Name: rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae
Uploaded: 2016-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
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We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. Synthese und Herstellung dsRNA <ol><li> Identifizieren Sie einen 200-800 bp Region Knockdown (um die entsprechenden dsRNA erzeugen) innerhalb des Gens von Interesse , die vorhergesagt wird , keine erkennbaren Nebeneffekte haben (zB keine Sequenzhomologie ≥18 bp innerhalb eines anderen Gens) und eine negative Kontrolle (zB eine heterologe Sequenz, die nicht vorhanden innerhalb der Zielinsekten Genom, wie beispielsweise die Escherichia coli lacZ - Gen (GenBank Gene ID: 945.006) ist. Alternativ dazu verwenden , um eine positive Kontrolle (beispielsweise , die einen leicht beobachtet Phänotyp wie SRPN2 21,22 ergibt , Gene GenBank ID. 1270169) die Sequenz der dsRNA Targeting SRPN2 wird in Michel et al definiert (2005) 21.. Hinweis: E-RNAi ist ein Open-Source bioinformatischen Ressource , die für die Identifizierung solcher Regionen und für den Prozess des Entwerfens Oligonukleotidprimer 23 nützlich ist. </li><li> Führen Sie standard PCR - Amplifikation (dh durchgeführt mit Taq DNA - Polymerase unter Verwendung von 30-35 Zyklen) eine genomische DNA oder cDNA - Matrize unter Verwendung von dsRNA Synthesemuster durch eine T7 - Promotorsequenz (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) und weiter mit dsRNA Zubereitung flankiert zu erhalten , und unter Verwendung eines kommerziellen in - vitro - Transkription - Kit nach den Anweisungen des Herstellers reinigen-up. Verwendung SRPN2 PCR Amplifikationsbedingungen und Primer Information wie in An et al. (2011) 22. </li><li> Quantifizierung gereinigter RNA Amplikon Ausbeuten durch ultraviolette Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 260 nm und passen auf die gewünschte Konzentration (beispielsweise 3 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l) in RNase-freiem Wasser. <ol><li> Für niedrige RNA-Konzentrationen zur Fehlerbehebung reduzieren Flüssigkeitsvolumen von Proben, die in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur oder durch Lyophilisieren Proben und Rekonstitution in kleineren Mengen von Wasser dreht. Die Zeit für die Proben Lyophilisierung erforderlich variiert in Abhängigkeitbei der ersten Probenvolumina und dsRNA-Konzentrationen. </li></ol></li><li> Überprüfen der Qualität und der Länge der dsRNA auf einem 2% Agarosegel, hergestellt mit 1x TBE oder TAE-Puffer und gefärbt mit Ethidiumbromid (EtBr), zusammen mit der Matrizen-DNA für die Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die dsRNA wird wandern langsamer als Template-DNA. Qualität und Länge kann durch Sicherstellen, gibt es keine nicht-spezifischen dsRNA Produkte und durch den Vergleich Produkte mit einem Standard-DNA-Marker bzw. bewertet werden. Hinweis: EtBr ein potenter mutagen und sollte entsprechend behandelt werden. Anmerkung: Bei einer dsRNA Konzentration von 3 ug / ul, 0,5 ul der Probe mehr als ausreichend ist für die Visualisierung auf der EtBr-gefärbten Agarosegel. </li><li> Speichern von dsRNA bei -20 ° C bis benötigt. Mehrere Frost / Tau-Zyklen kann dies zum Abbau verursachen, so dass Teilmengen sollten für große Mengen von dsRNA hergestellt werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie Fast Green FCF Dye (FGD) Schläuche <ol><li> Verdünnen Fast Green FCF Farbstoffvon Stammlösung (≥85% Farbstoffgehalt) auf 0,1% (v / v) (Arbeitslösung) in RNase-freiem Wasser. </li><li> Pipette 1 ul Farbstoff in den Boden eines 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Die Röhrchen in einem 65 ° C Heizblock für ca. 3 Stunden zu verdampfen Flüssigkeit, dann die Röhrchen bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten abkühlen, bevor Sie. Dieser trockene feste Farbstoff wird in dsRNA Resuspensionslösung wiederherzustellen. </li></ol> 3. Ziehen Injektionsnadeln <ol><li> Ziehen Borosilicatglas Nadeln einen beheizten Nadel Abzieher zu einem Spitzendurchmesser von 10 bis 30 &amp; mgr; m verwendet. Ziehen Sie Einstellungen entsprechen: Abgleich der Heizung nicht. 1 = 100, Abgleich der Heizung nicht. 2 = 70. </li><li> Um eine Beschädigung der feinen Spitze der Nadel, wenn sich alle gezogen Nadeln horizontal in einer Petrischale auf einem Streifen von Form Kitt vermeiden. Hinweis: Weitere Informationen zur Kapillarnadel Methoden ziehen können in weiteren Einzelheiten in der Malaria-Forschung und Referenz-Reagenz Resource Center M findenR4 Handbuch 24. </li></ol> 4. Bereiten Sie Injection-Station <ol><li> Sammeln Sie Materialien benötigt: Glas Mikrokapillare Nadeln feine Spitze gezogen, Mikroinjektors, dünnes Filterpapier und dickes Filterpapier, Petrischalen, Transferpipetten, Pinsel und sezieren Lichtmikroskop. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektors wie in der Anleitung beschrieben Mikroinjektors und setzen Injektionsvolumen auf das gewünschte Volumen pro Impuls (zB maximal 69 nl pro Puls). </li><li> Auf einer Plattform , die unter dem Mikroskop zu manövrieren ist einfach (zB flache Seite eines Styropor Röhrchenrack), stapeln die beiden Filterpapierblätter mit dem dünnen Filterpapier auf, und befestigen Sie ihn mit Klebeband an den Rändern. </li><li> Resuspendieren 10 ul jeder dsRNA-Lösung in getrennten farbigen Farbstoff Rohre, und auf Eis. </li></ol> 5. Sammeln Pupae zur Injektion <ol><li> Füllen Sie eine kleine 60 mm x 15 mm Petrischale mit 10 ml VE-Wasser und sammeln ~ 50 bleich Puppen (during der ersten 24 Stunden nach der Verpuppung) von einem Insektarium Schale eine Einweg-Plastiktransferpipette. </li><li> Entfernen Sie alle Puppen, die mittel- bis dunkel Kutikula Bräunung haben. Hinweis: Sobald die Nagelhaut zu bräunen beginnt, wird es schwieriger, die Kutikula und Injektion führt zu viel höheren Letalität zu durchdringen. </li></ol> 6. dsRNA Injection <ol><li> Unter dem Binokular, brechen die distale Spitze der Injektionsnadel mit einem Paar von feinen Pinzette ab. </li><li> Bereiten Sie die Injektionsnadel durch die Nadel mit Mineralöl Verfüllung (eine Spritze mit einem 3-Zoll, 30-Gauge-Nadel) und überschüssiges Öl mit dem Austreiben Mikroinjektor. </li><li> Vordere Injektionsnadel mit einer maximalen Menge an dsRNA, füllen und ein Impuls unter dem Mikroskop auswerfen die Abgabe von Flüssigkeit zu gewährleisten. Für den Fall, dass keine Flüssigkeit aufgenommen und / oder vertrieben, überprüfen Sie die distale Spitze der Nadel für jede Verstopfung und sicherzustellen, dass die Nadel fest in der microinjecto gesichert istr. </li><li> Wählen Sie 1-3 pupae, und legen Sie sie auf das Filterpapier. </li><li> Mit dem Pinsel, positionieren Sie den Puppen auf dem Filterpapier mit dorsalen Kutikula zugänglich, und verwenden Sie den Pinsel auf Filterpapier zu schieben und von überschüssigem Wasser zu absorbieren. </li><li> Stabilisieren Sie die Puppe mit der Spitze des Pinsels, und legen Sie die Nadel in die dorsale Häutchen zwischen dem Thorax und Abdomen in einem Winkel von etwa 30 ° in Bezug auf die dorsale Oberfläche der Puppe. Die Injektion sollte gegen die hintere Ende der Puppe und der Nadel gerichtet werden sollte, in einer anterioren-to-posterior-Richtung bewegt werden. </li><li> Injizieren zwei Impulse (69 nl pro Impuls) von 3 ug / ul dsRNA-Lösung in die Hämolymphe, und prüfen, ob die Verteilung der Farbe im ganzen Körper. Wenn keine Farbe erkannt wird, verschieben sich die Injektionsnadel Position leicht die Spitze von Verstopfung zu beseitigen und Flüssigkeitsabgabe wiederholen. </li><li> Verwenden Sie den benetzten Pinsel vorsichtig Puppe aus der Nadel in das Wasser für die Kultivierung zu bewegen. Ter Pupa zum Pinsel auf leichten Kontakt bleiben sollte. </li></ol> 7. Post-Injektionsbedingungen <ol><li> Legen Sie Petrischale mit injizierten Puppen in einem Moskitokäfig mit geeigneten Luftstrom (zB Mesh - Käfig oder Behälter mit Mesh - Deckel). Pupal Aufzuchtbedingungen sollten konsequent bei 27 ± 3 ° C Temperatur, 75 ± 5% Luftfeuchtigkeit bleiben und sein unter einem Licht: Dunkel-Zyklus von 16: 8 Stunden. </li><li> Bereiten Sie eine 10% (w / v) Glucoselösung, und legen Sie eine Lösung gesättigten Wattebausch auf dem Moskitokäfig für Erwachsene Fütterung Netz. </li></ol> 8. Beurteilen Sturz <ol><li> In gewünschten Zeitpunkt (e), zu bewerten Phänotypen in experimentellen dsRNA injiziert Insekten, im Vergleich zu Kontrollen. <ol><li> Beurteilen dsSRPN2 und dsLacZ Insekten täglich von Erwachsenen Kühlen hinunter für ca. 2-3 min bei -20 ° C, um sie zu einer kalten Platte zu übertragen , auf 2 ° C und Identifizieren jedes pseudo-Tumorbildung durch Verwendung eines Präpariermikroskops bei 15XVergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Nach Einschätzung Rückkehr Erwachsene Insektarium Bedingungen (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% Luftfeuchtigkeit). Hinweis: Die Versuchs- und Kontroll dsRNAs in diesem Protokoll verwendet werden , sind dsSRPN2 und dsLacZ sind. Es gibt viele Möglichkeiten für Kontrollen; Es wird jedoch vorgeschlagen , dass eine positive Kontrolle für die Phänotyp und / oder Expression leicht sichtbar gemacht wird (zB durch Sezieren Mikroskopie) und / oder quantifiziert [zB quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Western Blot] verwendet werden soll wenn diese Technik zu erlernen. SRPN2 Protein und Transkript Quantifizierung über Western - Blot und qRT-PCR sind jeweils in Michel et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

