We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. تحضير وإعداد الرنا المزدوج الجديلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف المنطقة ضربة قاضية 200-800 سنة مضت (لتوليد الرنا المزدوج الجديلة المقابلة) داخل الجين الذي يتوقع أن يكون لا يمكن تحديدها آثار خارج الهدف (على سبيل المثال، لا تسلسل تناظر ≥18 بي بي داخل الجين آخر) والسيطرة السلبية (على سبيل المثال ، سلسلة مغاير ليست موجودة في الجينوم الحشرة المستهدفة، مثل الجين كولاي lacZ (بنك الجينات معرف جين: 945006). بدلا من ذلك، استخدام تحكم إيجابية (على سبيل المثال، والتي ينتج النمط الظاهري ملاحظتها بسهولة، مثل SRPN2 21،22 ، بنك الجينات الجينات الرقم: 1270169) ويعرف تسلسل استهداف SRPN2 الرنا المزدوج الجديلة في ميشيل وآخرون (2005) 21. ملاحظة: E-رني موردا بيوينفورمتيك مفتوح المصدر يمكن أن يكون مفيدا لتحديد هذه المناطق ولعملية تصميم الاشعال النوكليوتيد 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الصورةtandard PCR التضخيم (أي يؤديها مع طق الحمض النووي بوليميريز تستخدم 30-35 دورات) باستخدام الحمض النووي الجيني أو قالب كدنا] للحصول على الرنا المزدوج الجديلة قالب التوليف يحيط بها تسلسل T7 المروج (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) والمضي قدما في إعداد الرنا المزدوج الجديلة و تنظيف باستخدام المختبر في عدة نسخ التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام SRPN2 PCR الظروف التضخيم والمعلومات التمهيدي كما وردت في أحد وآخرون (2011) 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عوائد RNA amplicon تنقيتها من التحليل الطيفي امتصاص الاشعة فوق البنفسجية في الطول الموجي من 260 نانومتر، والتكيف مع التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 3 ميكروغرام / ميكرولتر) في ريبونوكلياز خالية من المياه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستكشاف تركيزات منخفضة RNA، والحد من حجم السائل عن طريق الدوران عينات عليها في جهاز للطرد المركزي فراغ في درجة حرارة الغرفة أو lyophilizing العينات وإعادة تشكيل في حجم أصغر من المياه. الوقت اللازم لعينة تجفيد سوف تختلف تبعاعلى وحدات تخزين عينة أولية وتركيزات الرنا المزدوج الجديلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من جودة وطول الرنا المزدوج الجديلة على هلام الاغاروز 2٪ أعدت مع 1X TBE أو تاي العازلة وملطخة بروميد إيثيديوم (EtBr)، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي القالب المستخدم للتفاعل النسخ. فإن الرنا المزدوج الجديلة الهجرة بصورة أبطأ من الحمض النووي القالب. جودة وطول يمكن تقييمها من خلال ضمان عدم وجود منتجات الرنا المزدوج الجديلة غير محددة وبمقارنة المنتجات مع علامة الحمض النووي القياسية، على التوالي. ملاحظة: EtBr هو المغير قوية، وينبغي أن يتم التعامل معها وفقا لذلك. ملاحظة: عند تركيز الرنا المزدوج الجديلة من 3 ميكروغرام / ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر من العينة هي أكثر من كافية لتصور على هلام الاغاروز EtBr-الملون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. قد يسبب عدة دورات تجميد / الذوبان التدهور، لذلك يجب أن تكون على استعداد قسامات لكميات كبيرة من الرنا المزدوج الجديلة. </li></ol> 2. إعداد سريع الخضراء FCF صبغ (FGD) أنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع سريع الخضراء FCF صبغمن المحلول (≥85٪ محتوى الصبغة) إلى 0.1٪ (ت / ت) (الحل العمل) في ريبونوكلياز خالية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 ميكرولتر من صبغ في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب مكان في كتلة الحرارة 65 درجة مئوية لمدة حوالي 3 ساعات حتى تتبخر السوائل، ثم أنابيب مكان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل، لتبرد قبل استخدام. وهذه الصبغة صلبة جافة إعادة تكوين في الرنا المزدوج الجديلة الحل إعادة تعليق. </li></ol> 3. إبر سحب حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبر الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب إبرة ساخنة لقطر غيض من 10-30 ميكرون. سحب إعدادات تتوافق مع: تعديل سخان لا. 1 = 100، تعديل سخان لا. 2 = 70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الأضرار التي لحقت طرف غرامة الإبرة، ووضع كل الإبر سحبت أفقيا في طبق بيتري على شريط من صب المعجون. ملاحظة: يمكن الحصول على معلومات إضافية عن إبرة الشعرية سحب الأساليب في مزيد من التفاصيل في أبحاث الملاريا والمراجع الكاشف مركز الموارد Mدليل R4 24. </li></ol> 4. إعداد محطة حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المواد المطلوبة: الإبر الزجاج microcapillary انسحبت لطرف على ما يرام، microinjector، ورقة مرشح رقيقة ورقة مرشح سميكة، أطباق بتري، ماصات نقل، فرشاة الطلاء وتشريح المجهر ضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد microinjector وفقا للتعليمات في دليل microinjector، وضبط حجم حقن لحجم المطلوب لكل نبضة (على سبيل المثال، بحد أقصى 69 NL في النبض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على منصة التي هي سهلة للمناورة تحت المجهر (على سبيل المثال، الجانب المسطح من رف أنبوب الستايروفوم)، كومة اثنين من ورقة ورقة فلتر مع ورقة الترشيح رقيقة على القمة، وتأمين مع الشريط حول الحواف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend 10 ميكرولتر من كل حل الرنا المزدوج الجديلة في أنابيب الصبغة الملونة منفصلة، ​​ومكان على الجليد. </li></ol> 5. جمع الشرانق للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سد صغير 60 ملم × 15 ملم طبق بيتري مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات، وجمع ~ 50 الشرانق شاحب (الدورينانوغرام أول 24 ساعة بعد التشرنق) من علبة insectary باستخدام نقل البلاستيك القابل للتصرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي الشرانق التي لديها متوسط ​​إلى دباغة بشرة داكنة. ملاحظة: بمجرد أن تبدأ بشرة تان، فإنه يصبح أكثر صعوبة في اختراق بشرة، والنتائج حقن في أعلى بكثير الفتك. </li></ol> 6. الرنا المزدوج الجديلة حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، وقطع الطرف البعيد من إبرة الحقن مع زوج من ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إبرة الحقن عن طريق الردم الإبرة مع الزيوت المعدنية (باستخدام حقنة مع 3 بوصة، إبرة قياس 30)، وطرد فائض المعروض النفطي مع microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أمام إبرة الحقن مع أقصى قدر ممكن من الرنا المزدوج الجديلة، وإخراج نبضة واحدة تحت المجهر للتأكد من صرف السائل. في حالة عدم وجود السائل وتناولها و / أو طرد، والتحقق من الطرف البعيد من الإبرة للأي انسداد والتأكد من أن الإبرة المضمونة بقوة في microinjectoص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 1-3 الشرانق، ووضعها على ورقة الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام، ووضع الشرانق على ورقة الترشيح مع الظهرية بشرة الوصول إليها، واستخدام الفرشاة لدفع على ورق الترشيح وامتصاص أي المياه الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار خادرة مع غيض من الفرشاة، وادخال الإبرة في إهاب الظهرية بين الصدر والبطن في زاوية ما يقرب من 30 درجة بالنسبة إلى السطح الظهري للخادرة. وينبغي توجيه حقن نحو نهاية الخلفي من الشرنقة والإبرة يجب أن يتم نقل في اتجاه الأمامي إلى الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن اثنين من البقول (69 NL في النبضة) من 3 ميكروغرام / حل الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر في الدملمف، وتحقق لتوزيع اللون في جميع أنحاء الجسم. إذا تم تحديد أي لون، وتحول موقف إبرة حقن قليلا لمسح معلومات من إعاقة وكرر تسليم السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرشاة المبللة للتحرك بلطف خادرة من الإبرة في المياه لزراعة. تانه بوبا يجب التمسك الفرشاة على ضوء الاتصال. </li></ol> 7. شروط المشاركة الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري مع الشرانق حقنها في قفص البعوض مع تدفق الهواء مناسب (على سبيل المثال، قفص شبكة أو حاوية مع غطاء شبكة). وينبغي أن تظل الظروف تربية العذراء باستمرار في 27 ± 3 درجة مئوية درجة الحرارة، و75 ± 5٪ الرطوبة ويكون تحت ضوء: دورة الظلام من 16: 8 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10٪ (ث / ت) محلول الجلوكوز، ووضع كرة من القطن مشبعة حل على قفص البعوض شبكة لتغذية الكبار. </li></ol> 8. تقييم ضربة قاضية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المطلوب نقاط (ق)، وتقييم الظواهر في الحشرات التجريبية حقن الرنا المزدوج الجديلة، مقارنة بالمجموعة الضابطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم dsSRPN2 وdsLacZ الحشرات يوميا من قبل تقشعر لها الأبدان أسفل البالغين لمدة 2-3 دقائق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ونقلهم إلى لوحة الباردة في 2 درجة مئوية، وتحديد أي تشكيل شبه الورم عن طريق استخدام المجهر تشريح في 15Xالتكبير مع إضاءة brightfield. بعد التقييم، والعودة البالغين لظروف insectary (27 ± 3 درجة مئوية، 75 ± 5٪ الرطوبة). ملاحظة: dsRNAs المجموعتين الضابطة والتجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول هم dsSRPN2 وdsLacZ، على التوالي. هناك العديد من الخيارات المناسبة للضوابط. ومع ذلك، يقترح أن تحكم إيجابية التي النمط الظاهري و / أو التعبير تصور بسهولة (على سبيل المثال، من خلال تشريح المجهر) و / أو كميا [على سبيل المثال، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، وصمة عار الغربية] وينبغي أن تستخدم عندما تعلم هذه التقنية. البروتين SRPN2 وتقدير نسخة عبر طخة غربية وQRT-PCR، على التوالي، تم وصفها في ميشيل وآخرون (2005) 21. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+malaria+transmission:+a+review+of+entomological+inoculation+rate+measurements+and+methods+across+sub-Saharan+Africa.">The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa.</a> Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).</li><li>The malERA Consultative Group on Vector Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Research+Agenda+for+Malaria+Eradication:+Vector+Control.">A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control.</a> PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).</li><li>Enyati, A., Hemmingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Management:+Past,+Present,+and+Future.">Malaria Management: Past, Present, and Future.</a> Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Mitchell, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+Target-Site+Mechanisms+Combine+to+Confer+Strong+DDT+Resistance+in+Anopheles+gambiae.">Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).</li><li>Knox, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+online+tool+for+mapping+insecticide+resistance+in+major+Anopheles+vectors+of+human+malaria+parasites+and+review+of+resistance+status+for+the+Afrotropical+region.">An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region.</a> Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).</li><li>Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+a+Chimeric+Chalcone+Synthase+Gene+into+Petunia+Results+in+Reversible+Co-Suppression+of+Homologous+Genes.">Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes.</a> Plant Cell. 2, 279-289 (2002).</li><li>Sen, G. L., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+RNAi:+the+silence+of+the+genes.">A brief history of RNAi: the silence of the genes.</a> FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).