המחברים מבקשים בחביבות להודות לד&quot;ר י&#39;לותר ק Ubieta להכנת הנתונים וד&quot;ר ב Grötsch להגהה את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-אמי נתר).

<ol>
	<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+function,+type+2+diabetes,+and+metabolism+in+aging.">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482 (2012).</li><li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome.">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li><li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases.">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008 (2013).</li><li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+fat+expansion.">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li><li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots;+implications+for+pathophysiology+or+therapy.">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li><li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy.">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li><li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fra-2/AP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia.">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li><li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein:+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer.">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li><li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism.">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li><li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction.">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li><li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+(Cre-ERT2)+in+adipocytes.">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li><li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin.">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li><li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+(C57BL/6J+versus+FVB/N)+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob/ob+mice.">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells:+physiological+and+therapeutic+perspectives.">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity.">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li><li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model.">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747 (2013).</li><li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding.">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li><li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet.">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance.">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue.">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li><li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF/LIF-receptor+signalling+and+hypoxia.">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li><li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pimonidazole:+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma.">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li><li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability.">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li><li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death.">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li><li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool.">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li><li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation.">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia:+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem/progenitor+cells.">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).</li><li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis.">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li><li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes.">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li><li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ.">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Adipocytes מאופיין phenotypically על ידי גודלם, מספרים באזור, חושף היפרפלזיה adipocyte ו היפרטרופיה, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מוגזם בשל יתר התזונה 5. אירועים אלה המוביל dysregulation חומצות שומן ו תסמונת המטבולית לאחר מכן הם גם קובעים של מסת שומן גדלה עם חילוף חומרים משומרים, אשר גם הוא המכונה רחב שומן &quot;בריא&quot;. לדוגמה, Kusminski et al. 21 הראו שעכברים עם התרחבות שומן מאסיבית להישאר בריאים מבחינה מטבולית, דבר המצביע על כך הרחבה שומן אינו קשור בהכרח התסמונת המטבולית ועליו להיות נחוש בקפידה כדי להעריך את המאפיינים של adipocytes. הרקמה השומנית (AT) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות חילוף החומרים בגוף. AT הוא האיבר הגדול ביותר האנדוקרינית שיכול להשפיע דיסליפידמיה, טרשת עורקים, היפראינסולינמיה והיפרגליקמיה 3. הערכת AT הומאוסטזיס ואת מ המולקולריתechanisms ויסות זה יכול לאפשר הבנה טובה יותר של הפרעות במערכת חילוף חומרים. לכן, לפרום את מנגנוני ויסות בידול adipocyte, גודל adipocyte ומסת כרית שומן יעזרו לפתח טיפול טיפולי חדש לטיפול בהפרעות להשמנה. שימוש in vivo ו שיטות במבחנה, אפשר לקבוע את התפקיד של השפעות מזון ביטוי גנים על בידול adipocyte ופעילות. כדי לקבוע את הומאוסטזיס AT, קביעת האיזון בין דיפרנציאציה adipocyte, התפשטות אפופטוזיס כפי שהוצע על ידי פרוטוקול שלנו חשובה כמו בניתוח מטבולית גלוקוז ואינסולין בתגובה 22-24. פרופיל ביטוי המנתח של גני המעורבים adipogenesis, lipogenesis, ליפוליזה, ספיגת חומצות שומן, היפוקסיה, אפופטוזיס ובחלוקה ב adipocytes העיקרי ו- AT הקרבי הוא שיטת תפוקה גבוהה לקבלת סקירה על הומאוסטזיס adipocyte וחוסר התפקוד האפשרי שלהם.יש לנתח מועמדים מעניינים נוספים ברמת החלבון על ידי כתם המערבי או מכתים immunohistological. כדי להשיג תוצאות אופטימליות באמצעות מערכת בזמן האמת PCR באמצעות צבעים לא-סימטרית cyanine, הריכוזים של cDNA בטווח שבין 1 ל 10 ng ועל ריכוזי פריימר האופטימליים הנעים בין 50 ל 900 ננומטר צריכים להיבדק כדי למזער הגברה ספציפית. הרכיבים הקריטיים הם פריימרים; עבור כל מחזור, עקומות ההיתוך צריך להיות מבוקרת בקפידה כדי להבטיח את הספציפיות, ובו בזמן למנוע היווצרות של הדימרים פריימר. לכן, באמצעות בקרה שלילית באות O H 2 במקום cDNA מומלץ. יתר על כן, צבעי cyanine לא-סימטרית מסחריים זמינים ניתנים תערובות מאסטר המכילים צבע הפניה פסיבי (כגון רוקס) לספק אות ייחוס פנימית. את cDNA האות מנורמל במהלך ניתוח הנתונים לאותות רוקס לתקן תנודות האות גם ל-כן. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון על מנת להקים gooמערכת ד qPCR היא הבחירה של גן המשק. עבור כל תנאי, גני משק כמה משמשים, למשל, HPRT, β-תקטין, GAPDH, β-2-MG או Hsp90. חלבוני HIF על מנת לייצב את תנאי חוסר חמצן הם רגולטורים בקביעה לא רק הישרדות adipocytes, אלא גם שינויים מטבוליים, כגון גלוקוז, סבילות לאינסולין ומטבוליזם שומנים 11,25,26. כדי לברר אזורים היפוקסי של כרית השומן, HIF-1α נקבע בקטעים ידי אימונוהיסטוכימיה. מאז חלבוני HIF מפורקים במהירות בתוך 5 עד 10 דקות בתנאי normoxic, ההליך ואת הקיבעון של כרית השומן לניתוח היסטולוגית יש פיקוח הדוק כדי למנוע זמן חביון. לכן, כדי להבטיח היפוקסיה לא רק באמצעות מכתים HIF, pimonidazole משמש לקביעת אזורים היפוקסי של AT. Pimonidazole הוא מסוגל להפיץ לרקמות, כפי שהוא כבר הוצג בעצמות 27, וביעילות לסמן אזורים היפוקסי באמצעות קשירה המכיל חלבונים תיאול ספציפי בתאי חוסר חמצן, אשר מזוהים יותר בסעיפים היסטולוגית על ידי נוגדנים ספציפיים מחייבים 28. עם זאת, סמנים ושיטות אחרים ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול היפוקסיה. לדוגמה, מעורבות של hydroxylase prolyl (PHD) אנזים, אשר לגרום hydroxylation של שאריות פרולין תחת normoxia, כמו גם את פון היפל-לינדאו (VHL) חלבון, אשר מכירים prolines hydroxylated וגם להביא את-ubiquitination פולי לתווך HIF proteasomal שפלה, צריכה להיות מנותחת עבור סקירה מלאה של 29,30 המסלול. יתר על כן, איתור