저자는 다 능성 줄기 세포 시설 신시내티 아동 병원에서 공 촛점 이미징 코어를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) 및 2U19AI70235 (GKKH)에 의해 지원되었다.

다음 프로토콜은 기관 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 1. 코 점막을 샘플링 참고 : 호흡기 바이러스 감염의 흔적이없는 피사체에서 샘플을 얻습니다. <ol><li> 참가자 방문하기 전에 15 ML 원뿔 신선한를 준비하고 2 ml의 BEGM (기관지 상피 세포 성장 배지) 플러스 20 ㎕를 멸균 펜 / 패 혈성 / Fungizone (P / S / F) (0.01 %)를 추가합니다. </li><li> 열기 세포학 단지 샘플을 복용하기 전에 브러시 및 살균 브러시를 유지해야하고, 코 표면 이외의 모든 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 가만히 앉아 천장을 향해 머리를 기울 참가자를 요청합니다. 작은이 이상 불안 아이들은 그들의 손에 앉아 및 / 또는 멀리 브러시를 때리는 등 모욕적 피하기 위해 누워. </li><li> 통로가 좁아 (작은 블랙홀처럼 보이는) 코의 뒤쪽에 브러시를 목표로하고 있습니다. 아래로 브러시를 밀어 브러시가 nostri에서 제거 될 때 손목을 비틀엘. </li><li> 원뿔에서 브러시를 놓고 BEGM에 잠수함. 여분의 브러쉬를 잘라 튜브에 뚜껑을 교체합니다. VORTEX하지 않습니다. 주 : 참가자 용의 경우와 동일한 방식으로했지만 제 콧 구멍에 제 브러쉬 얻었다. 양쪽 콧 구멍의 칫솔질을 얻는 것은 샘플링이 성공하는 높은 가능성이 발생합니다. 같은 콧 구멍을 샘플링 출혈이 발생할 수 가능성 샘플을 향상되지 않습니다. </li><li> 따뜻한 물로 비이커를 사용하여 운송 중 가능한 37 ° C에 가까운 샘플을 보관하십시오. </li></ol> 2. 세포 수와 Cytospin <ol><li> 부드럽게 BEGM에 브러시를 교반하고 hemacytometer를 사용하여 세포 수의 샘플 10 μL를 취할. 라이브 / 죽은 얼룩의 10 μl를 추가 만 현미경으로 세포를 살고 계산합니다. </li><li> 샘플의 50 μl를 타고 1X PBS 200 μL에 희석. 2 분 동안 300 rpm에서 유리 슬라이드와 스핀에 부착 cytospin 깔때기에 추가합니다. 따라와 건조 O / N 및 얼룩 슬라이드를 밀어 보자g 제조업체의 지침. 바람직하게는 어둠 속에서, O / N을 건조하도록 허용합니다. </li><li> 헤마 3 얼룩 얼룩 슬라이드 <ol><li> 각 솔루션 (; 헤마 3 솔루션 I, 핑크, 헤마 정착액, 밝은 파란색과 헤마 3 솔루션 II, 푸른 깊이)로 이동시켜 염색 접시에; 사용하지 않을 때는 커버하십시오. 슬라이드 염색 보트에 슬라이드를 삽입 </li><li> 딥 슬라이드는 지속적으로 30 초 동안 정착에 다음 과잉 배출 할 수 있습니다. 딥 내가 30 초 동안, 다음 과잉 배출 할 수 있도록 솔루션에 지속적으로 슬라이드. 딥은 과잉 배출 할 수 있도록 30 초 동안 지속적으로 솔루션 II에 슬라이드 </li><li> 물이 맑은 실행까지 탈 이온수로 씻어. 어둠 속에서 바람직하게는, O / N을 건조하도록 허용 </li></ol></li><li> 상피 세포의 비율을 결정, 현미경 카운트 세포에서 슬라이드 봐. 샘플링이 좋은 경우 90 % 이상이어야합니다. </li></ol> 3. 시드 셀 주 : 적절한 인증 조직 문화의 모든 세포 배양 과정을 수행후드 무균 기술을 사용. <ol><li> 소 피부 콜라겐 (BDC)와 코트 판, 유형 1. 49.5 ㎖의 1X PBS에 희석 3 ㎎ / ㎖ BDC의 0.5 ML을 추가합니다. 몇 판을 사용할 경우 더 적은을 준비합니다. 코트 2 시간 동안 37 ° C에서 T25의 2 ml의 BDC와 플라스크 및 멸균 후드 O에 품어 / N 또는 필요한 경우. </li><li> 배양 후, 남아있는 액체를 대기음. 멸균 후드에서 30 분 동안 자외선에 플라스크를 노출. 하지만 1 개월까지 4 °에서 C에 대한 저장소 플라스크, 세포를 파종하기 전에 C를 RT로 가져 또는 37 °. </li><li> 시드 할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 BEGM에 브러시와 세포를 유지합니다. 조심스럽게 휙 원뿔 내부 브러시,하지만 소용돌이하지 않습니다. <ol><li> 플레이트 T25 플라스크에 7 × 10 5 세포. 이하이 있으면 작은 컨테이너 6 웰 플레이트 중 하나와 같은 잘 사용한다. 이 크기의 플레이트는 약 3 × 10 5 세포를 필요로한다. 참고 :이 많은 세포가없는 경우, 계속하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 멸균 후드 아래, 튜브 및 GE에서 브러시을ntly 코팅이 긁히지 않도록주의하면서, 코팅 된 플라스크의 표면에 브러시를 회전 할 수 있습니다. 