</li><li>Romano, N., Macino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quelling:+transient+inactivation+of+gene+expression+in+Neurospora+crassa+by+transformation+with+homologous+sequences.">Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.</a> Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Catteruccia, F., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+the+Malaria+Vector,+Anopheles+gambiae:+Therapeutic+Applications+of+RNAi:+Methods+and+Protocols.">RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols.</a> Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A).</a> gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+Olfactory+System+Development+through+Chitosan/siRNA+Nanoparticle+Targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/Interfering+RNA+Nanoparticle+Mediated+Gene+Silencing+in+Disease+Vector+Mosquito+Larvae.">Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae.</a> J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).</li><li>Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+RNAi+based+microalgal+larvicide+to+control+mosquitoes.">Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes.</a> Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).</li><li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control:+A+review.">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review.</a> J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).</li><li>Burand, J. P., Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi:+Future+in+insect+management.">RNAi: Future in insect management.</a> J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).</li><li>Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+SRPN2+facilitates+midgut+invasion+by+the+malaria+parasite+Plasmodium+berghei.">Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei.</a> EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Anopheles Research. , (2014).</li><li>Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rearing+temperature+and+larval+density+on+larval+survival,+age+at+pupation+and+adult+size+of+Anopheles+gambiae.">Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).</li><li>Michel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+melanizing+activity+in+Anopheles+gambiae+does+not+affect+development+of+Plasmodium+falciparum.">Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).</li><li>Harker, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Profiling+Associated+With+Life+Cycle+of+Anopheles+gambiae.">Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).</li><li>Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+pupal-specific+cuticular+protein+genes+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).</li><li>Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+cuticle+proteins+of+Manduca+sexta:+characterization+and+profiles+during+sclerotization.">Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).</li><li>Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+cuticular+genes+of+silkworm,+Bombyx+mori.">Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori.</a> BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).</li><li>Zhou, X., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+specifies+pupal+development+and+mediates+the+&amp;#34;status+quo&amp;#34;+action+of+juvenile+hormone+on+the+pupal-adult+transformation+in+Drosophila+and+Manduca.">Broad specifies pupal development and mediates the &amp;#34;status quo&amp;#34; action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.</a> Development. 129, 2259-2269 (2002).</li><li>Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+Toll+related+genes+during+development+and+immune+responses+in+Anopheles+gambiae.">Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).</li><li>Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-related+receptors+and+the+control+of+antimicrobial+peptide+expression+in+Drosophila.">Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).</li><li>Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CecC,+a+cecropin+gene+expressed+during+metamorphosis+in+Drosophila+pupae.">CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae.</a> Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).</li><li>Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Insect+Metamorphosis:+a+Microarray-Based+Study+of+Larval+and+Adult+Gene+Expression+in+the+Ant+Camponotus+Festinatus.">Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus.</a> Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).</li><li>Cook, P. E., Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes+for+adult+age+estimation.">Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation.</a> Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).</li><li>Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae.">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li><li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+(Hemiptera:+Reduviidae)+by+dsRNA+ingestion+or+injection.">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li><li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph.">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li></ol>