בכל מקום של HIFs היה גם לקבוע את יציבות החלבון והשפלה שניתן לשנות 31,32. יתר על כן, התפשטות ידי Ki67 ו אפופטוזיס על ידי מכתים TUNEL נקבעים in vivo באמצעות מכתים סעיפים היסטולוגית AT. כימות של התפשטות ידי Ki67 וpoptosis ידי TUNEL או Annexin מכתים V באמצעות ניתוח תזרים cytometry מתבצעת גם 33. הפצת נשק יכול כמובן להיות נמדדת טכניקות אחרות כגון ניתוחים של מחזור התא adipocyte, אשר אינה מקבלת מענה מדידת תאים חיוביים Ki67. יתר על כן, מחקר אפופטוזיס על ידי TUNEL ניתן להשלים על ידי FACS המנתח של V Annexin ו TOP-PR-3 אשר יקבע את הרמות של נימק מול תהליך המוות של תאי אפופטוזיס. אפופטוזיס הוא תהליך בסיסי עבור התוכנית של מוות של תאים, שהינה חשובה הומאוסטזיס AT. אכן, חוסר וויסות של אפופטוזיס adipocyte היה מעורב בעבר בתהליכי תורם להשמנה lipodystrophy 34. יתר על כן, בשנת 2011, ואח Keuper. צמוד דלקת רקמת שומן לאפופטוזיס adipocyte. הם הראו כי מקרופאגים לאפופטוזיס ב preadipocytes ו adipocytes, אשר בתורו למשוך מקרופאגים. הגיוס של מקרופאגים מאיץ דלקת, אשר contributes כדי התסמונת המטבולית כגון סבילות לגלוקוז ואינסולין 35. עם זאת, אפופטוזיס adipocyte הוא עדיין תופעה גרועה למדה, למרות ההשערה לאפופטוזיס adipocyte יכול להביא לפגיעה במשקל. הפרוטוקול הנוכחי משתמש גישות immunohistochemical לחקור תופעה שונה כגון התפשטות, אפופטוזיס היפוקסיה in vivo. לכן, הרקמה הייתה קבועה עם 4% פורמלדהיד, אשר הוא שלב קריטי. זמן קיבעון רקמות מורחב מוביל לשנות של אפיטופים, אשר הופכים בלתי נגיש עבור הנוגדן. לעומת זאת, זמן קצר קיבעון מגביר את הרגישות של אפיטופים כדי ריאגנטים. הזמן האופטימלי המומלץ של קיבעון הוא 24 שעות. יתר על כן, העובי של החלקים גם משפיע על הנוגדנים מחייבים אפיטופים שלהם; עובי אופטימלי הוא בין 2 ל 5 מיקרומטר. סעיפים עבים מ -5 מיקרומטר ינתנו תוצאות חיוביות כוזבות בשל אתרי קישור גדלו. לעומת זאת, זהections יותר רזה 2 מיקרומטר מכילים פחות אתרי קישור ושטחים חיוביים אינם מוגדרים היטב. גורמים קריטיים נוסף הם הנוגדן עצמו, זמן דגירה, הריכוז ואפילו הטמפרטורה, אשר משפיע על האיכות הספציפית מחייב את אפיטופים. לכן, אימות שעת ריכוז דגירת נוגדן היא הכרחית עבור כל תנאי. כדי להשלים את המחקר, אנו מספקים פרוטוקול בידול במבחנה adipocyte, אשר יכול להיות מורחבת על ידי טיפולים שונים, גירוי או שיתוף תרבויות. באמצעות בתרבויות adipocyte במבחנה, זה אינו ריאלי לקבוע פגמים בידול adipocyte ופונקציות. להשגת תוצאות מהימנות, כמו עבור כל התאים הראשוניים, את ההתנהגות והמראה הבריא של ADSCs ו adipocytes חשובה למדי. הגרעיניות, vacuolations cytoplasmic ו / או ניתוק הם סימנים של הידרדרות, המציין בינוני לקוי, זיהום מיקרוביאלי או הזדקנות של בפריימריזתאים. פרוטוקול זה משתמש adipocytes מבודד מן רקמת כרית שומן, בעוד הוא גם ניתן להשתמש בתאי גזע mesenchymal המבודדים מח עצם כפי שתואר על ידי פרוטוקולים אחרים 36. האחרון כולל ובתאי סטרומה, אשר עשוי לשקף בעיות בידול נוספות המתרחשות הצעד מאוד מוקדם של בידול adipocyte, זה עלול לפספס בפרוטוקול הנוכחי שלנו. יתר על כן, ADSCs ניתן להרחיב במהירות (יותר מ -10 פעמים בתוך שבוע אחד), ו ADSCs בתרבית לטווח ארוך לאחר בקטעים מסוימים עדיין שומרים mesenchymal שלהם pluripotency 37,38. יתרון נוסף באמצעות ADSCs הוא שאפשר לעבור אדם בקלות, מאז ADSCs ניתן לקצור מחולים ידי שאיבת שומן שהיא שיטה פשוטה פולשנית. ליום משפיע כמה איברים אחרים בצורה האנדוקרינית, הפרוטוקול צריך להיות מורחב adipokines. Adipokines, כגון לפטין, אדיפונקטין, נמק הגידול-α גורם (TNF) אnd resistin, מופרש על ידי adipocytes ידועים בהשפעתם מחלות מטבוליות ידי שליטה חילוף החומרים של השומן, הומאוסטזיס אנרגיה אינסולין רגישות 39. לכן, סרום וניתוחי adipocyte secretome צריכות להתבצע. במקרה של חוסר תפקוד AT, adipokines וציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-6, יכול להוביל חוסר ויסות של איברים כמו הכבד והלבלב, ושל שריר פונקציה 4. על מנת לשלול בעיות בתפקוד איבר מערכתיים, במודלים של בעלי חיים או תרביות תאים יכולים להיבדק לתגובתם לגלוקוז גירוי ספיג. כאן אנו מספקים פרוטוקול לניתוח המדינה היסוד של AT ו adipocytes in vivo ו במבחנה כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte ופונקציונליות.

