We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. Synthese und Herstellung dsRNA <ol><li> Identifizieren Sie einen 200-800 bp Region Knockdown (um die entsprechenden dsRNA erzeugen) innerhalb des Gens von Interesse , die vorhergesagt wird , keine erkennbaren Nebeneffekte haben (zB keine Sequenzhomologie ≥18 bp innerhalb eines anderen Gens) und eine negative Kontrolle (zB eine heterologe Sequenz, die nicht vorhanden innerhalb der Zielinsekten Genom, wie beispielsweise die Escherichia coli lacZ - Gen (GenBank Gene ID: 945.006) ist. Alternativ dazu verwenden , um eine positive Kontrolle (beispielsweise , die einen leicht beobachtet Phänotyp wie SRPN2 21,22 ergibt , Gene GenBank ID. 1270169) die Sequenz der dsRNA Targeting SRPN2 wird in Michel et al definiert (2005) 21.. Hinweis: E-RNAi ist ein Open-Source bioinformatischen Ressource , die für die Identifizierung solcher Regionen und für den Prozess des Entwerfens Oligonukleotidprimer 23 nützlich ist. </li><li> Führen Sie standard PCR - Amplifikation (dh durchgeführt mit Taq DNA - Polymerase unter Verwendung von 30-35 Zyklen) eine genomische DNA oder cDNA - Matrize unter Verwendung von dsRNA Synthesemuster durch eine T7 - Promotorsequenz (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) und weiter mit dsRNA Zubereitung flankiert zu erhalten , und unter Verwendung eines kommerziellen in - vitro - Transkription - Kit nach den Anweisungen des Herstellers reinigen-up. Verwendung SRPN2 PCR Amplifikationsbedingungen und Primer Information wie in An et al. (2011) 22. </li><li> Quantifizierung gereinigter RNA Amplikon Ausbeuten durch ultraviolette Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 260 nm und passen auf die gewünschte Konzentration (beispielsweise 3 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l) in RNase-freiem Wasser. <ol><li> Für niedrige RNA-Konzentrationen zur Fehlerbehebung reduzieren Flüssigkeitsvolumen von Proben, die in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur oder durch Lyophilisieren Proben und Rekonstitution in kleineren Mengen von Wasser dreht. Die Zeit für die Proben Lyophilisierung erforderlich variiert in Abhängigkeitbei der ersten Probenvolumina und dsRNA-Konzentrationen. </li></ol></li><li> Überprüfen der Qualität und der Länge der dsRNA auf einem 2% Agarosegel, hergestellt mit 1x TBE oder TAE-Puffer und gefärbt mit Ethidiumbromid (EtBr), zusammen mit der Matrizen-DNA für die Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die dsRNA wird wandern langsamer als Template-DNA. Qualität und Länge kann durch Sicherstellen, gibt es keine nicht-spezifischen dsRNA Produkte und durch den Vergleich Produkte mit einem Standard-DNA-Marker bzw. bewertet werden. Hinweis: EtBr ein potenter mutagen und sollte entsprechend behandelt werden. Anmerkung: Bei einer dsRNA Konzentration von 3 ug / ul, 0,5 ul der Probe mehr als ausreichend ist für die Visualisierung auf der EtBr-gefärbten Agarosegel. </li><li> Speichern von dsRNA bei -20 ° C bis benötigt. Mehrere Frost / Tau-Zyklen kann dies zum Abbau verursachen, so dass Teilmengen sollten für große Mengen von dsRNA hergestellt werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie Fast Green FCF Dye (FGD) Schläuche <ol><li> Verdünnen Fast Green FCF Farbstoffvon Stammlösung (≥85% Farbstoffgehalt) auf 0,1% (v / v) (Arbeitslösung) in RNase-freiem Wasser. </li><li> Pipette 1 ul Farbstoff in den Boden eines 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Die Röhrchen in einem 65 ° C Heizblock für ca. 3 Stunden zu verdampfen Flüssigkeit, dann die Röhrchen bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten abkühlen, bevor Sie. Dieser trockene feste Farbstoff wird in dsRNA Resuspensionslösung wiederherzustellen. </li></ol> 3. Ziehen Injektionsnadeln <ol><li> Ziehen Borosilicatglas Nadeln einen beheizten Nadel Abzieher zu einem Spitzendurchmesser von 10 bis 30 &amp; mgr; m verwendet. Ziehen Sie Einstellungen entsprechen: Abgleich der Heizung nicht. 