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Aktuelle Methoden zur beinhalten in Stechmücken nicht-transgenen RNAi induzieren direkte Injektion von dsRNA in die Erwachsenen Hämocoel 12,13 oder Larvenfraß von RNAi - Trigger-beschichtete Nanopartikel 14-17 oder Mikroalge-basierte dsRNA - Moleküle 18. Targeting adulten Stechmücke, während extrem wertvoll, kann eine große Anzahl von Genen ausschließen, die während der früheren Entwicklungsperioden funktionieren. Preissturz durch Larvenfraß ausgelöst inkonsistent Phänotypen während der erwachsenen Stadium ergeben darauf zurückzuführen, zum Teil auf das Potential der variablen Protein Persistenz durch die Verpuppung. Daher Einführung eines zusätzlichen Verfahren, das ein Mittel liefert speziell an Initiieren RNAi während pupal Entwicklung ausgerichtet ist, um mehr vollständig Genfunktionen während der Pre-adult Entwicklungsstadien sowie verbesserte Fähigkeiten zur Bewertung der Genfunktion während adulte Stadien beurteilt. Wie bei Knock-Down-Ansatz basiert auf dsRNA Injektion oder Ausdruck, der Persistenz der Knock-Downkann nicht vorhergesagt werden. Daher Transkript oder Protein-Ebene für Gen von Interesse während der Entwicklungszeiten von Interesse bewertet werden sollten. Obwohl wir eine Fortsetzung beobachten von Proteinspiegel am Tag 5 nach der Injektion für SRPN2 in SRPN2 dsRNA-injizierten Tieren vermindert, Faktoren wie Proteinumsatz und Halbwertszeit kann für verschiedene Ziele unterscheiden. Es ist entscheidend, aber auch, um sicherzustellen, dass die dsRNA zur Injektion verwendet werden gut konzentriert ist, und erscheint auf einem Agarosegel intakt. Wir empfehlen Experimentatoren diese Faktoren neu bewerten, wenn Zuschlags Ergebnisse nicht ausreichend sind, und die jeweiligen Konzentrationen von dsRNA müssen empirisch für spezifische Gen-Targets getestet werden. Wir beschreiben ein Verfahren zur Initiierung der RNA - Interferenz während der Verpuppung von An. gambiae Entwicklung. Dieses Verfahren beruht auf der Einführung über Mikroinjektion von dsRNA direkt in die Hämocoel der frühen Puppen und ermöglicht die Beurteilung von Injektionsqualität durch dieVerwendung von Farbstoff-markierten dsRNA. Die Fähigkeit Injektionsqualität zu visualisieren stellt eine entscheidende Verbesserung für die Gewährleistung erfolgreichen Zuschlags und stellt einen Aspekt der Injektion basierende Knock-Down, der nicht in den meisten bisher berichteten dsRNA-basierte Protokolle Fokussierung auf das Erwachsenenstadium berücksichtigt hat. Durch die Ausrichtung der Puppe zu Beginn dieser Entwicklungszeit, Gene, die eine Rolle in dieser kritischen Entwicklungsintervall spielen könnte, oder während der frühen Stadien des Erwachsenenalters können funktionell ausgewertet werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren dsRNA Lieferung an Zellen ermöglichen, und Etablierung von RNA-Interferenz in Zellen, die während der Metamorphose zugänglich sind, aber weniger zugänglich in voll ausgebildeten erwachsenen Mücken. Eine kürzlich Microarray - Analyse von Harker et al. (2012) identifiziert 560 ein. gambiae - Transkripte , die während verschiedene Entwicklungsstadien von mindestens 4-fach hochreguliert oder herunterreguliert wurden, angefangen vom Embryo zum Erwachsenen. Von den 560 Transkripte identifiziert, ein Satz von 309 wurde hochreguliert während pupal Entwicklung 27. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es viele Anforderungen für die differentielle Genexpression gesamten Moskito Entwicklung, einschließlich derer, die im Puppenstadium eintreten, ein Intervall, in dem der Organismus Metamorphose unterzogen wird. In vielen Insektenarten, darunter ein. gambiae, in den Prozessen beteiligten Gene wie Entwicklung (dh pupal kutikulären und Chitin-bindende Proteine) 27-31 und Immunantwort (dh Toll - Rezeptor-ähnliche Proteine) 27,32-34 werden während der Verpuppung stark exprimiert. Sobald ein voll ausgebildet Erwachsenen entstanden ist, wird es die Genexpression in Reaktion fortgesetzt ökologischen und physiologischen 35 ändert. Bemerkenswert ist , während der frühen Entwicklung im Erwachsenenalter gibt es eine Erhöhung der Expression von Entwicklungsgenen (dh erwachsene kutikulären und sarcoplasmic Proteine) 36, sowie andere Schlüsselgene (dh </em&gt;, Sperma spezifisches Protein und Cytochrom - P450 - Stoffwechsel - Enzyme) 27,36. Die positive Kontrolle bei der Entwicklung dieses Protokolls SRPN2, ist ein An. gambiae Serin - Protease - Inhibitor (Serpin). SRPN2 spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulierung des Insekten Melanisierung, ein breites Spektrum angeborene Immunantwort in Insekten 21,22. Preissturz von SRPN2 bei erwachsenen Mücken Ergebnisse in pseudo-Tumorbildung 21,22, einem Phänotyp , die leicht durch die Verwendung von Lichtmikroskopie beobachtet wird. Da dieser deutlichen Phänotyp kann leicht in lebenden Insekten erzielt werden, haben wir SRPN2 für die anfängliche Verpuppung RNAi - Injektionen. Zusätzlich wird SRPN2 während aller Entwicklungsstadien 37 ausgedrückt, wodurch ein