על פי הדיווח 2014 של ארגון הבריאות העולמי, 39% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם סובלים מעודף משקל, ו -13% הם 1 שמנים. בעתיד הקרוב, אנשים הסובלים מעודף משקל יהוו חלק משמעותי של אוכלוסיית הקשישים. תכונה חשובה של השמנה והזדקנות היא חוסר ויסות של שומן ביחס לתחלואה ותמותה 2. Adipokines, חלבונים המופרשים על ידי רקמת השומן (AT), יכול לעורר התסמונת המטבולית כמו השמנה וסוכרת מסוג 2 3. מחלות מטבוליות נגרמות בעיקר על ידי אחסון אנרגיה מופרז טיפות השומנים של adipocytes, שתוצאתה AT הרחבה 4. לכן עניין לקבוע את הסיבות ואת המנגנונים המולקולריים של רחבת AT כדי למצוא הזדמנויות לשלוט בו. יתר התזונה מוביל התרחבות AT, אשר מווסתת על ידי שני אירועים: אחסון אנרגיה מוגזם לתוך טיפות השומנים של adipocytes, תהליךמוביל היפרטרופיה (גידול בגודל adipocyte), ו adipogenesis גדל, הידוע גם בשם adipocyte היפרפלזיה 5. Adipogenesis הוא תהליך של התמיינות של תאי גזע mesenchymal מולטיפוטנטיים (MSC) לתוך adipocytes. ראשית, MSCs להתפתח preadipocytes בשלב המחויב. שנית, preadipocytes נוספת להבדיל לרכוש את התכונות של adipocytes בוגרת ופונקציונלי 6. כמה גורמי שעתוק זוהו רגולטורים לקביעת preadipocyte, כגון חלבון אצבע אבץ 423 (Zfp423) גורם תא מוקדם B 1 (Ebf1). בעוד Zfp423 גורם התחייבות מוקדמת, Ebf1 נדרש עבור הדור של אבות adipocyte 6. בידול מסוף נתונה לפיקוח הדוק על ידי מפל תעתיק, לפיה γ קולטן peroxisome המופעל proliferator (PPARγ) הוא הגורם 7 תעתיק חיוני. גורמי תעתיק מפתח נוספים הם חלבון CCAAT / מחייב המשפר (C/ EBP בני משפחה) (כלומר, C / EBPα, C / EBPβ, ו- C / EBPδ), גורמים דמויי kruppel (KLFs), חלבון מחייב אלמנט תגובה cAMP (CREB) ותגובה הצמיחה המוקדמים 20 (Krox20) 6. לאחרונה, הוכיח כי מפעיל חלבון-1 (AP-1) המשפחה מעורבת 8,9 תהליך התמיינות adipocyte. מש&#39; AP-1 נוצרה על ידי קומפלקס חלבון dimeric, מורכב Fos, יוני ו / או גורם שעתוק הפעלה (ATF) חברים. Fos הקשורות אנטיגן 1 ו -2 (FRA-1 והאח-2) מסוגלים לווסת בידול adipocyte. פרה-1 פוגעת בידול adipocyte ידי עיכוב C / EBPα 8, ואילו adipocyte שולטת פרא-2 מחזור 9. פרה-2 ובכך לא רק מקטין את מספר adipocyte ידי דיכוי הביטוי PPARγ2 במהלך התמיינות adipocyte, אלא גם מקטין אפופטוזיס adipocyte באמצעות דיכוי ישיר של גורמים מושרה היפוקסיה (HIFs) הביטוי. משפחת HIF הוא heteמורכבות גורם שעתוק rodimeric, מורכבת-1α HIF, HIF-2α ו-1β HIF. Heterodimers מורכבת למקטע HIF-1β חמצן רגיש HIF-α חלבון (HIF-1α או HIF-2α) ואת רגישות-חמצן 10. במהלך normoxia, חלבונים-α HIF הם פולי-ubiquitinylated והם מושפלים לבסוף על ידי פרוטאזומים 11. בתנאי חוסר חמצן, המתרחשים AT במהלך התרחבות, חלבונים-α HIF כבר לא hydroxylated. לכן הם הופכים הדימרים התייצב טופס עם HIF-1β הביע constitutively. הפעלת תעתיק של גנים בשליטת האלמנטים בתגובת HIF היא מעורבת בוויסות של אנגיוגנזה, מטבוליזם, ודלקת 12. ואכן, HIF-1α מקדם AT תפקוד ידי גרימת סבילות לגלוקוז, עיכוב הוצאה אנרגטית ושימוש היקפי של שומנים בדם, כמו גם על ידי הגדלת הרמה לפטין HFD-induced 13 steatosis בכבד. יתר על כן, HIF-1α מסדיר adipocyte אפופטוזיס in vivo ו במבחנה 9. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ללימוד AT המעמד לפענח את המאפיינים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte בעכברים בוגרים. זה מראה עד כמה אפופטוזיס, שגשוג והתמיינות של adipocytes in vivo ו in vitro יכול להיות מוסדר על ידי היפוקסיה. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים עם מחיקת adipocyte הספציפית של פרה-2 שנוצרה על ידי חציית עכברים שנשאו את אללים floxed פרא-2 עם Fabp4-CreERT עכברי 9. באמצעות Fabp4-Cre עכברי ERT, המחיקה היא adipocyte ספציפית מושרה בזריקת טמוקסיפן 14. עבור הדגם המבוגר, זריקות הצפק תוך של טמוקסיפן מבוצעות מעל 5 ימים רצופים החל בגיל 6 שבועות. כך, העכברים חשופים דיאטה רגילה או דיאטה עתירת שומן במשך 6 שבועות לפני הניתוח מתבצע. העכברים השתמשו במחקר זה זכר התבססו על רקע C57BL6 להימנע הורמונים נשיים, כגון אסטרוגניםלעין, כדי להסדיר את חלוקת השומן בגוף 15. שימוש אחר רקע גנטי עשויה גם לשנות את הפנוטיפ ומטבוליזם, בגלל הבדלים הקשורים למתח שומנים וניהול 16. פרוטוקול זה מדגים כיצד לנתח AT תחת היפוקסיה באמצעות היסטולוגיה וכיצד לכמת אפופטוזיס adipocyte, התפשטות והבחנה in vivo באמצעות פרופיל אימונוהיסטוכימיה וגן מנתח. המחקר הושלם על ידי ניסויים במבחנה, מראים כיצד לנתח בידול adipocyte ראשוני אפופטוזיס לשנות על ידי חשיפה היפוקסיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td rowspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td>Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160; Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
			<td>550609</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>640906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb</td>
			<td rowspan="2">Cell signalling</td>
			<td>9664S</td>
			<td>&#160;Clone 5A1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>9664</td>
			<td>Apoptosis marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1 Plus Kit</td>
			<td>Hypoxyprobe</td>
			<td>HP2-200Kit</td>
			<td>Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG&#8321; monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000 Reagent&#160;</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>T3605</td>
			<td>Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation&#8260;Emission: 642&#8260;661 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hemalum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109249</td>
			<td>hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pegGOLD TriFast</td>
			<td rowspan="3">Peqlab</td>
			<td>30-2030</td>
			<td>TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percellys Ceramic Kit 1.4 mm</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>tubes containing ceramic beads (1.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24</td>
			<td>91-PCS24</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody</td>
			<td rowspan="2">Pierce</td>
			<td>PA1-16601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13</td>