1 = 100, Abgleich der Heizung nicht. 2 = 70. </li><li> Um eine Beschädigung der feinen Spitze der Nadel, wenn sich alle gezogen Nadeln horizontal in einer Petrischale auf einem Streifen von Form Kitt vermeiden. Hinweis: Weitere Informationen zur Kapillarnadel Methoden ziehen können in weiteren Einzelheiten in der Malaria-Forschung und Referenz-Reagenz Resource Center M findenR4 Handbuch 24. </li></ol> 4. Bereiten Sie Injection-Station <ol><li> Sammeln Sie Materialien benötigt: Glas Mikrokapillare Nadeln feine Spitze gezogen, Mikroinjektors, dünnes Filterpapier und dickes Filterpapier, Petrischalen, Transferpipetten, Pinsel und sezieren Lichtmikroskop. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektors wie in der Anleitung beschrieben Mikroinjektors und setzen Injektionsvolumen auf das gewünschte Volumen pro Impuls (zB maximal 69 nl pro Puls). </li><li> Auf einer Plattform , die unter dem Mikroskop zu manövrieren ist einfach (zB flache Seite eines Styropor Röhrchenrack), stapeln die beiden Filterpapierblätter mit dem dünnen Filterpapier auf, und befestigen Sie ihn mit Klebeband an den Rändern. </li><li> Resuspendieren 10 ul jeder dsRNA-Lösung in getrennten farbigen Farbstoff Rohre, und auf Eis. </li></ol> 5. Sammeln Pupae zur Injektion <ol><li> Füllen Sie eine kleine 60 mm x 15 mm Petrischale mit 10 ml VE-Wasser und sammeln ~ 50 bleich Puppen (during der ersten 24 Stunden nach der Verpuppung) von einem Insektarium Schale eine Einweg-Plastiktransferpipette. </li><li> Entfernen Sie alle Puppen, die mittel- bis dunkel Kutikula Bräunung haben. Hinweis: Sobald die Nagelhaut zu bräunen beginnt, wird es schwieriger, die Kutikula und Injektion führt zu viel höheren Letalität zu durchdringen. </li></ol> 6. dsRNA Injection <ol><li> Unter dem Binokular, brechen die distale Spitze der Injektionsnadel mit einem Paar von feinen Pinzette ab. </li><li> Bereiten Sie die Injektionsnadel durch die Nadel mit Mineralöl Verfüllung (eine Spritze mit einem 3-Zoll, 30-Gauge-Nadel) und überschüssiges Öl mit dem Austreiben Mikroinjektor. </li><li> Vordere Injektionsnadel mit einer maximalen Menge an dsRNA, füllen und ein Impuls unter dem Mikroskop auswerfen die Abgabe von Flüssigkeit zu gewährleisten. Für den Fall, dass keine Flüssigkeit aufgenommen und / oder vertrieben, überprüfen Sie die distale Spitze der Nadel für jede Verstopfung und sicherzustellen, dass die Nadel fest in der microinjecto gesichert istr. </li><li> Wählen Sie 1-3 pupae, und legen Sie sie auf das Filterpapier. </li><li> Mit dem Pinsel, positionieren Sie den Puppen auf dem Filterpapier mit dorsalen Kutikula zugänglich, und verwenden Sie den Pinsel auf Filterpapier zu schieben und von überschüssigem Wasser zu absorbieren. </li><li> Stabilisieren Sie die Puppe mit der Spitze des Pinsels, und legen Sie die Nadel in die dorsale Häutchen zwischen dem Thorax und Abdomen in einem Winkel von etwa 30 ° in Bezug auf die dorsale Oberfläche der Puppe. Die Injektion sollte gegen die hintere Ende der Puppe und der Nadel gerichtet werden sollte, in einer anterioren-to-posterior-Richtung bewegt werden. </li><li> Injizieren zwei Impulse (69 nl pro Impuls) von 3 ug / ul dsRNA-Lösung in die Hämolymphe, und prüfen, ob die Verteilung der Farbe im ganzen Körper. Wenn keine Farbe erkannt wird, verschieben sich die Injektionsnadel Position leicht die Spitze von Verstopfung zu beseitigen und Flüssigkeitsabgabe wiederholen. </li><li> Verwenden Sie den benetzten Pinsel vorsichtig Puppe aus der Nadel in das Wasser für die Kultivierung zu bewegen. Ter Pupa zum Pinsel auf leichten Kontakt bleiben sollte. </li></ol> 7. Post-Injektionsbedingungen <ol><li> Legen Sie Petrischale mit injizierten Puppen in einem Moskitokäfig mit geeigneten Luftstrom (zB Mesh - Käfig oder Behälter mit Mesh - Deckel). Pupal Aufzuchtbedingungen