במהלך ואחרי הפנמת זיהום עכבות של חלקיקי נגיף. הכמות היחסית של הווירוס הפנים (המתואר באיור 5) הועלתה מ -10% ל -45% על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתאים שלא טופלו. בעקבות טיפול SA עם זאת, אחוז הווירוס הפנים יחסי הייתה כ -15% לשניהם, תאים טופחו במשך 30 דקות 0 ועל 37 מעלות צלזיוס. זה מצביע על כך אכן, SA מפחית את הספיגה היעילה של חלקיקים נגיפיים לתוך תאים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53372/53372fig1.jpg" /> איור 1. עיקרון של assay. קריקטורה המסבירה את העיקרון של assay המצורף / ההפנמה.= &quot;_ Blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53372/53372fig2.jpg" /> איור 2. תוצאת נציג לקובץ מצורף IAV והפנמה. היסטוגרמה () מראה את עוצמת האות של אות Cy3 לתאים שלא טופלו. מוצגים הם &quot;0 דקות&quot;, &quot;דקות 0 + STV&quot;, &quot;30 דקות&quot; ו- &quot;30 דקות + STV&quot; מדגם. אחוז (B) של תאי Cy3 החיוביים מא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53372/53372fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53372/53372fig3.jpg" /> איור 3. תוצאת נציג להתקשרות והפנמה לרבות בקרות. </st<html> Rong&gt; אחוז תאי A549 Cy3 החיוביים לאחר טיפול המצוין. המוצגים הם מדומה נגוע, שלא טופל, טופל NA וטופל SA תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53372/53372fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53372/53372fig4.jpg" /> איור 4. עיכוב של קובץ מצורף וירוס על ידי neuraminidase. () היסטוגרמה המציגה את עוצמת אות Cy3 של דגימות &quot;0 דקות&quot;. מוצג הם תאים שלא טופלו (בכחול) ושתי דגימות בקרה: תאים מדומים נגועים וטופלו NA (באדום וכתום, בהתאמה). אחוז (B) של תאי Cy3 חיוביים מא מוצגים הם מדומה, שלא טופל ומטופלי NA תאים מהמדגם &quot;0 דקות&quot;. הערך לתאים שלא טופלו נקבע ל -100%.com / קבצים / ftp_upload / 53,372 / &quot;target =&quot; _ 53372fig4large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53372/53372fig5.jpg" /> עיכוב איור 5. של הפנמת וירוס על ידי אזיד הנתרן (SA). () היסטוגרמה המציגה את עוצמת אות Cy3 של &quot;30 דקות&quot; ו- &quot;30 דקות + STV&quot; דגימות ממטופל (באדום וכתום, בהתאמה) וסמ מטופלים (בכחול וירוק, בהתאמה) תאים. אחוז (B) של וירוס הפנים יחסי מהתאים שלא טופלו ומטופלים-SA אחרי 0 ו -30 דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53372/53372fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Views.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Video: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biology

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

מדידת ההפעלה של פונקציות אפקט בתיווך Fc על ידי נוגדנים HA

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

זיהוי היצמדות חיידקים לתאים מארחים באמצעות דימות פלואורסצנטי

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...