وتدفع الوصول المفتوح لهذا الفيديو المادة تكفلها بيوجين.

الأساليب الحالية لإحداث غير المعدلة وراثيا رني في البعوض وتشمل الحقن المباشر للالرنا المزدوج الجديلة في hemocoel الكبار 12،13 أو تغذية اليرقات رني النانوية المغلفة الزناد 14-17 أو الرنا المزدوج الجديلة القائم على الطحالب الجزيئات 18. استهداف البعوض الكبار، في حين أن قيمة للغاية، يمكن استبعاد عدد كبير من الجينات التي تعمل خلال فترات النمو السابقة. ضربة قاضية بدأها تغذية اليرقات قد تسفر عن الظواهر غير متناسقة خلال مرحلة البلوغ بسبب، في جزء منه، إلى إمكانية استمرار البروتين المتغير من خلال طور العذراء. لذلك، إدخال وسيلة إضافية التي تهدف على وجه التحديد في البدء رني خلال تطوير العذراء ستوفر وسيلة لتقييم بشكل كامل وظائف الجينات خلال مراحل النمو قبل الكبار، وكذلك القدرات المعززة لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل الكبار. كما هو الحال مع نهج الجينات ضربة قاضية على أساس حقن الرنا المزدوج الجديلة أو التعبير، واستمرار الجينات ضربة قاضيةلا يمكن التنبؤ بها. ولذلك، ينبغي تقييم نص أو مستويات البروتين لجين من الفائدة خلال فترات التنموية للاهتمام. على الرغم من أن نلاحظ استمرار انخفاض مستويات البروتين في اليوم 5 بعد حقن للSRPN2 في الحيوانات حقن الرنا المزدوج الجديلة SRPN2، يمكن لعوامل مثل دوران البروتين ونصف حياة تختلف عن أهداف مختلفة. ومن الأهمية بمكان أن تضمن لها، كذلك، أن الرنا المزدوج الجديلة لاستخدامها في حقن يتركز بشكل جيد ويبدو سليما على هلام الاغاروز. ونحن نوصي المجربون إعادة تقييم هذه العوامل إذا كانت النتائج ضربة قاضية ليست كافية، وربما تحتاج إلى اختبار تجريبي لأهداف الجينات المحددة تركيزات كل من الرنا المزدوج الجديلة. نحن تصف طريقة لبدء التدخل RNA خلال طور العذراء من آن. تطوير الغامبية. ويعتمد هذا الأسلوب على مقدمة عبر Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة مباشرة في hemocoel من الشرانق في وقت مبكر، ويسمح لتقييم جودة حقن من قبلاستخدام من المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة. القدرة على تصور نوعية حقن يشكل تعزيز حاسم لضمان ضربة قاضية ناجحة وتشكل جانبا من جوانب ضربة قاضية الجينات القائم على حقن أنه لم يتم النظر في البروتوكولات القائمة على الرنا المزدوج الجديلة ذكرت معظم سابقا مع التركيز على مرحلة البلوغ. من خلال استهداف خادرة في بداية هذه الفترة التنموية، الجينات التي قد يكون لها دور خلال هذه الفترة تنموي محوري، أو خلال المراحل المبكرة من سن البلوغ يمكن تقييمها وظيفيا. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قد تمكن تسليم الرنا المزدوج الجديلة إلى الخلايا، وإنشاء تدخل الحمض النووي الريبي في الخلايا التي يمكن الوصول إليها خلال التحول، ولكن يصعب الوصول إليها في البعوض البالغ تشكيلها بالكامل. تحليل ميكروأري مؤخرا هاركر وآخرون (2012) حددت 560 آن. النصوص الغامبية التي تصل التنظيم أو تنظيم أسفل من قبل ما لا يقل عن 4 أضعاف خلال مراحل نمو متميزة، بدءا من الجنين إلى الكبار. من 560 النصوص التي تم تحديدها، مجموعة من 309 والتنظيم صعودا خلال تطوير العذراء 27. وتشير هذه النتائج إلى أن هناك العديد من متطلبات التعبير الجيني الفرق في جميع أنحاء تنمية البعوض، بما في ذلك تلك التي تحدث خلال مرحلة العذراء، فاصل خلالها الكائن الحي يخضع التحول. في العديد من أنواع الحشرات، بما في ذلك. الغامبية، الجينات المسؤولة عن العمليات مثل التنمية (أي جليدية العذراء والبروتينات ملزم كيتين) 27-31 والمناعي استجابة (أي تول البروتينات مثل مستقبلات) 27،32-34 وأعربت غاية أثناء مرحلة العذراء. مرة واحدة ظهرت الكبار تشكيلها بالكامل، وهناك واصل التعبير الجيني في استجابة لالبيئية والفسيولوجية تغيير 35. والجدير بالذكر أن خلال تطوير الكبار في وقت مبكر، أن هناك زيادة في التعبير عن الجينات التنموية (أي جليدية الكبار والبروتينات العضلية) 36، وكذلك الجينات الرئيسية الأخرى (أي </em&gt;، الحيوانات المنوية بروتين معين والسيتوكروم P450 الانزيمات الأيض) 27،36. السيطرة الإيجابية المستخدمة في تطوير هذا البروتوكول، SRPN2، هو آن. الغامبية مثبط البروتياز سيرين (السربين). يلعب SRPN2 دورا هاما في تنظيم السلبي للالتصبغ الحشرات، مجموعة واسعة الاستجابة المناعية الفطرية في الحشرات 21،22. ضربة قاضية من SRPN2 في البعوض النتائج الكبار في تشكيل شبه ورم 21،22، النمط الظاهري الذي لوحظ بسهولة عن طريق استخدام المجهر الضوئي. وبالنظر إلى أن هذا النمط الظاهري واضح يمكن سجل بسهولة