המחברים מבקשים להודות במתקן לתאי גזע פלוריפוטנטיים ואת Core הדמיה Confocal בבית החולים סינסינטי ילדים. עבודה זו נתמכה על ידי R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ו 2U19AI70235 (GKKH).

הפרוטוקול הבא אחרי הקווים המנחים של ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם מוסדות. 1. דגימת האף הרירי הערה: קבל דגימות נבדקים אשר הינם ללא סימני זיהום ויראלי בדרכי הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי חרוטי 15 מ&quot;ל לפני הביקור משתתף ולהוסיף 2 מ&quot;ל BEGM (מדיום הגידול תא אפיתל הסימפונות) בתוספת 20 μl סטרילי פן / סטרפטוקוקוס / Fungizone (P / S / F) (0.01%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מברשת ציטולוגיה להרחיב רק לפני נטילת המדגם, ואל תשכחו לשמור מברשת סטרילית לא נוגע בו לכל משטחים מלבד משטחי האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל משתתף לשבת בשקט להטות את הראש כלפי מעלה, אל התקרה. יש קטנים או ילדים חסרי מנוחה יותר לשבת על הידיים ו / או בשכיבה כדי למנוע לחבוט המברשת הצדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון מברשת בחלק האחורי של האף שבו המעבר מצמצם (נראה כמו חור שחור קטן). חלק מברשת למטה ולסובב פרקים כמו המברשת תיוסר nostril. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מברשת חרוטים לצלול BEGM. חותכי מברשת עודפת ולהחליף כובע על צינור. לא מערבולת. הערה: אם המשתתף הוא מוכן, להשיג מברשת שנייה באותו אופן אבל בנחיר השני. קבלת רפרוף קל על שני הנחיריים תגרום סבירות גבוהה יותר כי הדגימה תהיה מוצלחת. דגימה באותו הנחיר עלולה לגרום לדימום לא ישפר את המדגם סביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות קרובות ל -37 מעלות צלזיוס ככל האפשר במהלך הובלה באמצעות מבחנה עם מים חמים. </li></ol> 2. ספירת תאים ו Cytospin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את המברשת BEGM ולקחת 10 μl של המדגם עבור ספירת תאים באמצעות hemacytometer. הוסף 10 μl של כתם חי / מת ולספור לחיות תאים רק תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 μl של המדגם לדלל 200 μl עם 1x PBS. הוסף משפך cytospin המצורף שקופית זכוכית ספין ב 300 סל&quot;ד במשך 2 דקות. בואו להחליק שקופית O / N ו- כתם יבש following להוראות היצרן. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות כתם עם המה 3 Stain <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל פתרון (מקבע המה, תכלת; המה 3 פתרון אני, ורוד; ו המיתי 3 פתרון שני, כחול עמוק) לתוך צלחת מכתים; שמור מכוסה כשאינו בשימוש. הכנס שקופיות לתוך סירה מכתימה שקופית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות ברציפות מקבע במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות פתרון אני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות הפתרון השני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לנקז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים ללא יונים עד המים זורמים ברורים. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראה שקף מתחת תאי מיקרוסקופ וספירה, לקבוע אחוז תאי אפיתל. צריך להיות 90% או יותר אם הדגימה היא טובה. </li></ol> 3. תאים מתזמנים הערה: ביצוע כל הליכי תרבית תאים בתרבות רקמות נכונה מוסמכתמכסה המנוע באמצעות טכניקה סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחות עם שור Dermal קולגן (BDC), סוג 1. הוסף 0.5 מ&quot;ל של 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BDC מדולל 49.5 מ&quot;ל 1x PBS. כן פחות אם רק כמה צלחות תשמשנה. מעיל בקבוקון T25 עם 2 מ&quot;ל BDC דגירה O בשכונה סטרילי / N או ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, אם יהיה צורך בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוף כל נוזל נותר. לחשוף צלוחיות לאור UV למשך 30 דקות במנדף סטרילית. צלוחיות חנות עד חודש אחד בכל 4 ° C, אבל להביא אותם RT או 37 ° C לפני זריעת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מברשת ותאי BEGM על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן זרע. בעדינות מברשת סוויש בתוך חרוטים, אבל לא מערבולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 7 x 10 5 תאים בבקבוק T25. אם יש פחות, להשתמש במיכל קטן, כגון אחד טוב של צלחת 6 באר. צלחת בגודל זה דורש כ 3 x 10 5 תאים. הערה: אם אין תאים רבים זה, זה לא מומלץ להמשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה מנוע סטרילית, לקחת מברשת מתוך צינור gently לסובב מברשת על פני השטח של הבקבוק המצופה, נזהר שלא לשרוט את הציפוי. בטל המברשת במיכל Biohazard המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט פיפטה את התאים הנותרים ב BEGM מתוך החרוטים לתוך בקבוק T25. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. מספר התאים הצפים יקוים וייתכנו כמה פסולת מהאף, אשר מקובל בשלב זה (איור 3 א). </li></ol> 4. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זריעת תאים, ולתת להם להתיישב במשך 48 שעות ללא הפרעה (איור 3). לאחר 48 שעות, לאט ובעדינות להוסיף 2 מ&quot;ל חם BEGM ו -20 μl סטרילי פניצילין / סטרפטומיצין / Fungizone (P / S / F). הערה: אין לשאוב תקשורת 2 מיליליטר של המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 th לאחר הזריעה, לשאוב את כל הנוזל בזהירות, ולהחליף עם 4 מ&quot;ל טריים, חימם BEGM בתוספת 1x פן / סטרפטוקוקוס (fungizone כבר לא נחוץ). שינוי בתקשורת כל יומיים ולהעריך תאים לצרףment, צמיחה מפגש. כאשר התאים מגיעים ~ 80% המפגש, בדרך כלל בתוך 2-3 שבועות, הם מוכנים להיות passaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוק T25 אחת (כ -2.5 x 10 6 תאים כאשר ומחוברות) ניתן passaged לשלוש צלוחיות T25 או בבקבוק T75 אחד. לאחר המעבר הראשון, תאים צריכים להיות חזקים ובריאים, להגיע למפגש על כל שלושה ימים. </li></ol> 5. תאים Passaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב התקשורת מהצלחת. הוסף 1 מ&quot;ל 0.05% פתרון טריפסין לכל בקבוק T25 לצלחת ומניחים בחממה במשך כ 4min, או עד תאים להתנתק הצלחת. בדוק את רמת הניתוק של תאים כל 2 דקות ואל תשאיר טריפסין על יותר מ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל טריפסין נטרול פתרון (TNS), או מדיה המכילה סרום לנטרל את האנזים. הסר את כל הנוזל ותאי מהבקבוק ומכניסים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 (האצה 0 האטה 0) במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. לשאוב supernaתאי tant ו resuspend BEGM + P / S בהיקף הנדרש הצלוחיות החדשות (4 מיליליטר עבור בקבוק T25, 10 מיליליטר עבור בקבוק T75) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ספירת תאים עם כתם חי / מת כפי שתואר לעיל (2.1). הוספת הכמות מתאימה של BEGM ותאי כדי הצלוחיות המצופות ולחזור אל האינקובטור. לשמור כמפורט לעיל או cryopreserve מקפיא בינוני (70% BEGM, 20% FBS ו 10% DMSO) בריכוז של 0.5-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. </li></ol> 6. תכנות מחדש כדי iPSCs הערה: לפני יצירת iPSCs, לפקח על קיום כל התקנות המוסדיות המסדירות את הדור ושימוש iPSCs אדם. טכניקת סטרילית חשובה במיוחד עבור תרבויות iPSC, כמדיום תרבות אינו מכיל אנטיביוטיקה באופן שגרתי. זה קריטי, כי NECs נראה בריא והם שגשוג וחסון לתכנות מחדש מוצלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 5 x 10 5 NECs לכל גם צלחת בתרבית רקמה 6 היטב. לאחר 24 שעות, להוסיף polybreneכדי BEGM לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו transduce NECs ידי הוספת חלקיקים lentiviral להביע Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc לתקשורת. שואפים להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של ~ 5 27. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי קביעת משרד הפנים, להכין דילולים סידוריים של המניות המרוכזות-lentiviral ו transduce HT1080 תאים עם דילולים אלה. לאחר זיהוי הראשון באופן חד משמע ביטוי dTomato בתאי HT1080, לחשב את המספר &quot;יחידות transducing / מיליליטר&quot; כשקלע את מספר תאי dTomato החיובי / גושים קטנים של תאים כל דילול. הערה: בדרך כלל, תהיה דילולים כי הן גבוהות מדי (הכל dTomato חיובי) ו נמוך מדי (ללא או רק כמה תאים חיוביים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניקוד הדילולים שבו נבדלו תאים חיוביים / גושים קטנים של תאים מזוהים. לקבוע את כייל על ידי תיקון מספר transducing מ&quot;ל / יחידות עם גורם לדילול המתאים. משרד הפנים הוא אזי היחס בין מספרשל transduced תאים למספר חלקיקי הנגיף 27. הערה: כל תא dTomato החיובי / גוש קטן מניחה לנבוע חלקיק וירוס אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -3 שעות-שלאחר התמר, להסיר תקשורת ולהחליף עם BEGM הטרי. מחק תקשורת