			<td>700505</td>
			<td>Hypoxia marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 684 795 001</td>
			<td>TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>318906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Solution (1 unit/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="4">Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>PK-4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanism of regulation of adipocyte numbers in adult organisms through differentiation and apoptosis homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

אנו מראים כיצד לקבוע הומאוסטזיס adipocyte in vivo ו במבחנה באמצעות הדוגמה של פרה-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT לעומת להמלטה wild-type. פרוטוקול שלנו מגדירה כיצד ביטוי HIF עלה ב היפוקסיה מתואם עם תפקוד לקוי adipocyte כפי שצוין על ידי אפופטוזיס adipocyte מוגברת. גודל adipocyte מוגברת ושטח בתזונה עתירת שומן (HFD) העכברים שטופלו יתר תזונה, בין היתר, כתוצאה מכך היפרטרופיה adipocyte, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מופרזת טיפות השומנים. גודל adipocyte והאזור מהווה אינדיקטור היפרטרופיה. סעיפים של כרית השומן מן הרגיל (ND; איור 6 א) ו דיאטה עתירת שומן (HFD; 6b איור) עכברים וכן quantifications של גודל adipocyte ואזור מראים בבירור היפרטרופיה adipocyte לאחר 6 שבועים של HFD, אשר מסומן על ידי גודל adipocyte מוגברת העכברים שטופלו HFD (איור 6 ג ו-ד). היפוקסיה מוגברת ברקמת השומן (AT) של מבוגר פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT מוביל ברמה אפופטוזיס adipocyte HIF-1α גדל כדי לקבוע את המצב vivo של היפוקסיה ב AT, האח-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT מנותחים 6 שבועות לאחר המחיקה פרא-2 בגיל 12 שבועות לעומת להמלטה wild-type. Pimonidazole מנוהל על עכברים intraperitoneally כסמן היפוקסיה יעיל; זה לא רעיל ומסוגל להפיץ לתוך AT. Adipocytes היפוקסי ב AT in vivo מוגדרים על ידי מכתים נוגדן immunohistochemical (איור 7 א). יתר על כן, את מצב חוסר החמצן המוגבר של AT בעכברים מלווה ADIP החיובית HIF-1α גדלocytes כפי שצוין על ידי 7b איור מכתים immunohistochemical), אשר אושר על ידי כימות של רמות הביטוי HIF-1α וגנים ביעדיה 9. בנוסף, מכתים TUNEL סעיפים AT מן פרה-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה מלאה (7c איור) מראה כי גדל אפופטוזיס adipocyte מתואם עם נוכחות של היפוקסיה וביטוי-1α HIF. גברת ביטוי HIF-1α ב adipocytes הראשוני באמצעות אפופטוזיס adipocyte מושרה היפוקסיה כדי לנתח אפופטוזיס adipocyte במבחנה, אנו משתמשים adipocytes המופק רפידות שומן תת עורי כמתואר במקום אחר 20. כצפוי, הביטוי HIF-1α ב adipocytes הוא גדל לאחר 24 שעות של היפוקסיה (איור 8 א). כדי להמשיך לנתח פעילויות HIF-1α, רמות RNA של היעד HIFגנים כגון אינוס (synthase תחמוצת החנקן מושרה) הם לכמת ידי qPCR. איור 8b מראה כי ביטוי מוגבר של HIF-1α בתנאים היפוקסי המוביל לעליה ברמת ה- mRNA אינוס. מכיוון שאנו כבר הראינו in vivo (איור 8) כי גדל ביטוי HIF-1α ב adipocytes בקורלציה עם