في الحشرات الحية، كنا SRPN2 لحقن مرحلة رني العذراء الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن SRPN2 خلال جميع مراحل التطوير 37، وبالتالي توفير هدفا جيدا للمرحلة العذراء حقن رني وتقييم وظيفة في الكبار في وقت مبكر. علينا أن نبرهن على طريقة وضعنا غير قادرة على إحداث الكبار مماثل pseud الميلاني<html> تشكيل س الورم نتيجة لحقن الرنا المزدوج الجديلة المنجزة خلال مرحلة العذراء للتنمية. في تطوير هذا البروتوكول، لاحظنا أن حقن خلال تطوير العذراء في وقت مبكر (أي أول 24 ساعة بعد تساقط اليرقات، العذراء) أمر بالغ الأهمية للحصول على أفضل ظهور الكبار. في حال الفقراء ظهور يتم الحصول بعد الحقن، ونحن نوصي تنظيم اليرقات بدقة أكبر، للحصول على الشرانق مع تصلب بشرة أقل اتساعا، وأؤكد أن يتحقق في وقت مبكر حقن مرحلة العذراء. وعلاوة على ذلك، والتقليل من الأضرار التي لحقت النتائج بشرة في معدلات ظهور الأمثل وزيادة التكبير أثناء الحقن يمكن أن تساعد في ضمان أن يتم ثقب فقط المنطقة المقصودة من هذا الحيوان. إذا كانت الإبرة يجب أن ثقب من خلال لبشرة بطني، وتجميع السائل المسمى صبغ يكون واضحا على السطح الخارجي للخادرة أو سوف تشبع ورقة الترشيح. فإنه ينصح بشدة لتجاهل أي الشرانق التي لديها أكثر من ثقب بشرة. jove_content &quot;&gt; مع تجارب واسعة من العديد من المختبرات مع أداء حقن البعوض الكبار، والنهج حقن مكروي التي سبق تحديدها يمكن تكييفها مع تعديلات بروتوكول بسيط للاستخدام في التجارب رني العذراء. وعموما، فإن الهدف من هذه الطريقة هو توفير الباحثين القدرة على توسيع الإطار الزمني خلالها عكس لا يمكن أن يؤديها تحاليل وراثية، مما يتيح البحوث التي من شأنها دعم تطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في الأنواع الأخرى، مثل الرادنة prolixus وورق القطن frugiperda، تكشف عن أن الجينات آثار إسكات تميل إلى أن تكون من ذلك بكثير أكبر عندما بدأ أثناء مرحلة ما قبل الكبار مراحل 38،39. وخلال جميع مراحل التنمية، الجينات بوساطة رني ضربة قاضية يخضع لاعتبارات تتعلق سرعة واستمرار إسكات الجينات، واستقرار البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المستهدفة. الهدف رني المثالي جينات تميل إلى أن تكون تلك التي ترميز proteiن أو الحمض النووي الريبي التي لديها قصيرة نصف الحياة ومعدل دوران عال 11،40. بينما الاستراتيجيات رني المعدلة وراثيا يمكن أيضا أن تستخدم لمعالجة اعتبارات تتعلق سرعة واستمرار رني خلال مراحل ما قبل الكبار، وتقنيات المعدلة وراثيا لديها العديد من نقاط الضعف (على سبيل المثال، الوقت اللازم لتوليد خطوط المعدلة وراثيا، التجريبية الأطر الزمنية لالتزاوج البعوض لتوليد الحشرات مع التعبير الرنا المزدوج الجديلة منظم، والحفاظ على مخزونات المعدلة وراثيا). على النقيض من ذلك، لدينا بروتوكول يتيح وسيلة أسهل وأسرع للبدء في إسقاط الموروثة خلال تطوير العذراء وفي أنواع الخلايا التي تنشأ ويمكن الوصول إليها خلال مسخ ولكن أقل الوصول إليها في البالغين. استخدام تعليق الرنا المزدوج الجديلة المسمى صبغ يسمح لتقييم سهلة للنجاح الحقن وتشتت المواد أدخلت داخل الشرانق. لدينا بيانات عن بداية تشكيل الورم في البالغين العذراء حقن، بالمقارنة مع الحيوانات المحقونة مثل البالغين، ويتسق مع الحرف الأولينتقم من ضربة قاضية رني بوساطة أثناء طور العذراء. باستخدام خط G3 البعوض لدينا وتحت ظروف insectary لدينا، فإننا نلاحظ الميلاني تشكيل شبه ورم الكبار في وقت مبكر من 10 أيام بعد الحقن من البالغين حقن 3-5 أيام بعد ظهور. عن طريق أداء أوائل حقن العذراء المرحلة، نلاحظ مرئية تشكيل الميلاني شبه الورم في وقت مبكر من خمسة أيام بعد الحقن (أي 03:57 آخر أيام ظهور). وتعني هذه البيانات أن هذه الطريقة يمكن الشروع في ضربة قاضية الجينات خلال فترة التنموية سابقا تحت درس (أي تنمية العذراء). قد تكون لدينا طريقة صبغ العلامات مفيدة أيضا لوضع بروتوكولات حقن اليرقات الجديدة، نظرا لطبيعة شفافة للبشرة خلال جميع الأعمار اليرقية. في حين أن التحكم المستخدمة في هذه الدراسة تتطلب التقدم إلى مرحلة البلوغ لعرض النمط الظاهري ضربة قاضية، والتجارب المستقبلية لتقييم الظواهر مرحلة معينة العذراء بعد الحقن من الشرانق في وقت مبكر سيوفرمعلومات قيمة فيما يتعلق بتوسيع هذه الطريقة في فترات التنموية إضافية مثل التنمية العذراء في وقت متأخر. وباختصار، فإن هذا الأسلوب بروتوكول رني قيما لمرحلة بدء العذراء من ضربة قاضية الجينات بوساطة رني ويوسع أدوات الجينومية الوظيفية المتاحة للاستخدام ضمن الأوساط البحثية ناقلات الامراض والحشرات.