lentivirus המכיל באמצעות נהלים שאושרו מוסדי. חזור NECs transduced אל האינקובטור במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להחליף תקשורת עם BEGM הטרי, ולאחר מכן דגירה במשך 3 ימים נוספים. לשאוב בילה התקשורת, לשטוף תאים עם 1x PBS ולהוסיף 1 מ&quot;ל 0.05% פתרון טריפסין אל הבאר. תאי מעבר עם טריפסין כפי שנכתב לעיל (סעיף 5). בזהירות לשאוב תאים supernatant ו resuspend ב 4 מ&quot;ל BEGM + P / S. תאים יכולים להיות passaged כדי באר חדשה של צלחת 6 היטב מצופית BDC, או הוסיפו לתרבויות MEF, אם מוכן (ראו השלב הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות מצופות MEF. ביום 4 להוסיף פתרון ג&#39;לטין 0.1% (1 מ&quot;ל / טוב) 2 הבארות של 6 היטב (כדי לבצע +/- Thiazovivin (SPT) ראה שלב 6.6). על הבאיום, להפשיר בקבוקון של MEFs מומת 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים MEFs לתוך 10 מ&quot;ל של התקשורת MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). ספין על XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה. גלולה בתקשורת MEF. ג&#39;לטין לשאוב מהצלחת 6 היטב ומוסיפים 1.87 x 10 5 MEFs לכל גם צלחת 6 היטב מצופה ג&#39;לטין. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, או למשך תקופה מינימלית של 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של BEGM מכילים transduced תאים לכל גם לתוך 2 בארות צלחת 6 מצופה בעבר היטב דגירה O / N. ביום למחרת, להחליף BEGM עם 2.5 מ&quot;ל לכל טוב של התקשורת תקן hESC המכיל 4 ng / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי מ&quot;ל. Feed תאים עם התקשורת hESC טרי +/- SPT יומי במשך 10 ימים הערה: אפשר להוסיף קוקטייל של מולקולות קטנות (SB431542, PD0325901, ו Thiazovivin (SPT) קוקטייל) כדי לשפר את היעילות ואת קינטיקה של תכנות מחדש עבור NECs 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עשרה ימים, להמשיך להאכיל יומי באמצעות התקשורת hESC ללא SPT. Feed תרבויות יומיים עד מושבות hESC הדמוילהופיע (איור 5 א, המושבה P0). זיהוי מושבות מחסה iPSCs המשוערת על ידי הגרעין הגבוה שלהם: יחס cytoplasmic ו nucleoli הבולט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות בלו והעברה ידניות עם מורפולוגיה hESC הדמוי להפריד בארות לתרבות והרחבה כקווים נפרדים במערכת מזין חינם. מושבות ניכרות צריכות להסתגל במהירות לתנאים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מושבות ציפוי ניכר קווי iPSC המשוערים הדיסקרטיים אלה נחשבים כיום מעבר 1 (P1). תרבויות עדכונים יומיים עם mTeSR1. מעבר ולהרחיב קווי iPSC באמצעות נהלים סטנדרטיים. זה עלול לקחת מספר ימים עד שבוע עבור מושבות p1 להגיע לגודל שבו הם צריכים להיות passaged. </li></ol></li></ol> 7. שימור iPSCs בתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Feed ולהעריך תרבויות יומיות. ידני באזורי בלו מפגינים בידול גלוי על ידי גירוד עם טפטף זכוכית סטרילית או קצה פיפטה מיקרו. שינוי תקשורת לאחר קטיף יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים לאחר approximately כל ארבעה ימים: בעדינות התקשורת לשאוב, להוסיף 1 מ&quot;ל Dispase חם (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל היטב צלחת 6-היטב (חצי נפח האכלה), ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך כ -4 דקות. הקצוות של המושבות יתחילו להרים, אשר נראה כמו מתווה לבן ברחבי המושבה. בעדינות לשאוב Dispase ולשטוף 3x עם חימם DMEM / F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל mTeSR1 ולהשתמש מרים תא להרים את מושבות מהצלחת. השתמש פיפטה 5 מ&quot;ל סרולוגית או micropipette P1000 כדי triturate התאים בעדינות עד מושבות מחולקות לאשכולות קטנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע לייצר אשכולות קטנים מאוד או תאים בודדים, כמו התפשטות הישרדות עוקבת תהיה תת-אופטימלית. כאשר מחדש ציפוי מושבות, 1: 4 ל -1: 6 פיצול ישמור צפיפות מושבה אופטימלית. הוצא בעדינות מושבות תקשורת מהצלחת ולהוסיף חדשות, בארות מצופות matrigel. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

תאי אפיתל האף (NECs) מהווים פלטפורמה נגישה ללימוד מחלות דרכי הנשימה, ו- NEC-iPSCs להציע דרך מרגשת לחקור את התפתחות המחלה, טיפול ותרפיה 1,31,32. NECs ניתן להשיג בקלות ללא 6,23 נהלים מלחיצים או מזיקים. מניסיוננו, הדגימה של רירית האף כמתואר בפרוטוקול זה נראה פחות מלחיץ נתפס ...