gutes Ziel für die Verpuppung RNAi Injektion und Beurteilung der Funktion im frühen Erwachsenenbereitstellt. Wir zeigen, dass die Methode, die wir entwickelt haben, ist in der Lage zu induzieren ähnlich Erwachsenen melanotischen pseud<html> o-Tumorbildung als Folge der dsRNA Einspritzungen während der Verpuppung der Entwicklung durchgeführt. In diesem Protokoll zu entwickeln, haben wir , dass die Injektion während der frühen Entwicklung pupal beobachtet (dh die ersten 24 Stunden nach der Larven-pupal molt) für den Erhalt der optimalen Erwachsenen Entstehung entscheidend ist. Für den Fall, dass eine schlechte Auflaufen Nacheinspritzung erreicht wird, empfehlen wir Staging-Larven mit größerer Genauigkeit, Puppen mit weniger umfangreichen Cuticula Härtung zu erhalten und frühen Puppenstadium Injektions gewährleisten erreicht. Darüber hinaus kann in einem optimalen Notraten und zunehmender Vergrößerung während der Injektion eine Beschädigung der Kutikula Ergebnisse zu minimieren helfen sicherzustellen, dass nur der vorgesehene Bereich des Tieres durchstochen wird. Wenn die Nadel in die ventrale Kutikula Punktion durch sollte Pooling von farbstoffmarkierten Flüssigkeit auf der Außenseite der Puppe offensichtlich sein, oder das Filterpapier zu sättigen. Es wird dringend jede pupae wegzuwerfen empfohlen, die mehr als eine Kutikula Einstich aufweisen. jove_content &quot;&gt; Mit den umfangreichen Erfahrungen von vielen Labors mit der Leistung der Erwachsenen Moskito Injektionen können zuvor identifizierten Mikroinjektions Ansätze mit einfachen Protokoll Änderungen in pupal RNAi-Experimente Einsatz angepasst werden. Insgesamt ist das Ziel dieser Methode ist es, Forscher, um die Fähigkeit zu erweitern Sie den Zeitrahmen , in denen genetische Analysen umkehren durchgeführt werden, weiter ermöglichen , Forschung, die Entwicklung neuer Kontrollstrategien unterstützen wird. Interessant ist , dass Experimente in anderen Arten, wie Rhodnius prolixus und Spodoptera frugiperda, zeigen , dass die Gen - Silencing - Effekte sind in der Regel viel zu sein größer , wenn während der Pre-adulte Stadien 38,39. während aller Phasen der Entwicklung RNAi-vermittelten Knock-Down unterliegt Überlegungen in Bezug auf die Schnelligkeit und Ausdauer von Gen - Silencing, und die Stabilität der kodierten Proteine ​​durch gezielte Gene. die ideale RNAi - Ziel initiiert Gene sind in der Regel diejenigen, die kodieren für ein protei seinn oder RNA , die hat eine kurze Halbwertszeit und eine hohe Fluktuationsrate 11,40. Während transgene RNAi Strategien auch Überlegungen zur Adresse verwendet werden kann , in Bezug auf Schnelligkeit und Persistenz von RNAi bei pre-adulte Stadien weisen transgene Techniken viele Nachteile (beispielsweise Zeit für die Erzeugung von transgenen Linien erforderlich, experimental Zeitrahmen für Moskito Paarungen Insekten zu erzeugen mit geregeltem dsRNA-Expression und Wartung von transgenen Aktien). Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine einfachere und schnellere Methode für die Einleitung Knock-Down während pupal Entwicklung und in Zelltypen, die während der Metamorphose zugänglich und sind aber weniger zugänglich sind bei Erwachsenen. Die Verwendung von Farbstoff-markierten dsRNA Suspensionen ermöglicht eine einfache Beurteilung der Injektion Erfolg und die Verbreitung von eingeführten Materials innerhalb pupae. Unsere Daten auf den Beginn der Tumorbildung in pupal injizierten Erwachsene, wie Erwachsene zu injizierenden Tieren verglichen, steht im Einklang mit initiation von RNAi-vermittelten Knockdown während der Verpuppung. Mit unserem G3 Moskito-Linie und unter unseren Insektarium Bedingungen haben wir die Erwachsenen melanotischen Pseudotumorbildung so früh wie 10 Tage nach der Injektion von Erwachsenen im Nachauflauf injiziert drei bis fünf Tagen zu beobachten. Zu Beginn des Jahres pupal stufigen Einspritzung durchgeführt wird , beobachten wir sichtbar melanotischen Pseudotumorbildung bereits fünf Tage nach der Injektion (dh drei bis vier Tage nach der Entstehung). Diese Daten implizieren , dass diese Methode ermöglicht die Einleitung von Knock-Down während einer bisher untersuchten Entwicklungszeit (dh pupal Entwicklung). Unsere Farbstoffmarkierungsverfahren kann auch als nützlich erweisen, für die Entwicklung neuer larvalen Injektionsprotokolle, aufgrund der durchscheinenden Natur der Kutikula bei allen Larvenstadien. Während die Steuerung in dieser Studie verwendet Progression in erwachsenen Stadium erfordert einen Zuschlags Phänotyp anzuzeigen, um zukünftige Experimente Verpuppung spezifischen Phänotypen Beurteilung nach der Injektion von frühen pupae liefertwertvolle Einblicke, die Erweiterung dieser Methode in zusätzliche Entwicklungszeiten wie spät pupal Entwicklung. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren einen wertvollen RNAi-Protokoll für Verpuppung Initiierung von RNAi-vermittelten Knock-Down und erweitert die funktionelle Genom Werkzeuge zur Verfügung, für die Verwendung innerhalb des Vektors Insektenforschungsgemeinschaft.