적절한 생물 학적 용기에 브러시를 폐기하십시오. </li><li> 천천히 원뿔에서 그리고 T25 플라스크에 BEGM에 남아있는 세포를 피펫. 현미경으로 세포를 관찰한다. 부유 세포의 숫자가 관찰되며이 단계 (도 3a)에서 허용되는 코 일부 파편이있을 수있다. </li></ol> 4. 세포 배양 <ol><li> 세포를 파종 한 후,이를 중단없이 48 시간 (그림 3)에 안주 할 수 있습니다. 48 시간 후, 천천히 그리고 부드럽게 2 ml의 따뜻한 BEGM 및 무균 페니실린 / 스트렙토 마이신 / Fungizone (P / S / F) 20 μl를 추가합니다. 참고 : 미디어의 원래 2 ml에 대기음하지 마십시오. </li><li> 파종 후 4 번째 날, 신중하게 모든 액체를 대기음, 신선한 4 ㎖로 교체 BEGM 플러스 1X 펜 / 연쇄상 구균이 (fungizone가 더 이상 필요하지 않습니다) 가온. 이틀 미디어를 변경하고 연결에 대한 세포를 평가, 표준, 성장과 합류. 세포에 도달하면 ~ 80 %의 합류, 일반적으로 2-3 주 내에, 그들은 계대 할 준비가 된 것입니다. </li><li> 하나 T25 플라스크 (약 2.5 × 10 6 세포 때 합류) 세 T25 플라스크 또는 1 T75 플라스크에 계대 수 있습니다. 제 1 통로 후, 세포는 약 3 일 합류에게 도달 튼튼하고 건강해야한다. </li></ol> 5.과 Passaging 세포 <ol><li> 부드럽게 접시에서 미디어를 대기음. 약 4 분 동안 인큐베이터에있는 접시와 장소 T25 플라스크 당 1 ml의 0.05 % 트립신 솔루션을 추가하거나 세포를 플레이트에서 분리 될 때까지. 세포마다 2 분의 분리의 수준을 확인하고 이상 10 분에 트립신을 두지 마십시오. </li><li> 효소를 중화 5 ㎖의 트립신 중화 솔루션 (TNS), 또는 혈청 함유 미디어를 추가합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 플라스크 장소에서 모든 액체 및 세포를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG (감속 가속도 0 0)에서 원심 분리 세포 펠렛을 얻었다. 기음 superna새로운 플라스크에 필요한 볼륨 S BEGM에서 + P / 중대장과에 resuspend 세포 (T75 플라스크에 대한 T25 플라스크 4 ml의 10 ㎖) </li><li> (2.1) 전술 한 바와 같이 라이브 / 죽은 얼룩 세포 수를 수행합니다. 코팅 된 플라스크에 BEGM 세포의 적절한 금액을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 상기 상세한 유지 또는 용액 당 0.5 × 106 세포의 농도로 배지 (70 % BEGM, 20 % FBS와 10 % DMSO)를 동결 cryopreserve. </li></ol> iPSCs 6. 재 프로그래밍 참고 : iPSCs를 생성하기 전에 생성과 인간 iPSCs의 사용을 규제하는 모든 기관 규정 준수를 보장합니다. 배양 배지는 통상적으로 항생제를 함유하지 않는 멸균 기술은 IPSC 배양에 특히 중요하다. NECs 건강 표시하고 견고 성공적인 프로그래밍에 대한 증식있는 것이 중요합니다. <ol><li> 판 6 잘 조직 배양 플레이트의 웰 당 5 × 10 5 NECs. 24 시간 후, 폴리 브렌 추가BEGM에 매체 인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 발현 렌티 바이러스 입자를 첨가하여 8 μg의 / ㎖ 및 형질 도입 NECs 최종 농도. 5 ~ 27의 감염 (MOI)의 다양성을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다. <ol><li> MOI를 결정하는 것과, 농축 - 렌티 바이러스 스톡의 희석액을 제조하고 이들로 희석 HT1080 세포를 형질 도입. HT1080 세포에서 발현 dTomato 제 명백하게 검출 후 dTomato 양성 세포 / 희석 각 셀의 작은 덩어​​리의 수를 기록하여 &quot;형질 도입 단위 용액 /&quot;의 수를 계산한다. 참고 : 일반적으로 너무 높은 희석 (모든 dTomato 긍정적이다) 너무 낮은 (없음 또는 양성 세포의 커플)이있을 것이다. </li><li> 세포의 분리 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 확인되는 희석에서 득점을 수행합니다. 적절한 희석 인자 단위 / ㎖ 열 변환 수를 보정함으로써 역가를 결정한다. MOI는 수의 비율의 바이러스 입자 (27)의 수를 셀 형질. 참고 : 각 dTomato 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 하나의 바이러스 입자에서 발생하는 가정한다. </li></ol></li><li> 약 3 시간 후 전달 매체를 제거하고 신선한 BEGM로 교체합니다. 