תאי גזע מושרים ממדגם אדם (hiPSCs) הם טכנולוגיה לפיתוח מהיר של חקר תאי גזע. הם מציעים אלטרנטיבת תאי גזע עובריים (hESC) מחקר עם הרבה פחות 1,2 חסרונות אתיים ומוסריים. למרות שהם אינם זהים epigenetically כדי hESCs 3-5, hiPSCs מציע דרך ייחודית לבנות מודל פנוטיפים התפתחות ומחלות, והם יכולים לנבוע רקמות רלוונטיות למצב המחלה 5-8. שיטות חדשות של hiPSCs יצירת נבדקות ללא הרף כדי לזהות סוגי תאים אופטימלי להתחיל עם, כדרך להכין iPSCs GMP באיכות מתאימה להשתלה, וגם להגדיל את העיתוי ואת היעילות של תהליך תכנות מחדש 6,9-11. תאי אפיתל דרכי נשימה הם קריטיים בהתפתחות דלקת אלרגית 12, ו האפיתל הוא נהג עיקרי של תגובות אלרגיות שיפוץ דרך נשימה באמצעות אינטראקציה עם immunתאי דואר סטרומה. אפיתל דרכי הנשימה ממלאת תפקיד חיוני מהמוצא וההתמדה של מחלות ריאה כגון אסטמה. עם זאת, תאי אפיתל דרכי נשימה תחתונה קשים להשיג במסגרת רפואית, במיוחד מחולים וילדי ביקורת בריאים. נתונים ממחקרים כמה תומכי ההנחה כי תאי אפיתל מן רירית אף הם פרוקסי תקף ומעשי עבור תאי אפיתל דרכי נשימה נמוכה 13-20, במיוחד כאשר לומדים תגובות מזהמי אוויר אלרגנים. רירית האף מורכבת יותר מ -90% דרך נשימה ריסי בתאי אפיתל דגימה לתאי האפיתל אף אלה (NECs) יכולה להתבצע בקלות אצל ילדים צעירים כמו גיל ארבעה או חמש, כפי שהוא פחות פולשנית מאשר טכניקות דגימת תא / רקמה אחרות והוא קשור לסיכון מינימאלי של תופעות לוואי כגון זיהום 20-23. הוא מציע דרך מהירה ופשוטה לדגום שני ילדים בריאים וחולים ללא ארוכה, מיותר, ולעתים קרובות procedu ברונכוסקופיה הכואבמיל מחייבי הרגעה. מחקרים קודמים מצאו כי תת המחלה קשורה חומרת האסתמה ניתן להבחין הן רירית האף, כמו גם דגימות תאים הסימפונות שנלקחו ילדים אסתמטיים, ביטוי גנים בין שני סוגי רקמות היה דומה כ -90% מהגנים הלא בכל מקום 22 , 24. כמקור iPSCs, NECs להציע יתרונות על פני סוגי תאים אחרים מנוצל לעיתים קרובות. פיברובלסטים משמשים לעתים קרובות דור iPSC, אבל למרות תאים אלה יכולים להיות מתורבתים בקלות מתוך ביופסיה של עור, תהליך זה בדרך כלל דורש הרדמה מקומית, חתך, ותפרים, והיא קשורה עם סיכון מסוים של זיהום. לכן השיג הסכמה מדעת מחולים עבור סוג זה של ביופסיה יכולה להיות קשה 25. חלופה אחת כדי פיברובלסטים היא תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs). עם זאת, זה יכול להיות קשה להשיג דם מספק עבור דור iPSC מחול ילדים. בנוסף, קיימות מגבלות של ap במורד הזרםplications עבור פיברובלסטים iPSCs דם תא נגזר, במיוחד קיבולת הבידול שלהם סוגי תאים מסוימים 5,26. לכן, בהתחשב הנגישות היחסית ואת הסיכון הנמוך של תופעות לוואי בעקבות בגבייתם NECs מהווה מקור תא אידיאלי עבור דור iPSC מאוכלוסיות ילדים. iPSCs קיבלו הרבה תשומת לב לאחרונה כפלטפורמה ללימוד ההתפתחות האנושית, יצירת מודלים המחלה רומן, כמקור פוטנציאלי של תאים עבור טיפולים אישית. לפני את מלוא הפוטנציאל של הטכנולוגיה הזו יכולה להתממש, את הבסיס המולקולרי של תהליך תכנות מחדש צריך להיות הובהר, אך לעת עתה פרוטוקול זה ואת הנהלים המפורטים בתוך יבהיר את המחקרים התמקדו חשיפות דרכי הנשימה, כמו גם לספק פלטפורמה לומד את ההשפעות של טיפול תרופתי אישי המעורב iPSCs. העבודה השיתופית של מספר מעבדות הובילה generation של טכניקה מוצלחת לא רק דגימה של רירית האף, אבל גם culturing NECs, ו תכנות מחדש של תאים אלה iPSCs 23. מאמר זה מספק תיאור של פרוטוקול דגימה אופטימלית, culturing, ותנאי תכנות מחדש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">15mL conical</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">14-959-49D</td>
			<td style="width:139px;">Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">BEGM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td>Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Penn/Strep/Fungicide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Penn/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Protocol Step 4.a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cytosoft cytology brush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-263-357</td>