אפופטוזיס adipocyte גדל, אפופטוזיס מכמת גם בתרבויות חוץ גופייה על ידי מכתים Annexin V בתנאי חוסר חמצן. בקנה אחד עם הנתונים vivo ב (איור 7), רמת HIF-1α הגדילה מלווה אפופטוזיס adipocyte מוגברת הנגרמת על ידי תנאי חוסר חמצן (איור 8 ב). יתר על כן, כדי להוכיח כי אפופטוזיס מושרה-היפוקסי הוא HIF תלוי; HIF-1α או HIF-2α מושתק על ידי התערבות RNA ב adipocytes נגזר wild-type או עכברים לקוי פרא-2. אפופטוזיס adipocyte גדל משוחזר ידי השתקת HIF-1α או-2α HIF כפי שמוצג על ידי Annexin<html> מכתים V ב איור 8b, להוכיח כי חיישן היפוקסיה-α HIF מסדיר את אפופטוזיס adipocyte. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> איור 6: מתגבר גודל adipocyte ואזור בתזונה עתירת שומן (HFD) עכברים (a, b) H &amp; E מכתים סעיפים מהפנקס שומן perigonadal של עכברי-בר זכר נמאס עם תזונה נורמלית (ND) (א) או גבוה. דיאטת -fat (HFD) (ב) במשך 6 שבועות. ברים מייצגים 500 מיקרומטר. (ג, ד) Quantifications של גודל adipocyte (ג) ואזור (ד) מהפנקס שומן perigonadal של עכברי-בר נמאס עם ND (א) או HFD (ב) במשך 6 שבועות. n = 10. הנתונים מוצגים ערכים ממוצעים כמו ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות Student&#39;s t -test. *** P &lt;0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> איור 7: רמת HIF-1α הגברת אפופטוזיס adipocytes של מבוגר פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT. היפוקסיה (א) ו- HIF-1α (ב) מכתים את AT של fl פרא-2 זכר / fl עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה שליטה גברית 6 שבועות לאחר ההזרקה טמוקסיפן. הגדלה 20X, הכנס 40X. חיצים שחורים מציינים אזורים היפוקסי ותא חיוביים-1α HIF. (ג) מכתים TUNEL ב פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT ו להמלטה מלאה AT 6 שבועות לאחר ההזרקה טמוקסיפן. הגדלה 20X, הכנס 40X. חיצים שחורים מצביעים תאים חיוביים TUNEL. נתון זה יש הבדל בין et לוותרal. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> איור 8:. הביטוי HIF-1α מוגברת adipocyte אפופטוזיס adipocytes העיקרית הנגרמת על ידי היפוקסיה (א) ניתוח PCR בזמן אמת של-1α HIF ויעד HIFs אינוס mRNA רמות adipocytes העיקרי להציב תאי היפוקסי ניתח בנקודות הזמן המצוין. (ב) כימות של אפופטוזיס על ידי מכתים Annexin V FACS ב adipocytes העיקרי שבודד פרא-2 fl / fl עכברים Fabp4-CreERT או בקרות wild-type טרנספקציה עם שליטה sh או פלסמיד sh נגד HIF-1α או HIF-2α והניח תחת היפוקסיה (1% O 2) עבור 24 שעות. נתון זה יש הבדל בין והאח לוותר. <sup&gt; 9. נתונים מוצגים ערכים ממוצעים כמו ± הניתוח סטטיסטי SD בוצע באמצעות מבחן T- של הסטודנטים. * P &lt;0.05 ו ** P &lt;0.01 התקבלו משמעותי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis at JoVE.com

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

מנגנון הוויסות של מספרי adipocyte למבוגרים אורגניזמים באמצעות בידול הומאוסטזיס אפופטוזיס

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.9K Views.  Universitätsklinikum Erlangen. Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Video: Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.