제도적 승인 절차를 사용하여 렌티 바이러스 함유 미디어를 폐기하십시오. 3 일간 인큐베이터에 형질 NECs를 돌려줍니다. </li><li> 3 일에, 신선한 BEGM와 미디어를 교체 한 다음 다른 3 일간 배양한다. 기음 미디어는 1X PBS로 세포를 씻어 잘 1 ml를 0.05 % 트립신 솔루션을 추가 보냈다. 트립신과 통로 세포 (섹션 5) 위의 기록으로. 조심스럽게 4 ml의 BEGM + P / S에 뜨는 및에 resuspend 세포를 대기음. 세포를 준비하는 경우 (다음 단계 참조) BDC 코팅 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 계대 또는 MEF 배양에 첨가 될 수있다. </li><li> MEF 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 4 일에 () +/- Thiazovivin (SPT를 수행 단계 6.6를 참조)도 6의 2 웰 (1 ㎖ / 잘) 0.1 % 젤라틴 용액을 추가합니다. 다음에하루는 불 활성화 MEFs에 28 병을 해동. </li><li> MEF 미디어 (DMEM + 1 배 NEAA + 10 % DFCS) 10 ㎖로 MEFs에 배치합니다. 5 분 200 XG에 스핀 펠렛합니다. MEF 미디어를 Resuspend. 대기음 6 웰 플레이트에서 젤라틴과 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트의 웰 당 1.87 × 10 5 MEFs에 추가합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어, 또는 24 시간의 최소. </li><li> BEGM의 양도 2 ㎖를 이전에 코팅 된 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 당 세포를 형질 도입 및 / N을 O를 품어 함유. 다음날 4 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 함유하는 표준 hESC의 미디어 웰 당 2.5 ㎖로 교체 BEGM. 신선한 hESC의 매체와 세포를 공급 +/- SPT를 매일 10 일 동안 참고 : NECs (23)에 대한 효율성과 프로그래밍의 반응 속도를 향상시키기 위해 작은 분자 (SB431542, PD0325901 및 Thiazovivin (SPT) 칵테일)의 칵테일을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 십일 후, SPT없이 hESC의 미디어를 사용하여 매일 먹이를 계속합니다. hESC의 같은 식민지 때까지 매일 문화를 피드(그림 5A, P0 식민지)를 나타납니다. 세포질 비와 눈에 띄는 핵소체 : 높은 핵으로 추정 iPSCs을 품고 식민지를 확인합니다. </li><li> hESC의 같은 형태를 가진 수동 소비세 및 전송 식민지 공급 장치가없는 시스템에서 별도의 선으로 문화와 확​​장을 위해 우물을 분리합니다. 절제 식민지는 이러한 조건에 빠르게 적응해야한다. <ol><li> 도금 절제 식민지 후이 이산 추정 IPSC 라인은 지금 통로 1 (P1)으로 간주됩니다. 매일 mTeSR1와 피드 문화. 통로 및 표준 절차를 사용하여 IPSC 라인을 확장합니다. P1의 식민지들은 계대되어야하는 크기에 도달하는 것은 일주일에 며칠이 걸릴 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 7. 문화 iPSCs 유지 <ol><li> 피드 및 일일 문화를 평가합니다. 수동 소비세 지역은 멸균 유리 피펫 또는 마이크로 피펫 팁으로 긁어에 의해 명백한 차별화를 전시. 매일 수확 후 미디어를 변경합니다. </li><li> 통로 세포 approxima 후tely 4 일마다 : 부드럽게 흡인 미디어, 6 웰 플레이트 (하프 공급 볼륨)의 웰 당 1 ml의 따뜻한 스파 아제 (Dispase) (1 ㎎ / ㎖)을 추가 한 후 약 4 분 동안 37 ° C에서 품어. 식민지의 가장자리는 식민지 주위에 흰색 테두리처럼 보이는, 리프트 시작합니다. 조심스럽게 스파 아제 (Dispase)를 대기음 및 예열 DMEM / F12와 함께 배를 씻는다. </li><li> 2 ml의 mTeSR1를 추가하고 판에서 식민지를 들어 올릴 셀 리프터를 사용합니다. 식민지가 작은 클러스터로 분할 될 때까지 부드럽게 세포를 씹다에 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 또는 P1000의 마이크로 피펫을 사용합니다. <ol><li> 생존 후속 증식 차선 바와 같이, 매우 작은 클러스터 또는 단일 셀의 제조 피. 콜로니를 다시 도금하면, 1 : 4 내지 1 : 6 분할 최적 콜로니 밀도를 유지한다. 부드럽게 판에서 식민지와 미디어를 제거하고 새로운, 마트 리겔 코팅 된 웰에 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