sollten konsequent bei 27 ± 3 ° C Temperatur, 75 ± 5% Luftfeuchtigkeit bleiben und sein unter einem Licht: Dunkel-Zyklus von 16: 8 Stunden. </li><li> Bereiten Sie eine 10% (w / v) Glucoselösung, und legen Sie eine Lösung gesättigten Wattebausch auf dem Moskitokäfig für Erwachsene Fütterung Netz. </li></ol> 8. Beurteilen Sturz <ol><li> In gewünschten Zeitpunkt (e), zu bewerten Phänotypen in experimentellen dsRNA injiziert Insekten, im Vergleich zu Kontrollen. <ol><li> Beurteilen dsSRPN2 und dsLacZ Insekten täglich von Erwachsenen Kühlen hinunter für ca. 2-3 min bei -20 ° C, um sie zu einer kalten Platte zu übertragen , auf 2 ° C und Identifizieren jedes pseudo-Tumorbildung durch Verwendung eines Präpariermikroskops bei 15XVergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Nach Einschätzung Rückkehr Erwachsene Insektarium Bedingungen (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% Luftfeuchtigkeit). Hinweis: Die Versuchs- und Kontroll dsRNAs in diesem Protokoll verwendet werden , sind dsSRPN2 und dsLacZ sind. Es gibt viele Möglichkeiten für Kontrollen; Es wird jedoch vorgeschlagen , dass eine positive Kontrolle für die Phänotyp und / oder Expression leicht sichtbar gemacht wird (zB durch Sezieren Mikroskopie) und / oder quantifiziert [zB quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Western Blot] verwendet werden soll wenn diese Technik zu erlernen. SRPN2 Protein und Transkript Quantifizierung über Western - Blot und qRT-PCR sind jeweils in Michel et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

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Aktuelle Methoden zur beinhalten in Stechmücken nicht-transgenen RNAi induzieren direkte Injektion von dsRNA in die Erwachsenen Hämocoel 12,13 oder Larvenfraß von RNAi - Trigger-beschichtete Nanopartikel 14-17 oder Mikroalge-basierte dsRNA - Moleküle 18. Targeting adulten Stechmücke, während extrem wertvoll, kann eine große Anzahl von Genen ausschließen, die während der früheren Entwicklungsperioden funktionieren. Preissturz durch Larvenfraß ausgelöst inkonsistent Phänotypen während der erwachsenen Stadium ergeben darauf zurückzuführen, zum Teil auf das Potential der variablen Protein Persistenz durch die Verpuppung. Daher Einführung eines zusätzlichen Verfahren, das ein Mittel liefert speziell an Initiieren RNAi während pupal Entwicklung ausgerichtet ist, um mehr vollständig Genfunktionen während der Pre-adult Entwicklungsstadien sowie verbesserte Fähigkeiten zur Bewertung der Genfunktion während adulte Stadien beurteilt. Wie bei Knock-Down-Ansatz basiert auf dsRNA Injektion oder Ausdruck, der Persistenz der Knock-Downkann nicht vorhergesagt werden. Daher Transkript oder Protein-Ebene für Gen von Interesse während der Entwicklungszeiten von Interesse bewertet werden sollten. Obwohl wir eine Fortsetzung beobachten von Proteinspiegel am Tag 5 nach der Injektion für SRPN2 in SRPN2 dsRNA-injizierten Tieren vermindert, Faktoren wie Proteinumsatz und Halbwertszeit kann für verschiedene Ziele unterscheiden. Es ist entscheidend, aber auch, um sicherzustellen, dass die dsRNA zur Injektion verwendet werden gut konzentriert ist, und erscheint auf einem Agarosegel intakt. Wir empfehlen Experimentatoren diese Faktoren neu bewerten, wenn Zuschlags Ergebnisse nicht ausreichend sind, und die jeweiligen Konzentrationen von dsRNA müssen empirisch für spezifische Gen-Targets getestet werden. Wir beschreiben ein Verfahren zur Initiierung der RNA - Interferenz während der Verpuppung von An. gambiae Entwicklung. Dieses Verfahren beruht auf der Einführung über Mikroinjektion von dsRNA direkt in die Hämocoel der frühen Puppen und ermöglicht die Beurteilung von Injektionsqualität durch dieVerwendung von Farbstoff-markierten dsRNA. Die Fähigkeit Injektionsqualität zu visualisieren stellt eine entscheidende Verbesserung für die Gewährleistung erfolgreichen Zuschlags und