الملاريا مرض معد يسببه البعوض الذي يؤثر على الملايين من الأفراد سنويا. منظمة الصحة العالمية (WHO) أن في عام 2013 كان هناك حوالي 584،000 حالة وفاة بسبب الملاريا، 78٪ منها وقعت في الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات 1. مسببات الأمراض التي تسبب الملاريا البشرية هي طفيليات apicomplexan داخل المتصورة جنس وتنتقل بين المضيفين البشري عن طريق البعوض بعوضة الإناث. يحدث انتقال عندما يأخذ البعوض وجبة الدم من شخص مصاب، ومن ثم الودائع الطفيليات المعدية إلى فرد غير مصاب في وجبة الدم اللاحقة. ضمن جنس الأنوفيليس، بعوض الملاريا هو النوع مع أكبر قدرة اتجاهي وهو ناقل الملاريا الأبرز في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى 1-3. حاليا، لا تزال مكافحة ناقلات البعوض عن طريق نشر المبيدات الحشرية إلى bالبريد الطريقة الرئيسية المستخدمة للحد من عبء الملاريا البشرية. على الرغم من أن استخدام المبيدات الحشرية منذ 1960s وقد ثبت أن تكون ناجحة للغاية، وأدى صعود مقاومة المبيدات الحشرية حاجة لتطوير المبيدات الحشرية جديدة واستراتيجيات مكافحة ناقلات بديل 4-7. خلال عام 2010، أشار ما مجموعه 49 من 63 بلدا تقارير لمنظمة الصحة العالمية وقوع مقاومة المبيدات الحشرية في نواقل الملاريا 1. بالإضافة إلى ذلك، أداة الأشعة تحت الحمراء مخطط، الذي يستخدم الأدب لاستعراض الأقران لتقييم البيانات المقاومة في المناطق المداري الإفريقي، تقارير أن ما بين 2001 و 2012 كان هناك 46٪ و 27٪ زيادة في مقاومة البيرثرويدات ومادة ال د. (دي دي تي)، على التوالي 7. تم التعرف تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في 1990s في وقت مبكر كأسلوب التي يمكن أن تستخدم لتعطيل الجينات في مصنع بتونيا 8،9 وفي الفطر العصيباء المبوغة crassa 9،10. بعد ذلك بوقت قصير،في عام 1998، وقد تم توثيق رني لأول مرة في ايليجانس انواع معينة كوسيلة لخفض التعبير الجيني في نموذج حيواني من خلال إدخال العقاقير أو الحمض النووي الريبي مزدوج الجديلة (الرنا المزدوج الجديلة) عن طريق الحقن أو التغذية أساليب 9،11. منذ اكتشافه، قد أحدثت ثورة رني السعي لعلم الجينوم وظيفية من خلال السماح للباحثين الاستفادة من علم الوراثة العكسية للتحقيق بسرعة الأدوار الوظيفية من الجينات ذات الاهتمام عبر آلية إسكات الجينات انتقائية للغاية بعد النسخي. في بعض الكائنات الحية، مثل ذبابة الفاكهة، فإن استخدام الكائنات المعدلة وراثيا التي تعبر عن التدخل التركيبات RNA الناجح على نطاق واسع لإسقاط الموروثة (دينار كويتي). على الرغم من أن استخدام الجينات المحورة في آن. وقد استخدمت الغامبية للرني وقد تكون مفيدة للشاشات واسعة النطاق، وتوليد سلالات البعوض المعدلة وراثيا على حد سواء العمل والوقت مكثفة، مع الأخذ عموما 2-3 أشهر للانتقال من تحديد الجينات التي تهم الجيلعلى من الأسهم المعدلة وراثيا المناسب (12). حاليا، الوسيلة الرئيسية لدينار الجينات في آن. الغامبية هو عن طريق الحقن في الدملمف، خلال مرحلة البلوغ، من الرنا المزدوج الجديلة محدد لجين معين 12،13. هذه العملية تستغرق عادة حوالي شهر واحد للذهاب من تحديد الجينات التي تهم تقييم الجين دينار كويتي، يبرهن على أن تكون أسرع بكثير من الطرق المعدلة وراثيا 12. تم إنشاء طرق اليرقات المرحلة رني مؤخرا في آن. الرنا المزدوج الجديلة المستندة إلى الطحالب الغامبية والزاعجة المصرية عبر جسيمات متناهية الصغر تغذية 14-17 أو عن طريق التسليم عن طريق الفم من الجزيئات 18، مما يتيح فرصا لإجراء تحليل الجيني وظيفية خلال المراحل الأولى من التنمية. في الحقن المباشر، والتغذية، وطرق التسليم جسيمات متناهية الصغر، يؤخذ الرنا المزدوج الجديلة تصل بشكل مستقل من قبل الخلية المستهدفة والمشقوق بواسطة انزيم المقامر إلى 21-25 النوكليوتيدات طويلة &quot;التدخل باختصار الرنا&quot; (الرناوات siRNAs) 19،20. هذه الرناوات siRNAs ثم يتم incorporATED في الحمض النووي الريبي الناجم عن إسكات المعقدة (RISC)، والتي سيتم التخلص منها حبلا واحد، مما يتيح للمجمع RISC محددة RNA لربط ويلتصق مرنا الهدف، وبالتالي تقلل من مستوى، وتحول دون ترجمتها 19،20. العديد من الميزات الجوهرية لعلم الأحياء البعوض الأساسي تعدل قدرة اتجاهي، بما في ذلك تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الشم، ذوق حاسة)، التزاوج والتناسل والحصانة. ونظرا لأهمية هذه العمليات البيولوجية، فمن المرجح أن تعديل على المستوى الجيني أو الدوائي سوف توفر فرصا جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض، بما في ذلك تزييف مقاومة المبيدات الحشرية، وتوفير أدوات جديدة لنهج متكامل على نطاق أوسع لإدارة ناقلات. فإن استخدام علم الجينوم وظيفية لتقييم دور الجينات الكامنة وراء هذه الميزات البيولوجية الجوهرية يمكن تحديد أهداف جديدة وتقديم رؤى جديدة في كيفية يمكننا خلق فعال الجديدة، الاستراتيجيه مراقبة أكثر فعاليةالمنشأ. وصفنا تطوير واستخدام طريقة الحقن السريع لبدء رني خلال طور العذراء من آن. الغامبية. ونلاحظ أن حقن مرحلة العذراء لالزناد رني يمكن رصد الظواهر الناتجة في البالغين مرحلة مبكرة، أي عاجلا بعد ظهور من شأنه أن يلاحظ إذا بدأت الجينات ضربة قاضية في البالغين بعد ظهور. هذه الأساليب تمكن الجينات ضربة قاضية تبدأ خلال الفترة التنموي العذراء وتمتد إلى مراحل الكبار، بحيث إسقاط الموروثة بدأت خلال تطوير العذراء يمكن أن يستمر ويؤثر على الكبار في وقت مبكر أنواع الخلايا اللمف الدموي يمكن الوصول إليها، وكذلك أنواع الخلايا التي هي أكثر الدملمف الوصول اليها خلال التحول مما كانت عليه في الكبار، مثل الخلايا العصبية الحسية الموجودة في الزوائد الكبار بعد ظهور.