Malaria ist eine durch Moskitos übertragene Infektionskrankheit, die jedes Jahr viele Millionen von Menschen betroffen sind. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtet , dass im Jahr 2013 etwa 584.000 Todesfälle aufgrund von Malaria da waren, 78 Prozent davon 1 bei Kindern unter dem Alter von fünf Jahren aufgetreten. Die Erreger , die menschliche Malaria verursachen , sind apicomplexan Parasiten der Gattung Plasmodium und zwischen ihren menschlichen Wirten von weiblichen Anopheles - Mücken übertragen. Die Übertragung erfolgt, wenn die Mücke eine Blutmahlzeit von einem Individuum nimmt die infiziert wird und dann Ablagerungen infektiösen Parasiten in einem nicht infizierten Individuum in einer nachfolgenden Blutmehl. Innerhalb der Gattung Anopheles, ist Anopheles gambiae die Spezies mit der größten vektorielle Kapazität und ist der prominenteste Malaria Vektor in Afrika südlich der Sahara 1-3. Derzeit setzt die Steuerung mit Moskito-Vektor durch den Einsatz von Insektiziden zu be die wichtigsten Verfahren eingesetzt, um die Belastung der menschlichen Malaria zu reduzieren. Obwohl die Verwendung von Insektiziden seit den 1960er Jahren als äußerst erfolgreich erwiesen hat, hat sich der Anstieg der Insektizidresistenz eine Notwendigkeit für die Entwicklung neuer Insektizide und alternative Kontrollstrategien 4-7 angetrieben. Im Jahr 2010 zeigte eine insgesamt 49 von 63 Ländern der WHO berichtet das Auftreten von Insektizid - Resistenz der Malariavektoren 1. Darüber hinaus berichtet der IR - Mapper - Tool, das Peer-Review - Literatur nutzt Widerstandsdaten in Afrotropis Regionen zu bewerten, dass es zwischen 2001 und 2012 46% und 27% Anstieg der Resistenz gegen Pyrethroide und dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) wurden jeweils 7. RNA - Interferenz (RNAi) wurde in den frühen 1990er Jahren als eine Technik identifiziert , die Gene in der Pflanze Petunia 8,9 und in dem Pilz eingesetzt werden könnten Neurospora crassa 9,10 zu inaktivieren. Kurz danach,1998 RNAi wurde zuerst 9,11 als Mittel zur Verringerung der Genexpression in einem Tiermodell durch Einführung von Antisense oder Doppelstrang - RNA (dsRNA) über Injektion oder Fütterungsmethoden in Caenorhabditis elegans dokumentiert. Seit seiner Entdeckung hat RNAi die Ausübung der funktionellen Genomik revolutioniert, indem es den Forschern erlaubt reversen Genetik zu nutzen, um schnell die funktionelle Rolle von Genen von Interesse über eine hochselektive posttranskriptionales Gen-Silencing-Mechanismus zu untersuchen. In einigen Organismen, wie Drosophila melanogaster, die Verwendung von transgenen Organismen , die interfering RNA - Konstrukte exprimieren hat für Knock-Down (KD) weitgehend erfolgreich. Obwohl die Verwendung von Transgenen in An. gambiae für RNAi verwendet wurde , und kann nützlich für große Bildschirme beweisen, die Erzeugung von transgenen Moskitos Stämme ist sowohl arbeits- und zeitintensiv, in der Regel zwei bis drei Monate unter der Identifizierung