stellt einen Aspekt der Injektion basierende Knock-Down, der nicht in den meisten bisher berichteten dsRNA-basierte Protokolle Fokussierung auf das Erwachsenenstadium berücksichtigt hat. Durch die Ausrichtung der Puppe zu Beginn dieser Entwicklungszeit, Gene, die eine Rolle in dieser kritischen Entwicklungsintervall spielen könnte, oder während der frühen Stadien des Erwachsenenalters können funktionell ausgewertet werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren dsRNA Lieferung an Zellen ermöglichen, und Etablierung von RNA-Interferenz in Zellen, die während der Metamorphose zugänglich sind, aber weniger zugänglich in voll ausgebildeten erwachsenen Mücken. Eine kürzlich Microarray - Analyse von Harker et al. (2012) identifiziert 560 ein. gambiae - Transkripte , die während verschiedene Entwicklungsstadien von mindestens 4-fach hochreguliert oder herunterreguliert wurden, angefangen vom Embryo zum Erwachsenen. Von den 560 Transkripte identifiziert, ein Satz von 309 wurde hochreguliert während pupal Entwicklung 27. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es viele Anforderungen für die differentielle Genexpression gesamten Moskito Entwicklung, einschließlich derer, die im Puppenstadium eintreten, ein Intervall, in dem der Organismus Metamorphose unterzogen wird. In vielen Insektenarten, darunter ein. gambiae, in den Prozessen beteiligten Gene wie Entwicklung (dh pupal kutikulären und Chitin-bindende Proteine) 27-31 und Immunantwort (dh Toll - Rezeptor-ähnliche Proteine) 27,32-34 werden während der Verpuppung stark exprimiert. Sobald ein voll ausgebildet Erwachsenen entstanden ist, wird es die Genexpression in Reaktion fortgesetzt ökologischen und physiologischen 35 ändert. Bemerkenswert ist , während der frühen Entwicklung im Erwachsenenalter gibt es eine Erhöhung der Expression von Entwicklungsgenen (dh erwachsene kutikulären und sarcoplasmic Proteine) 36, sowie andere Schlüsselgene (dh </em&gt;, Sperma spezifisches Protein und Cytochrom - P450 - Stoffwechsel - Enzyme) 27,36. Die positive Kontrolle bei der Entwicklung dieses Protokolls SRPN2, ist ein An. gambiae Serin - Protease - Inhibitor (Serpin). SRPN2 spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulierung des Insekten Melanisierung, ein breites Spektrum angeborene Immunantwort in Insekten 21,22. Preissturz von SRPN2 bei erwachsenen Mücken Ergebnisse in pseudo-Tumorbildung 21,22, einem Phänotyp , die leicht durch die Verwendung von Lichtmikroskopie beobachtet wird. Da dieser deutlichen Phänotyp kann leicht in lebenden Insekten erzielt werden, haben wir SRPN2 für die anfängliche Verpuppung RNAi - Injektionen. Zusätzlich wird SRPN2 während aller Entwicklungsstadien 37 ausgedrückt, wodurch ein gutes Ziel für die Verpuppung RNAi Injektion und Beurteilung der Funktion im frühen Erwachsenenbereitstellt. Wir zeigen, dass die Methode, die wir entwickelt haben, ist in der Lage zu induzieren ähnlich Erwachsenen melanotischen pseud<html> o-Tumorbildung als Folge der dsRNA Einspritzungen während der Verpuppung der Entwicklung durchgeführt. In diesem Protokoll zu entwickeln, haben wir , dass die Injektion während der frühen Entwicklung pupal beobachtet (dh die ersten 24 Stunden nach der Larven-pupal molt) für den Erhalt der optimalen Erwachsenen Entstehung entscheidend ist. Für den Fall, dass eine schlechte Auflaufen Nacheinspritzung erreicht wird, empfehlen wir Staging-Larven mit größerer Genauigkeit, Puppen mit weniger umfangreichen Cuticula Härtung zu erhalten und frühen Puppenstadium Injektions gewährleisten erreicht. Darüber hinaus kann in einem optimalen Notraten und zunehmender Vergrößerung während der Injektion eine Beschädigung der Kutikula Ergebnisse zu minimieren helfen sicherzustellen, dass nur der vorgesehene Bereich des Tieres durchstochen wird. Wenn die Nadel in die ventrale Kutikula Punktion durch sollte Pooling von farbstoffmarkierten