<table><tbody><tr><td>MEGAscript RNAi kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II injector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II foot switch</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glass micropipette puller</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>1371150</td><td>&amp;frac14; inch cut from tip to create a wider opening.</td></tr><tr><td>Whatman &amp;ldquo;thin&amp;rdquo; filter paper&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td></tr><tr><td>Western blot &amp;ldquo;thick&amp;rdquo; filter paper</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td></tr><tr><td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush (size 0)</td><td>Michael&amp;rsquo;s Art</td><td>10474940</td><td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td></tr><tr><td>Dissecting light microscope</td><td>&amp;nbsp;----&amp;nbsp;</td><td>-----</td><td>This can vary based on availability and user preference.</td></tr></tbody></table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

حقن العذراء لعوائد الجينات دينار أفضل النتائج عندما يتم تنفيذ الحقن خلال طور العذراء في وقت مبكر، عندما إهاب دبغ مستويات منخفضة (الشكل 1A، اليسار، و1B). زيادة الدباغة وتصلب بشرة، عموما بعد 24 ساعة، والنتائج في زيادة مخاطر الوفاة العذراء بعد الحقن (الشكل 1A والوسط واليمين). معدل التنمية العذراء يمكن أن تختلف تبعا لظروف insectary وكثافة الحيوانات 24،25. لذا، فمن الأفضل لتقييم تصبغ بصريا. أثناء عملية الحقن، يتم إدخال إبرة الشعرية في إهاب الظهرية بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة في الجزء الأمامي إلى الاتجاه الخلفي (الشكل 2A). مرة واحدة يتم إدخال إبرة والرنا المزدوج الجديلة + 0.01٪ (ث / ت) يتم الاستغناء FGD، وتوزيع الصبغة هو واضح في جميع أنحاء الدملمف (فيقوإعادة 2B). تقييم ظهور الكبار لالشرانق حقن مع 0.01٪ (ث / ت) كشفت FGD بمعدل 70٪ ظهور، مقارنة مع 96.7٪ ظهور الضوابط غير حقن (الشكل 3A). وتجدر الإشارة، وقد لوحظ ظهور جزئي من حالة العذراء لعدد كبير من البعوض غير على قيد الحياة (الشكل 3B). الحيوانات المحقونة يحمل أي تأخير في وقت ظهور الشكل (4A) أو تأثير منحازة على كلا الجنسين (الشكل 4B). قام تقييم إضافي للبقاء الكبار ما يصل الى 10 يوما بعد ظهور يكشف أي تأثير واضح على بعد ظهور الكبار البقاء على قيد الحياة (الشكل 4C). وجرى تقييم التحقق من صحة دينار الجودة من قبل الميلاني شبه ورم (كتلة الأنسجة المصطبغة بحزن) النمط الظاهري المرتبطة SRPN2 ضربة قاضية 21،22 كعنصر تحكم إيجابية لضربة قاضية و<html> غياب الظواهر المرتبطة حقن dsLacZ كعنصر تحكم السلبية. وسجل البعوض البالغ الذي ظهر في يوم 8 بعد حقن (يوم 6-7 بعد ظهور). وقد لوحظت الميلانية الزائفة الأورام (الشكل 5A و5B) من خلال بشرة من 93.5٪ من dsSRPN2 مقابل 0٪ من البعوض dsLacZ الكبار (الشكل 6A). وقد تم تحديد مجموعات من الأنسجة melanized بحزن على تشريح من البقع المصطبغة (الشكل 5C). كانت شبه الأورام واضحة على بشرة الكبار في وقت مبكر من يوم 3 بعد ظهور وكانت أيضا حاضرة في مجموعة فرعية من dsSRPN2 الدملمف وأنسجة الأمعاء (لا تظهر البيانات). في 5 بعد الحقن (أوائل مرحلة البلوغ)، انخفضت بشكل ملحوظ SRPN2 المستويات في dsSRPN2، ولكن لوحظ عدم dsLacZ أو عزلات بروتين غير حقن الدملمف (الشكل 6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: انطلاق التنموي للحقن الرنا المزدوج الجديلة العذراء حقن العذراء المبكر للنتائج الرنا المزدوج الجديلة في البقاء على قيد الحياة الأمثل والتقدم إلى مرحلة الكبار. مستويات منخفضة من تصبغ بشرة (A، غادر، وباء) ويمكن ملاحظة في أول 0-24 ساعة التشرنق التالية. الدباغة من العذراء بشرة السابقة حقن (A والوسط واليمين) النتائج في معتدلة إلى الفقراء البقاء على قيد الحياة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> الشكل 2: موقف حقن وتوزيع المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة (A) شعري حقن إبرة المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة في إهاب الظهرية بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة، في سابقة لالخلفي الاتجاه. يتم توزيع (ب) صبغة واضح في الدملمف العذراء. حجم حقن الرنا المزدوج الجديلة من 138 نيكولا لانغ، وصفت مع 0.01٪ FGD (ث / ت). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> الشكل (3): بعد حقن ظهور الكبار (A) 70٪ من الشرانق حقن مع 0.01٪ FGD (ث / ت) ظهر بنجاح (ن = 60)، مقابل 96.7٪ من الضوابط غير حقن (ن = 60). أجريت ثلاث مكررات البيولوجية. وقد لوحظ (ب) ظهور الجزئي من حالة العذراء لعدد كبير من البعوض غير على قيد الحياة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> الشكل 4: معدل ظهور، وتقييم الجنس والكبار البقاء على قيد الحياة (A) لوحظت مرات ظهور المقارنة التالية حقن العذراء مع 0.01٪ FGD (24 ساعة = ​​80٪ و 48 ساعة = ​​20٪)، بالمقارنة مع العذارى غير حقن (24. ساعة = 83٪ و 48 ساعة = 17٪). (ب </strأونج&gt;) وقد لوحظ متساوية تقريبا من الذكور والإناث البالغات ظهور ل0.01٪ FGD الشرانق حقن (الإناث = 48٪ والذكور = 52٪) والشرانق غير حقن (الإناث = 52٪ والذكور = 48٪). تحليل (C) البقاء على قيد الحياة ويكشف أن حقن مع 0.01٪ FGD لا يؤثر بقاء البالغين، بتقييم ما يصل الى 10 يوما بعد ظهور. وتمثل نتائج البيانات من ثلاث تجارب مستقلة مع 0.01٪ FGD حقن (ن = 60) وعدم حقن (ن = 60) الشرانق (عدد متساو من الذكور والإناث). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> يعكس الزائفة الورم النمط الظاهري مراقبة إيجابية ضربة قاضية ناجحة لوحظت الزائفة الأورام على (A) في منطقة البطن و (ب) بشرة الصدر من dsSRPN2 -injected، ولكن ليس dsLacZ البعوض الكبار -injected في يوم 8 بعد الحقن: الرقم 5.(C) التكبير العالي (400X) التصوير (أ) من بشرة وتشريح بقع مصطبغة (ب) تكشف مجموعات من الخلايا melanized بحزن. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> الشكل 6: الكمي لتشكيل شبه الورم وانخفاض مستويات البروتين SRPN2 (A) حقن طور العذراء تؤدي إلى تشكيل شبه ورم في 93.5٪ من البالغين dsSRPN2 (ن = 21) مقابل 0٪ من الضوابط dsLacZ (ن = 19). . النتائج التي تم الحصول عليها يوم 8 بعد الحقن. (ب) لطخة غربية (يسار) يظهر انخفضت SRPN2 المستويات في dsSRPN2، ولكن ليس dsLacZ أو العزلات غير حقن البروتين الدملمف (يوم 5 بعد الحقن). النتائج على أساس ثلاث تجارب مستقلة. وكانت مكافحة SRPN2 21 و مكافحة SRPN3 التخفيفات 26 الأجسام المضادة المستخدمة 1: 1000 و 1: 2000، على التوالي. الماعز المضادة للراbbit مفتش-HRP (المنتج الشوري عام 2004، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، دالاس تكساس) كانت تستخدم في 1: 5000. وتم قياس كمية كل مستويات بروتين (يمين) من خلال كثافة الفرقة (يماغيج البرمجيات، المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD)، تطبيع SRPN3، وإحصائية مقارنة عن طريق اختبار ر مزاوج. P &lt;0.05: *، ف ≥0.05: نانو ثانية (لا كبيرة). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae at JoVE.com