eines Gens von Interesse für die Generati zu gehenauf einer entsprechenden transgenen Lager 12. Derzeit ist die primäre Methode der Gen - KD in An. gambiae ist durch Injektion in die Hämolymphe, während der erwachsenen Stadium von dsRNA spezifisch für ein gegebenes Gen 12,13. Dieser Vorgang dauert typischerweise etwa einen Monat nach Identifizierung eines Gens von Interesse zu Beurteilung des Gens KD zu gehen, was beweist , 12 viel schneller als transgene Methoden. Methoden für die Larvenstadium RNAi wurden kürzlich in einem etablierten. gambiae und Aedes aegypti über Nanopartikel 14-17 oder durch die orale Verabreichung von Mikroalgen-basierte dsRNA - Moleküle 18 Fütterung und bietet Möglichkeiten während der frühen Stadien der Entwicklung funktioneller Genomanalyse durchzuführen. In Direkteinspritzung, Fütterung, und zur Freisetzung von Nanopartikeln Verfahren wird dsRNA durch das Enzym Dicer in 21 bis 25 Nukleotide lange &quot;short interfering RNAs&quot; (siRNAs) 19,20 autonom durch die Zielzelle und gespalten aufgenommen. Diese siRNAs sind dann incorporated in den RNA-induzierten Silencing - Komplex (RISC), von dem ein Strang abgelegt wird, das RNA-gebundene RISC - Komplex erlaubt die Ziel mRNA zu binden und zu spalten und dadurch das Niveau zu reduzieren und seine Übersetzung 19,20 hemmen. Viele wesentlichen Merkmale der grundlegenden Moskito Biologie modulieren vektorielle Kapazität, einschließlich Host - Präferenz (zB Geruchssinn, gustation), Paarung, Reproduktion und Immunität. die Bedeutung dieser biologischen Prozesse gegeben, ist es wahrscheinlich, dass ihre Modulation auf einem genetischen oder pharmakologischen Ebene neue Möglichkeiten zur Vektor-Kontrolle bieten, einschließlich der Umgehung von Insektizidresistenz, und neue Werkzeuge für die breiter integrierte Ansätze zur Vektor-Management. Die Verwendung von funktionellen Genomik die Rolle von Genen zugrunde, diese intrinsische biologische Merkmale zur Beurteilung Identifizierung neuer Ziele ermöglichen und neue Einblicke in das, wie wir neue effektiv zu erstellen, eine wirksamere Kontrolle strateger Jahren. Wir beschreiben die Entwicklung und den Einsatz einer schnellen Injektionsverfahren für RNAi während der Verpuppung eines initiierenden. gambiae. Wir beobachten , dass Verpuppung Injektion eines RNAi - Trigger Beobachtung der resultierenden Phänotypen in einem frühen Stadium Erwachsenen ermöglicht, das heißt, früher nach dem Auflaufen als würde beobachtet werden , wenn Gen - Knockdown im Nachauflauf bei Erwachsenen initiiert wurden. Dieses Verfahren ermöglicht Knock-Down während der pupal Entwicklungsintervall beginnt und sich in adulten Stadien, so dass Knock-Down während pupal Entwicklung initiiert können im frühen Erwachsenen Hämolymphe zugänglichen Zelltypen bestehen und beeinflussen, sowie Zelltypen, die mehr Hämolymphe zugänglich während der Metamorphose als bei Erwachsenen, wie sensorischen Neuronen bei erwachsenen Anhängsel folgende Entstehung gefunden.