Flüssigkeit auf der Außenseite der Puppe offensichtlich sein, oder das Filterpapier zu sättigen. Es wird dringend jede pupae wegzuwerfen empfohlen, die mehr als eine Kutikula Einstich aufweisen. jove_content &quot;&gt; Mit den umfangreichen Erfahrungen von vielen Labors mit der Leistung der Erwachsenen Moskito Injektionen können zuvor identifizierten Mikroinjektions Ansätze mit einfachen Protokoll Änderungen in pupal RNAi-Experimente Einsatz angepasst werden. Insgesamt ist das Ziel dieser Methode ist es, Forscher, um die Fähigkeit zu erweitern Sie den Zeitrahmen , in denen genetische Analysen umkehren durchgeführt werden, weiter ermöglichen , Forschung, die Entwicklung neuer Kontrollstrategien unterstützen wird. Interessant ist , dass Experimente in anderen Arten, wie Rhodnius prolixus und Spodoptera frugiperda, zeigen , dass die Gen - Silencing - Effekte sind in der Regel viel zu sein größer , wenn während der Pre-adulte Stadien 38,39. während aller Phasen der Entwicklung RNAi-vermittelten Knock-Down unterliegt Überlegungen in Bezug auf die Schnelligkeit und Ausdauer von Gen - Silencing, und die Stabilität der kodierten Proteine ​​durch gezielte Gene. die ideale RNAi - Ziel initiiert Gene sind in der Regel diejenigen, die kodieren für ein protei seinn oder RNA , die hat eine kurze Halbwertszeit und eine hohe Fluktuationsrate 11,40. Während transgene RNAi Strategien auch Überlegungen zur Adresse verwendet werden kann , in Bezug auf Schnelligkeit und Persistenz von RNAi bei pre-adulte Stadien weisen transgene Techniken viele Nachteile (beispielsweise Zeit für die Erzeugung von transgenen Linien erforderlich, experimental Zeitrahmen für Moskito Paarungen Insekten zu erzeugen mit geregeltem dsRNA-Expression und Wartung von transgenen Aktien). Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine einfachere und schnellere Methode für die Einleitung Knock-Down während pupal Entwicklung und in Zelltypen, die während der Metamorphose zugänglich und sind aber weniger zugänglich sind bei Erwachsenen. Die Verwendung von Farbstoff-markierten dsRNA Suspensionen ermöglicht eine einfache Beurteilung der Injektion Erfolg und die Verbreitung von eingeführten Materials innerhalb pupae. Unsere Daten auf den Beginn der Tumorbildung in pupal injizierten Erwachsene, wie Erwachsene zu injizierenden Tieren verglichen, steht im Einklang mit initiation von RNAi-vermittelten Knockdown während der Verpuppung. Mit unserem G3 Moskito-Linie und unter unseren Insektarium Bedingungen haben wir die Erwachsenen melanotischen Pseudotumorbildung so früh wie 10 Tage nach der Injektion von Erwachsenen im Nachauflauf injiziert drei bis fünf Tagen zu beobachten. Zu Beginn des Jahres pupal stufigen Einspritzung durchgeführt wird , beobachten wir sichtbar melanotischen Pseudotumorbildung bereits fünf Tage nach der Injektion (dh drei bis vier Tage nach der Entstehung). Diese Daten implizieren , dass diese Methode ermöglicht die Einleitung von Knock-Down während einer bisher untersuchten Entwicklungszeit (dh pupal Entwicklung). Unsere Farbstoffmarkierungsverfahren kann auch als nützlich erweisen, für die Entwicklung neuer larvalen Injektionsprotokolle, aufgrund der durchscheinenden Natur der Kutikula bei allen Larvenstadien. Während die Steuerung in dieser Studie verwendet Progression in erwachsenen Stadium erfordert einen Zuschlags Phänotyp anzuzeigen, um zukünftige Experimente Verpuppung spezifischen Phänotypen Beurteilung nach der Injektion von frühen pupae liefertwertvolle Einblicke, die Erweiterung dieser Methode in zusätzliche Entwicklungszeiten wie spät pupal Entwicklung. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren einen wertvollen RNAi-Protokoll für Verpuppung Initiierung von RNAi-vermittelten Knock-Down und erweitert die funktionelle Genom Werkzeuge zur Verfügung, für die Verwendung innerhalb des Vektors Insektenforschungsgemeinschaft.

