פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק שיטת מיקרו-הנדסה ספציפית עבור אנופלס גמביה, אשר היה קשה מבחינה היסטורית לשנות באמצעות טכניקות הנדסה גנטית נפוצות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת באופן אמין אנופלס גמביה מהונדסת. היישומים של טכניקה זו להרחיב לקראת אסטרטגיות חדשניות לחיסול מלריה על ידי להקל על יצירת יתושים המתאימים לדיכוי האוכלוסייה או שינוי של אוכלוסיות סוג בר Anopheles גמביה.
מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למינים שונים של יתושים. טכנולוגיית המיקרו-תרגול שלנו לוקחת סבלנות ותרגול. יש עקומת למידה.
כדי להתחיל, השתמש בשאיפה למקם 20 עד 30 נקבות בצינור חרוט שקוף 50 מיליליטר. ודאו שהצינור נחתך בשני קצותיו ומכוסה בסרט שיניים לטקס בקצה אחד ורשת ניילון ונייר סינון בקצה השני, שם יתושים יטילו את ביציהם. מניחים את הצינור מלא יתושים בצלחת פטרי קטנה מלאה במים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן מניחים את הצינור ואת המנה באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
הסר את הצינור מן האינקובטור ולהכניס את הצינור לתוך כלוב ריק. הקש בעדינות על הצינור כדי לאפשר ליתושים לעוף החוצה. הסר את הצינור מהכלוב ברגע שכל היתושים עפו החוצה.
כאשר הצינור הוא ללא יתושים, לפתוח את הטבעת התחתונה, להסיר את הניילון, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר המסנן עם הביצים מן הצינור. מניחים את נייר הפילטר עמוס הביצים בצלחת פטרי מפלסטיק המכילה שכבה של נייר סינון לח במים. שים קרום על שקופית זכוכית נקייה ולהשתמש מלקחיים נקיים כדי לכסות את הממברנה עם פיסת נייר מסנן, משאיר כמילימטר אחד של מסנן הממברנה חשוף.
הרטיבו את נייר המסנן במים דה-יונים, ואז השתמשו במברשת כדי להעביר בעדינות 30 עד 50 עוברים לקצה הממברנה וליישר את הביצים אנכית לאורך הממברנה. כוון את הביצים באותו כיוון, כך שכאשר ביצים נצפות תחת מיקרוסקופ microinjection, הקצה האחורי נמצא במצב למטה ויוצר זווית של 15 מעלות עם המחט. מרפדים את כל קצה הממברנה בביצים.
השתמש קצה microloader כדי למלא את המחטים עם שני microliters של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינורות משאבת הלחץ האוטומטית. יישר את המחט כך שהיא עושה זווית של 15 מעלות עם המישור של השקופית.
פתח את קצה המחט על ידי נגיעה זהירה בביצה הראשונה, ולאחר מכן הכנס את קצה המחט לכ -10 מיקרומטרים בקוטב האחורי. זריקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצה. השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצה הבאה כדי להמשיך בהזרקה.
כדי להבטיח כי קצה המחט נשאר פתוח ולא היה סתום, לחץ על כפתור הזרק לפני הכניסה לעובר אחר לדמיין את טיפה קטנה בפתח המחט. אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור נקה כדי לנקות את המחט ולחזור על בדיקת ההדמיה טיפה. התאם את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.
להזריק על 40 עד 50 ביצים עם מחט אחת. לאחר השלמת הזריקות, לשטוף את הביצים לתוך מיכל זכוכית מרופד בנייר מסנן ומלא 50 מיליליטר של מים deionized. באמצעות פרוטוקול זה, מערכת מונחה גנים אוטונומית הוכנסה לתוך הנבט של זן מעבדה G3 של אנופלס גמביה.
המערכת תוכננה למקד את האורתולוגיה הקרדינל, או Agcd, על הכרומוזום השלישי במין זה. pCO37 plasmid מוצג. הוא מכיל סטרפטוקוקוס פיוגנס Cas9 אנדונוקלאז תחת שליטה של האלמנטים הרגולטוריים של אורתולוגית הגן ננו.
בנוסף, יש לו RNA מדריך תחת שליטתו של מקדם גנים U6 ואת קלטת הסמן הדומיננטית 3XP3 CFP המבטאת את חלבון הפלואורסצנטי ציאן. גישות מולקולריות אימתו החדרה מדויקת של כ -10 ק"ג זוגות בסיס של DNA, אשר הוגדר AgNosCd-1. ניתוחי מעקב מקיפים הראו כי AgNosCd-1 היה יעיל מאוד בכונן, יצר אללים עמידים מעטים, ולא היה עומס גנטי גדול בשל שילוב וביטוי של מערכת כונן הגנים.
כונן גנים הומוזיגוס המכיל יתושים היו מוטנטים אובדן תפקוד, עם זחלים, גלמים, ומבוגרים שזה עתה הופיעו שיש פנוטיפ עיניים אדומות. כאשר מנסים פרוטוקול זה, שמירה על 88 הוא חיוני עבור בקיעה טובה כדי ביצה אפורה בהירה ולהימנע ביצים לבנות.