			<td>Protocol Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>Protocol Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>Protocol Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2438-4</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cytology Funnel Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cytospin funnel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-640-320</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cytospin 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">blank slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S95933</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hema 3 stain kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Bovine Dermal Colagen, type 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>Protocol Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">T25 flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-45</td>
			<td>Protocol Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Protocol Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td>Protocol Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:207px;">Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65&#176;C for 30min</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Protocol Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:207px;">Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&#8482;, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, &#8805;99.7% -&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Protocol Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">polycistonic lentivirus*</td>
			<td>e.g. Millipore</td>
			<td>SCR511</td>
			<td>Protocol Step 6.4.&#160; 
			A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td>Protocol Step 6.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Irradiated CF1 MEFs</td>
			<td>GlobalStem&#160;</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>Protocol Step 6.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hESC media</td>
			<td>See recipe included in protocol</td>
			<td></td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Thiazovivin&#160;</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Corning plate, 6 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">mTeSR1</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5850</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">250mL disposable filter flask (0.22&#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SCGP-U02-RE&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7923</td>
			<td>Protocol Step 7.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Protocol Step 7.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td>Protocol Step 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hESC Media**</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protocol Step 6.11. 
			components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4&#176;C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37&#176;C longer than 15 min</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:207px;">DMEM-F12 50/50 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11330-032</td>
			<td>Final Concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">KO replacement serum (KO-SR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td align="right">0.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">200mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">55mM &#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">100x non-essential amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>4ng/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

החלק הראשוני של האף, שנקרא פרוזדור האף, הוא האזור המוקף סחוס 29. המברשת צריכה ללכת בצורה חלקה בעבר באזור זה של האף, מעבר שסתום האף (ostium internum, או &quot;חור השחור&quot; לראות בחלק האחורי של Nare), ואת המדגם המתקבל חלזוני הנח (איור 1). Turbinates האף הם מבנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Views.  Cincinnati Children's Hospital. This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Video: Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...