Malaria ist eine durch Moskitos übertragene Infektionskrankheit, die jedes Jahr viele Millionen von Menschen betroffen sind. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtet , dass im Jahr 2013 etwa 584.000 Todesfälle aufgrund von Malaria da waren, 78 Prozent davon 1 bei Kindern unter dem Alter von fünf Jahren aufgetreten. Die Erreger , die menschliche Malaria verursachen , sind apicomplexan Parasiten der Gattung Plasmodium und zwischen ihren menschlichen Wirten von weiblichen Anopheles - Mücken übertragen. Die Übertragung erfolgt, wenn die Mücke eine Blutmahlzeit von einem Individuum nimmt die infiziert wird und dann Ablagerungen infektiösen Parasiten in einem nicht infizierten Individuum in einer nachfolgenden Blutmehl. Innerhalb der Gattung Anopheles, ist Anopheles gambiae die Spezies mit der größten vektorielle Kapazität und ist der prominenteste Malaria Vektor in Afrika südlich der Sahara 1-3. Derzeit setzt die Steuerung mit Moskito-Vektor durch den Einsatz von Insektiziden zu be die wichtigsten Verfahren eingesetzt, um die Belastung der menschlichen Malaria zu reduzieren. Obwohl die Verwendung von Insektiziden seit den 1960er Jahren als äußerst erfolgreich erwiesen hat, hat sich der Anstieg der Insektizidresistenz eine Notwendigkeit für die Entwicklung neuer Insektizide und alternative Kontrollstrategien 4-7 angetrieben. Im Jahr 2010 zeigte eine insgesamt 49 von 63 Ländern der WHO berichtet das Auftreten von Insektizid - Resistenz der Malariavektoren 1. Darüber hinaus berichtet der IR - Mapper - Tool, das Peer-Review - Literatur nutzt Widerstandsdaten in Afrotropis Regionen zu bewerten, dass es zwischen 2001 und 2012 46% und 27% Anstieg der Resistenz gegen Pyrethroide und dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) wurden jeweils 7. RNA - Interferenz (RNAi) wurde in den frühen 1990er Jahren als eine Technik identifiziert , die Gene in der Pflanze Petunia 8,9 und in dem Pilz eingesetzt werden könnten Neurospora crassa 9,10 zu inaktivieren. Kurz danach,1998 RNAi wurde zuerst 9,11 als Mittel zur Verringerung der Genexpression in einem Tiermodell durch Einführung von Antisense oder Doppelstrang - RNA (dsRNA) über Injektion oder Fütterungsmethoden in Caenorhabditis elegans dokumentiert. Seit seiner Entdeckung hat RNAi die Ausübung der funktionellen Genomik revolutioniert, indem es den Forschern erlaubt reversen Genetik zu nutzen, um schnell die funktionelle Rolle von Genen von Interesse über eine hochselektive posttranskriptionales Gen-Silencing-Mechanismus zu untersuchen. In einigen Organismen, wie Drosophila melanogaster, die Verwendung von transgenen Organismen , die interfering RNA - Konstrukte exprimieren hat für Knock-Down (KD) weitgehend erfolgreich. Obwohl die Verwendung von Transgenen in An. gambiae für RNAi verwendet wurde , und kann nützlich für große Bildschirme beweisen, die Erzeugung von transgenen Moskitos Stämme ist sowohl arbeits- und zeitintensiv, in der Regel zwei bis drei Monate unter der Identifizierung eines Gens von Interesse für die Generati zu gehenauf einer entsprechenden transgenen Lager 12. Derzeit ist die primäre Methode der Gen - KD in An. gambiae ist durch Injektion in die Hämolymphe, während der erwachsenen Stadium von dsRNA spezifisch für ein gegebenes Gen 12,13. Dieser Vorgang dauert typischerweise etwa einen Monat nach Identifizierung eines Gens von Interesse zu Beurteilung des Gens KD zu gehen, was beweist , 12 viel schneller als transgene Methoden. Methoden für die Larvenstadium RNAi wurden kürzlich in einem etablierten. gambiae und Aedes aegypti über Nanopartikel 14-17 oder durch die orale Verabreichung von Mikroalgen-basierte dsRNA - Moleküle 18 Fütterung und bietet Möglichkeiten während der frühen Stadien der Entwicklung funktioneller Genomanalyse durchzuführen. In Direkteinspritzung, Fütterung, und zur Freisetzung von Nanopartikeln Verfahren wird dsRNA durch das Enzym Dicer in 21 bis 25 Nukleotide lange &quot;short interfering RNAs&quot; (siRNAs) 19,20 autonom durch die Zielzelle und gespalten aufgenommen. Diese siRNAs sind dann incorporated in den RNA-induzierten Silencing - Komplex (RISC), von dem ein Strang abgelegt wird, das RNA-gebundene RISC - Komplex erlaubt die Ziel mRNA zu binden und zu spalten und dadurch das Niveau zu reduzieren und seine Übersetzung 19,20 hemmen. Viele wesentlichen Merkmale der grundlegenden Moskito Biologie modulieren vektorielle Kapazität, einschließlich Host - Präferenz (zB Geruchssinn, gustation), Paarung, Reproduktion