코 점막 상피 세포 (NECs)는기도 질환 연구를위한 액세스 플랫폼, 그리고 NEC-iPSCs 질병 개발, 치료 및 치료 1,31,32을 탐구하는 흥미로운 수단을 제공합니다. NECs 쉽게 스트레스 또는 잠재적으로 유해한 절차 6,23없이 얻을 수있다. 우리의 경험에 의하면,이 프로토콜에 설명 된대로 코 점막의 샘플링은 스트레스를 덜하고 더 나은 어린이를위한 채혈보다 인식이 나타납니다. 따라서,이 방...

인간의 샘플 (hiPSCs)에서 유도 만능 줄기 세포는 줄기 세포 연구의 빠른 개발 기술입니다. 그들은 훨씬 적은 윤리적, 도덕적 결점의 1, 2와 배아 줄기 세포 (hESC의) 연구에 대한 대안을 제공합니다. 그들은 hESCs는 3-5 성적으로 동일하지 않지만, hiPSCs 개발 및 질환 표현형을 모델링하는 독특한 방법을 제공하고이 질환 상태와 관련 5-8 조직 유래 될 수있다. 생성 hiPSCs 새로운 방법을 끊임없이 이식에 적합한 GMP 품질 iPSCs을 제조하고, 또한 리 프로그래밍 프로세스 6,9-11의 적시성 및 효율성을 증가시키는 방법으로, 시작하는 최적의 세포 유형을 식별하기 위해 탐색되고있다. 기도 상피 세포 알레르기 성 염증 (12)의 개발에 중요하며, 상피 immun와 상호 작용을 통해 알레르기 반응과기도 개형의 중요한 드라이버 인전자와 기질 세포. 기도 상피 기원과 천식과 같은 폐 질환의 지속성에 필수적인 역할을한다. 그러나, 낮은기도 상피 세포, 특히 건강 관리 환자와 어린이, 임상에서 얻을하기가 어렵습니다. 대기 오염 물질과 알레르기 항원에 대한 반응을 연구, 특히 여러 연구의 데이터는, 코 점막의 상피 세포가 낮은기도 상피 세포 13-20에 대한 유효하고 실질적인 프록시 있다는 전제를 지원합니다. 코 점막은 90 % 이상 섬모기도 상피 세포로 구성하고 다른 세포 / 조직 샘플링 기술보다 덜 침습적이고 같이이 코 점막 상피 세포 (NECs)를 샘플링하는 것은 쉽게, 연령 네다섯 한 어린 아이에서 수행 될 수있다 감염 20-23과 같은 부작용의 위험을 최소화과 관련. 그것은 긴 불필요한, ​​종종 고통스러운 기관지의 procedu없이 건강하고 병에 걸린 어린이 모두를 샘플링 할 수있는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다진정 작용을 필요로 입술. 이전의 연구는 천식 심각도 습관병 아형 비점막뿐만 아니라 천식 어린이로부터 취한 기관지 세포 샘플 모두에서 구별 될 수 있음을 발견하고, 두 조직 유형 간의 유전자 발현은 비 편재 유전자 (22)의 약 90 %에서 유사 24. iPSCs의 소스로, NECs 다른 자주 사용되는 세포 유형을 통해 이점을 제공합니다. 섬유 아세포는 종종 IPSC 생성을 위해 사용되지만, 이들 세포를 쉽게 피부 생검에서 배양 될 수 있지만,이 프로세스는 일반적으로 국소 마취, 절개 봉합을 필요로하고, 감염 될 위험과 관련된다. 따라서, 생검이 유형의 환자의 동의를 얻는 것은 25 어려울 수 있습니다. 섬유 아세포에 대한 한 대안은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 그러나, 소아에서 IPSC 생성을위한 충분한 혈액을 얻는 것이 어려울 수있다. 또한, 다운 스트림 액세스 포인트의 제한이있다섬유 아세포 및 혈액 세포 유래 iPSCs, 특정 세포 유형 5,26 특히 분화 능력에 대한 plications. 따라서, 상대의 접근성 및 컬렉션 다음 부작용의 낮은 위험을 주어 NECs 소아 인구에서 IPSC 생성을위한 이상적인 셀 소스를 나타낸다. iPSCs 소설 질병 모델을 인간 개발 연구 생성 플랫폼으로 최근에 많은 주목을 받아 맞춤 치료를위한 세포의 잠재적 인 소스로했다. 이 기술의 잠재력이 실현 될 수 있기 전에, 프로그래밍 과정의 분자 토대가 설명 될 필요가 있지만, 지금이 프로토콜 내에서 설명 된 절차를기도 노출에 집중 조사 연구 해명 것임은 물론위한 플랫폼을 제공하는 iPSCs 관련된 개인화 된 의약품의 효과를 연구. 여러 연구소의 공동 작업은 generatio하게되었다코 점막을 샘플링뿐만 아니라, NECs를 배양하고, iPSCs (23)이 세포를 재 프로그램뿐만 아니라에 대한 성공적인 기술의 N. 이 문서에서는 최적의 샘플링, 배양 및 프로그래밍 환경을위한 프로토콜의 개요를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">15mL conical</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">14-959-49D</td>
			<td style="width:139px;">Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">BEGM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td>Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Penn/Strep/Fungicide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Penn/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Protocol Step 4.a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cytosoft cytology brush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-263-357</td>
			<td>Protocol Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>Protocol Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>Protocol Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2438-4</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cytology Funnel Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cytospin funnel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-640-320</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cytospin 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">blank slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S95933</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hema 3 stain kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Bovine Dermal Colagen, type 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>Protocol Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">T25 flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-45</td>