<table><tbody><tr><td>MEGAscript RNAi kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II injector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II foot switch</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glass micropipette puller</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>1371150</td><td>&amp;frac14; inch cut from tip to create a wider opening.</td></tr><tr><td>Whatman &amp;ldquo;thin&amp;rdquo; filter paper&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td></tr><tr><td>Western blot &amp;ldquo;thick&amp;rdquo; filter paper</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td></tr><tr><td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush (size 0)</td><td>Michael&amp;rsquo;s Art</td><td>10474940</td><td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td></tr><tr><td>Dissecting light microscope</td><td>&amp;nbsp;----&amp;nbsp;</td><td>-----</td><td>This can vary based on availability and user preference.</td></tr></tbody></table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

Pupal Injektion für die Gen - KD Ausbeuten optimale Ergebnisse , wenn die Einspritzung während der frühen Verpuppung durchgeführt wird, wenn Kutikula Bräunungsspiegel niedrig sind (Abbildung 1A, links, und 1B). Erhöhte Gerben und Verhärtung der Kutikula, in der Regel nach 24 Stunden, führt zu einer erhöhten pupal Tod nach der Injektion (Abbildung 1A, in der Mitte und rechts). Die Rate der pupal Entwicklung kann auf Insektarium Bedingungen und der Tierdichte variieren je 24,25; Daher ist es am besten Pigmentierung visuell zu beurteilen. Während des Einspritzvorgangs wird der Kapillarnadel in die dorsale Cuticula etwa 30 ° in der anterior posterior - Richtung (2A) in einem Winkel von eingefügt. Sobald die Nadel eingeführt wird und die dsRNA + 0,01% (w / v) FGD verzichtet wird, ist die Verteilung der Farbstoff evident ganzen Hämolymphe (Figure 2B). Beurteilung der erwachsenen Auflaufen für pupae mit 0,01% injiziert (w / v) FGD einer durchschnittlichen Rate von 70% ergab Auflaufen, im Vergleich zu 96,7% Entstehung von nicht-injizierten Kontrollen (3A). Zu beachten ist , teilweise Austritt aus der Puppenhülle wurde für eine große Anzahl von nicht-überlebenden Stechmücken (3B) beobachtet. Injizierten Tiere keine Verzögerungen bei der Entstehung Zeit aufweisen (Abbildung 4A) oder voreingenommen Auswirkungen auf beide Geschlechter (4B). Zusätzliche Beurteilung der Erwachsenen Überleben bis zum Tag 10 durchgeführt , nach dem Auswuchs zeigt keine offensichtliche Auswirkung auf Nachauflauf erwachsenen Überleben (4C). Validierung von KD Qualität wurde durch die melanotic Pseudotumor (dunkel pigmentierten Gewebe cluster) Phänotyp mit SRPN2 Knockdown 21,22 als positive Kontrolle für Zuschlags und die zugehörige beurteilt<html> Fehlen mit dsLacZ Injektion als Negativkontrolle assoziiert Phänotypen. Erwachsene Mücken, die entstanden wurden am Tag 8 nach der Injektion (Tag 6-7 Nachauflauf) erzielt. Melanotischen pseudo-Tumoren (5A und 5B) wurden durch die Kutikula von 93,5% der dsSRPN2 vs. beobachtet 0% der dsLacZ erwachsenen Mücken (6A). Cluster von dunkel melanisierten Gewebe wurden auf Präparation von Pigmentflecken (5C) identifiziert. Pseudo-Tumoren auf den Erwachsenen - Kutikula so früh wie Tag 3 nach dem Auswuchs und waren auch in einer Untergruppe von dsSRPN2 Hämolymphe und Darmgewebe sichtbar waren (Daten nicht gezeigt). Bei 5 Nacheinspritzung (frühen Erwachsenenstadium) verringerte sich deutlich SRPN2 Ebenen in dsSRPN2, aber nicht dsLacZ oder nicht injizierten Hämolymphe Protein Isolate beobachtet (6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Entwicklungs Inszenierung für pupal dsRNA Injektion Frühe pupal Injektion von dsRNA führt zu optimalen Überleben und die Progression in das Erwachsenenstadium.. Niedrige Konzentrationen von Kutikula Pigmentierung (A, links und B) innerhalb der ersten 0-24 hr folgenden Verpuppung beobachtet werden. Bräunung der pupal Kutikula vorhergehenden Einspritzung (A, Mitte und rechts) ergibt mäßige bis schlechte Überleben. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Fig . 2: Injektionsposition und Verteilung von farbstoffmarkierten dsRNA (A) Kapillarnadel Injektion von farbstoffmarkierten dsRNA in die dorsale Cuticula in einem Winkel von etwa 30 °, in Richtung von vorne nach hinten. (B) Der Farbstoff sichtbar ist in der pupal Hämolymphe verteilt. dsRNA Injektionsvolumen von 138 nl, mit 0,01% markiertem FGD (w / v). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Fig . 3: Post-Injektions erwachsenen Auflaufen (A) 70% pupae mit 0,01% FGD injiziert (w / v) erfolgreich heraus (n = 60), verglichen mit 96,7% nicht-injizierte Kontrollen (n = 60). Drei biologischen Replikate wurden durchgeführt. (B) Partielle Austritt aus dem pupal Fall wurde für eine große Anzahl von nicht-überlebenden Moskitos beobachtet. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Abbildung 4: Notrate, sex Bewertung und Erwachsenen Überleben (A) Vergleichbare Auflaufen Zeiten wurden folgende pupal Injektion mit 0,01% FGD beobachtet (24 hr = 80% und 48 hr = 20%), im Vergleich zu nicht-injizierten pupae (24. hr = 83% und 48 h = 17%). (B </strOng&gt;) Ungefähr gleich männlichen und weiblichen Erwachsenen Entstehung wurde für 0,01% REA injiziert pupae (weiblich = 48% und männlich = 52%) und nicht injizierten pupae (weiblich = 52% und männlich = 48%) beobachtet. (C) Überlebensanalyse zeigt , dass die Injektion mit 0,01% REA nicht erwachsenen Überleben auswirkt, bewertet bis zum Tag 10 nach dem Auswuchs. Die Ergebnisse stellen Daten aus drei unabhängigen Experimenten mit 0,01% FGD injiziert (n = 60) und nicht-injizierten (n = 60) pupae (gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Abbildung 5: Pseudo-Tumor - positive Kontroll Phänotyp spiegelt erfolgreiche Knockdown Pseudo-Tumoren beobachtet wurden auf der (A) Bauch- und (B) thorakalen Kutikula dsSRPN2 -injected, aber nicht dsLacZ -injected adult Stechmücken am Tag 8 nach der Injektion..(C) Eine stärkere Vergrößerung (400X) Bildgebung (a) der Kutikula und Präparation von Pigmentflecken (b) zeigt Cluster von dunkel melanisiert Zellen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Abbildung 6: Quantifizierung von pseudo-Tumorbildung und verminderte SRPN2 Proteinspiegel (A) Verpuppung Injektionen resultieren in pseudo-Tumorbildung in 93,5% der dsSRPN2 Erwachsenen (n = 21) im Vergleich zu 0% von dsLacZ Kontrollen (n = 19). . Ergebnisse Tag 8 nach der Injektion erhalten. (B) Western - Blot (links) zeigt verringerte SRPN2 Ebenen in dsSRPN2, aber nicht dsLacZ oder nicht injizierten Hämolymphe Protein Isolate (Tag 5 nach der Injektion). Die Ergebnisse basieren auf drei unabhängigen Experimenten. Anti-SRPN2 21 und anti-SRPN3 26 Antikörperverdünnungen verwendet wurden , waren 1: 1.000 und 1: 2.000, respectively. Ziege anti-ra5000: BBIT IgG-HRP (Produkt sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) wurde bei 1 verwendet. Alle Proteinspiegel wurden (rechts) durch Bandenintensität (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalisiert auf SRPN3 quantifiziert und statistisch verglichen mit ungepaarten t - Test. P &lt;0,05 *, P ≥0.05: ns (nicht signifikant). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

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RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

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Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K Aufrufe.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Serie: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Forschung

Genetik

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Die Injektion von dsRNA in Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Biologie

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Umwelt

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

Einsatz des GAL4-UAS-Systems für die funktionelle Genetik bei Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Mosquito Embryo Microinjection: A Technique to Deliver Exogenous DNA into Embryo Yolk of Anopheles Gambiae to Generate Germline Mutations

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, <a href="https://www.jove.com/v/62591">Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the delivery of gene drive construct into the embryo of Anopheles gambiae mosquito through embryo microinjection technique. This procedure allows for integration of&#160; delivered DNA construct, through homologous recombination, into the germline cells to generate transformed mosquito population.

Mikroinjektion von Mückenembryonen: Eine Technik zur Verabreichung exogener DNA in das Eigelb des Embryos von Anopheles gambiae, um Keimbahnmutationen zu erzeugen

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the ...

RNAi-Trigger Lieferung in

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Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,