und Immunität. die Bedeutung dieser biologischen Prozesse gegeben, ist es wahrscheinlich, dass ihre Modulation auf einem genetischen oder pharmakologischen Ebene neue Möglichkeiten zur Vektor-Kontrolle bieten, einschließlich der Umgehung von Insektizidresistenz, und neue Werkzeuge für die breiter integrierte Ansätze zur Vektor-Management. Die Verwendung von funktionellen Genomik die Rolle von Genen zugrunde, diese intrinsische biologische Merkmale zur Beurteilung Identifizierung neuer Ziele ermöglichen und neue Einblicke in das, wie wir neue effektiv zu erstellen, eine wirksamere Kontrolle strateger Jahren. Wir beschreiben die Entwicklung und den Einsatz einer schnellen Injektionsverfahren für RNAi während der Verpuppung eines initiierenden. gambiae. Wir beobachten , dass Verpuppung Injektion eines RNAi - Trigger Beobachtung der resultierenden Phänotypen in einem frühen Stadium Erwachsenen ermöglicht, das heißt, früher nach dem Auflaufen als würde beobachtet werden , wenn Gen - Knockdown im Nachauflauf bei Erwachsenen initiiert wurden. Dieses Verfahren ermöglicht Knock-Down während der pupal Entwicklungsintervall beginnt und sich in adulten Stadien, so dass Knock-Down während pupal Entwicklung initiiert können im frühen Erwachsenen Hämolymphe zugänglichen Zelltypen bestehen und beeinflussen, sowie Zelltypen, die mehr Hämolymphe zugänglich während der Metamorphose als bei Erwachsenen, wie sensorischen Neuronen bei erwachsenen Anhängsel folgende Entstehung gefunden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II foot switch</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Narishigne</td>
			<td>PB-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1371150</td>
			<td>&#188; inch cut from tip to create a wider opening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman &#8220;thin&#8221; filter paper&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot &#8220;thick&#8221; filter paper</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>107-3931</td>
			<td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (size 0)</td>
			<td>Michael&#8217;s Art</td>
			<td>10474940</td>
			<td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting light microscope</td>
			<td>&#160;----&#160;</td>
			<td>-----</td>
			<td>This can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

Pupal Injektion für die Gen - KD Ausbeuten optimale Ergebnisse , wenn die Einspritzung während der frühen Verpuppung durchgeführt wird, wenn Kutikula Bräunungsspiegel niedrig sind (Abbildung 1A, links, und 1B). Erhöhte Gerben und Verhärtung der Kutikula, in der Regel nach 24 Stunden, führt zu einer erhöhten pupal Tod nach der Injektion (Abbildung 1A, in der Mitte und rechts). Die Rate der pupal Entwicklung kann auf Insektarium Bedingungen und der Tierdichte variieren je 24,25; Daher ist es am besten Pigmentierung visuell zu beurteilen. Während des Einspritzvorgangs wird der Kapillarnadel in die dorsale Cuticula etwa 30 ° in der anterior posterior - Richtung (2A) in einem Winkel von eingefügt. Sobald die Nadel eingeführt wird und die dsRNA + 0,01% (w / v) FGD verzichtet wird, ist die Verteilung der Farbstoff evident ganzen Hämolymphe (Figure 2B). Beurteilung der erwachsenen Auflaufen für pupae mit 0,01% injiziert (w / v) FGD einer durchschnittlichen Rate von 70% ergab Auflaufen, im Vergleich zu 96,7% Entstehung von nicht-injizierten Kontrollen (3A). Zu beachten ist , teilweise Austritt aus der Puppenhülle wurde für eine große Anzahl von nicht-überlebenden Stechmücken (3B) beobachtet. Injizierten Tiere keine Verzögerungen bei der Entstehung Zeit aufweisen (Abbildung 4A) oder voreingenommen Auswirkungen auf beide Geschlechter (4B). Zusätzliche Beurteilung der Erwachsenen Überleben bis zum Tag 10 durchgeführt , nach dem Auswuchs zeigt keine offensichtliche Auswirkung auf Nachauflauf erwachsenen Überleben (4C). Validierung von KD Qualität wurde durch die melanotic Pseudotumor (dunkel pigmentierten Gewebe cluster) Phänotyp mit SRPN2 Knockdown 21,22 als positive Kontrolle für Zuschlags und die zugehörige beurteilt<html> Fehlen mit dsLacZ Injektion als Negativkontrolle assoziiert Phänotypen. Erwachsene Mücken, die entstanden wurden am Tag 8 nach der Injektion (Tag 6-7 Nachauflauf) erzielt. Melanotischen pseudo-Tumoren (5A und 5B) wurden durch die Kutikula von 93,5% der dsSRPN2 vs. beobachtet 0% der dsLacZ erwachsenen Mücken (6A). Cluster von dunkel melanisierten Gewebe wurden auf Präparation von Pigmentflecken (5C) identifiziert. Pseudo-Tumoren auf den Erwachsenen - Kutikula so früh wie Tag 3 nach dem Auswuchs und waren auch in einer Untergruppe von dsSRPN2 Hämolymphe und Darmgewebe sichtbar waren (Daten nicht gezeigt). Bei 5 Nacheinspritzung (frühen Erwachsenenstadium) verringerte sich deutlich SRPN2 Ebenen in dsSRPN2, aber nicht dsLacZ oder nicht injizierten Hämolymphe Protein Isolate beobachtet (6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Entwicklungs Inszenierung für pupal dsRNA Injektion Frühe pupal Injektion von dsRNA führt zu optimalen Überleben und die Progression in das Erwachsenenstadium.. Niedrige Konzentrationen von Kutikula Pigmentierung (A, links und B) innerhalb der ersten 0-24 hr folgenden Verpuppung beobachtet werden. Bräunung der pupal Kutikula vorhergehenden Einspritzung (A, Mitte und rechts) ergibt mäßige bis schlechte Überleben. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Fig . 2: Injektionsposition und Verteilung von farbstoffmarkierten dsRNA (A) Kapillarnadel Injektion von farbstoffmarkierten dsRNA in die dorsale Cuticula in einem Winkel von etwa 30 °, in Richtung von vorne nach hinten. (B) Der Farbstoff sichtbar ist in der pupal Hämolymphe verteilt. dsRNA Injektionsvolumen von 138 nl, mit 0,01% markiertem FGD (w / v). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Fig . 3: Post-Injektions erwachsenen Auflaufen (A) 70% pupae mit 0,01% FGD injiziert (w / v) erfolgreich heraus (n = 60), verglichen mit 96,7% nicht-injizierte Kontrollen (n = 60). Drei biologischen Replikate wurden durchgeführt. (B) Partielle Austritt aus dem pupal Fall wurde für eine große Anzahl von nicht-überlebenden Moskitos beobachtet. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Abbildung 4: Notrate, sex Bewertung und Erwachsenen Überleben (A) Vergleichbare Auflaufen Zeiten wurden folgende pupal Injektion mit 0,01% FGD beobachtet (24 hr = 80% und 48 hr = 20%), im Vergleich zu nicht-injizierten pupae (24. hr = 83% und 48 h = 17%). (B </strOng&gt;) Ungefähr gleich männlichen und weiblichen Erwachsenen Entstehung wurde für 0,01% REA injiziert pupae (weiblich = 48% und männlich = 52%) und nicht injizierten pupae (weiblich = 52% und männlich = 48%) beobachtet. (C) Überlebensanalyse zeigt , dass die Injektion mit 0,01% REA nicht erwachsenen Überleben auswirkt, bewertet bis zum Tag 10 nach dem Auswuchs. Die Ergebnisse stellen Daten aus drei unabhängigen Experimenten mit 0,01% FGD injiziert (n = 60) und nicht-injizierten (n = 60) pupae (gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Abbildung 5: Pseudo-Tumor - positive Kontroll Phänotyp spiegelt erfolgreiche Knockdown Pseudo-Tumoren beobachtet wurden auf der (A) Bauch- und (B) thorakalen Kutikula dsSRPN2 -injected, aber nicht dsLacZ -injected adult Stechmücken am Tag 8 nach der Injektion..(C) Eine stärkere Vergrößerung (400X) Bildgebung (a) der Kutikula und Präparation von Pigmentflecken (b) zeigt Cluster von dunkel melanisiert Zellen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Abbildung 6: Quantifizierung von pseudo-Tumorbildung und verminderte SRPN2 Proteinspiegel (A) Verpuppung Injektionen resultieren in pseudo-Tumorbildung in 93,5% der dsSRPN2 Erwachsenen (n = 21) im Vergleich zu 0% von dsLacZ Kontrollen (n = 19). . Ergebnisse Tag 8 nach der Injektion erhalten. (B) Western - Blot (links) zeigt verringerte SRPN2 Ebenen in dsSRPN2, aber nicht dsLacZ oder nicht injizierten Hämolymphe Protein Isolate (Tag 5 nach der Injektion). Die Ergebnisse basieren auf drei unabhängigen Experimenten. Anti-SRPN2 21 und anti-SRPN3 26 Antikörperverdünnungen verwendet wurden , waren 1: 1.000 und 1: 2.000, respectively. Ziege anti-ra5000: BBIT IgG-HRP (Produkt sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) wurde bei 1 verwendet. Alle Proteinspiegel wurden (rechts) durch Bandenintensität (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalisiert auf SRPN3 quantifiziert und statistisch verglichen mit ungepaarten t - Test. P &lt;0,05 *, P ≥0.05: ns (nicht signifikant). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

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RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

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RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

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Serie: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

Lokalisierte RNAi und ektopische Genexpression in der Blutegel

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...