			<td>Protocol Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Protocol Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td>Protocol Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:207px;">Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65&#176;C for 30min</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Protocol Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:207px;">Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&#8482;, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, &#8805;99.7% -&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Protocol Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">polycistonic lentivirus*</td>
			<td>e.g. Millipore</td>
			<td>SCR511</td>
			<td>Protocol Step 6.4.&#160; 
			A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td>Protocol Step 6.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Irradiated CF1 MEFs</td>
			<td>GlobalStem&#160;</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>Protocol Step 6.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hESC media</td>
			<td>See recipe included in protocol</td>
			<td></td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Thiazovivin&#160;</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Corning plate, 6 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">mTeSR1</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5850</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">250mL disposable filter flask (0.22&#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SCGP-U02-RE&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7923</td>
			<td>Protocol Step 7.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Protocol Step 7.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td>Protocol Step 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hESC Media**</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protocol Step 6.11. 
			components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4&#176;C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37&#176;C longer than 15 min</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:207px;">DMEM-F12 50/50 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11330-032</td>
			<td>Final Concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">KO replacement serum (KO-SR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td align="right">0.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">200mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">55mM &#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">100x non-essential amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>4ng/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

코 전정 불리는 코 초기 부분, 연골 조직 (29)으로 둘러싸인 영역이다. 브러쉬 코 밸브 (소공의 internum 또는 비공 뒷면에서 본 &quot;블랙홀&quot;) 이상, 코이 영역을지나 원활하게 진행해야하고, 시료 비갑개 (도 1)로부터 얻어진다. 비강 비갑개은 코 (29)의 표면적을 증가 샘플링 그들에게 최적 위치를 결정 뼈 구조이다. 이 지역은 또한 밀접하게 하...

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Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K 조회수.  Cincinnati Children's Hospital. This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

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Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

연구

발생학

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...