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

رني الزناد تسليم إلى<em&gt; بعوض الملاريا</em&gt; شرانق

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.1K Views.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Video: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،<em&gt; آفة Ceratitis الرؤيسية</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetics

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

حقن الرنا المزدوج الجديلة الى انثى البعوض بعوض A.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

دسرنا استنساخه Microinjection و "الحشري أوفيبوسيتيون" في البعوض والذباب البيت

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Environment

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

استخدام نظام GAL4-UAS لعلم الوراثة الوظيفية في أنوفيليس غامبيا

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

طريقة الميكروبيكشن للأجنة الغامبية Anopheles

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

الإدارة الفعالة لتداخل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم (RNAi) للبعوض الأنوفيلة الغامبية البالغة

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Mosquito Embryo Microinjection: A Technique to Deliver Exogenous DNA into Embryo Yolk of Anopheles Gambiae to Generate Germline Mutations

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, <a href="https://www.jove.com/v/62591">Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the delivery of gene drive construct into the embryo of Anopheles gambiae mosquito through embryo microinjection technique. This procedure allows for integration of&#160; delivered DNA construct, through homologous recombination, into the germline cells to generate transformed mosquito population.

الحقن المجهري لجنين البعوض: تقنية لتوصيل الحمض النووي الخارجي إلى صفار الجنين من Anopheles Gambiae لتوليد طفرات السلالة الجرثومية

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the ...

رني الزناد تسليم إلى

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،