著者は、原稿を校正するためのデータと博士B.Grötschを製造するための博士J・ルターとK. Ubietaを親切に感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術協会（BO3811 / 1-1-エミー・ネーター）によってサポートされていました。

<ol>
	<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+function,+type+2+diabetes,+and+metabolism+in+aging.">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482 (2012).</li><li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome.">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li><li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases.">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008 (2013).</li><li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+fat+expansion.">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li><li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots;+implications+for+pathophysiology+or+therapy.">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li><li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy.">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li><li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fra-2/AP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia.">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li><li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein:+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer.">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li><li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism.">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li><li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction.">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li><li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+(Cre-ERT2)+in+adipocytes.">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li><li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin.">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li><li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+(C57BL/6J+versus+FVB/N)+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob/ob+mice.">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells:+physiological+and+therapeutic+perspectives.">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity.">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li><li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model.">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747 (2013).</li><li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding.">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li><li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet.">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance.">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue.">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li><li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF/LIF-receptor+signalling+and+hypoxia.">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li><li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pimonidazole:+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma.">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li><li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability.">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li><li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death.">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li><li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool.">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li><li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation.">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia:+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem/progenitor+cells.">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).</li><li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis.">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li><li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes.">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li><li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ.">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

脂肪細胞は、過栄養5に起因する過剰なエネルギー貯蔵により誘導される脂肪細胞の過形成および肥大を、明らかにし、その大きさ、数および面積によって表現型を特徴とします。脂肪酸の調節不全とその後のメタボリック症候群につながるこれらのイベントはまた、「健康な」脂肪拡張と呼ばれる保存代謝と増加脂肪塊の状態です。例えば、Kusminski ら 21は、大量の脂肪の膨張を有するマウスが脂肪拡大は必ずしもメタボリックシンドロームにリンクされ、脂肪細胞の特性を評価するために慎重に決定する必要がないことを示唆する、代謝的に健康なままであることを示しました。脂肪組織（AT）は、身体の代謝の調節において重要な役割を果たしています。 ATは、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、高インスリン血症および高血糖症3に影響を与える可能性が最大の内分泌器官です。恒常性と分子メートルATの評価それを規制echanismsは、代謝系疾患のより良い理解を可能性があります。したがって、脂肪細胞分化を調節するメカニズムを解明、脂肪細胞のサイズおよび脂肪パッド質量は、肥満障害のための新たな治療的処置を開発するために役立つだろう。 インビボおよびインビトロ方法で使用することにより、脂肪細胞分化および活性の食品および遺伝子発現への影響の役割を決定することが可能です。 ATの恒常性を決定するために、我々のプロトコルによって示唆されているように、脂肪細胞の分化、増殖およびアポトーシスの間のバランスを決定することは、グルコースおよびインスリンの代謝反応22-24の分析と同様に重要です。 発現プロファイリングは、一次脂肪細胞における脂肪生成、脂質生成、脂肪分解、脂肪酸の取り込み、低酸素症、アポトーシスおよび増殖に関与する遺伝子の解析と内臓ATは、脂肪細胞の恒常性とその可能性機能障害の概要を取得するためのハイスループット法です。興味深い候補は、さらにウエスタンブロットまたは免疫組織染色によりタンパク質レベルで分析する必要があります。非対称シアニン色素を用いてリアルタイムPCRシステムを介して最適な結果を得るために、1から10 ngの範囲のcDNAの濃度は、50から900nmの範囲の最適なプライマー濃度は、非特異的増幅を最小限にするために試験されるべきです。重要なコンポーネントは、プライマーです。各実験のために、融解曲線は、厳密な特異性を確保し、プライマーダイマーの形成を排除するように制御される必要があります。そのため、代わりにcDNAのH 2 Oでネガティブコントロールを使用することをお勧めします。また、市販の非対称シアニン色素は、内部基準信号を提供するために（例えば、ROXなど）、パッシブリファレンス色素を含有するマスターミックスとして提供されます。 cDNAの信号は、ウェル間の信号の変動を補正するROX信号にデータ分析中に正規化されます。もう一つのポイントは、グーを確立するために考慮されますD定量PCRシステムは、ハウスキーピング遺伝子の選択です。各条件について、いくつかのハウスキーピング遺伝子が使用されている、 例えば、HPRT、β アクチン 、GAPDH、β-2-MGまたはHSP90。 低酸素条件によって安定化されたHIFタンパク質は、マスターだけでなく、脂肪細胞生存率を決定する制御因子でなく、例えばグルコース、インスリン耐性及び脂質代謝11,25,26などの代謝の変化です。脂肪パッドに低酸素領域を確認するには、HIF-1αは、免疫組織化学によるセクションATで決定されます。 HIFタンパク質は急速に正常酸素条件下で5〜10分以内に分解されるので、手順及び組織学的分析のために脂肪パッドの固定を強固に待ち時間を回避するように制御されるべきです。したがって、だけでなくHIF染色を介して低酸素症を確実にするために、ピモニダゾールは、ATにおける低酸素領域を決定するために使用されます。それはすでに骨27に示されたようにピモニダゾールは、組織内に配布することができ、、かつ効果的にさらに28を特異的抗体結合によって、組織切片中に検出された特異的低酸素細胞中のチオール含有タンパク質に結合することによって、低酸素領域をマーク。しかしながら、他のマーカーおよび方法は、低酸素経路を分析するために使用することができます。例えば、ヒドロキシル化プロリンを認識し、プロテアソームHIFを媒介するポリユビキチン化を誘導正常酸素下でのプロリン残基のヒドロキシル化を誘導するプロリルヒドロキシラーゼ（PHD）酵素、ならびにフォン・ヒッペル - リンダウ（VHL）タンパク質の関与劣化は、経路29,30の完全な概要について分析する必要があります。また、HIFSのユビキタス検出はまた、31,32を変更することができ、タンパク質の安定性および分解を決定するであろう。 また、TUNEL染色によるのKi67による増殖とアポトーシスは、AT組織切片の染色を介して生体内で決定されます。 Ki67のとAによる増殖の定量化フローサイトメトリー分析を通じTUNELまたはアネキシンV染色によるpoptosisも33で実施されます。増殖はもちろんのKi67陽性細胞の測定によって対処されていないような脂肪細胞周期の分析のような他の技術によって測定することができます。 FACSは、アポトーシス細胞死のプロセス対壊死のレベルを決定するアネキシンVとTOP-PR-3の分析によってまた、TUNELによるアポトーシスの研究を完成させることができます。アポトーシスは、ATの恒常性に重要である、細胞死のプログラムの基本的な過程です。確かに、脂肪細胞のアポトーシスの調節不全は、肥満や脂肪異栄養症34に貢献する過程で以前に関与しています。また、2011年には、Keuper ら脂肪細胞のアポトーシスに脂肪組織の炎症をリンクされています。それらは順番にマクロファージを誘引する、マクロファージが前脂肪細胞および脂肪細胞においてアポトーシスを誘導することが示されました。マクロファージの動員は、炎症、CONTRを加速しますこのようなグルコースおよびインスリン寛容35としてメタボリックシンドロームにibutes。しかし、脂肪細胞のアポトーシスが誘導された脂肪細胞のアポトーシスが減少した体重につながる可能性の仮説にもかかわらず、まだよく研究された現象です。 現在のプロトコルは、in vivoでの増殖、アポトーシスおよび低酸素症などのさまざまな現象を研究するために免疫組織化学的手法を使用しています。したがって、組織は重要なステップである4％ホルムアルデヒドで固定しました。拡張された組織固定時間は、抗体のための非アクセス可能となるエピトープの変化をもたらします。対照的に、短い固定時間は、試薬のエピトープの感受性を増加させます。固定の推奨最適な時間は24時間です。また、切片の厚さは、それらのエピトープに結合する抗体に影響を及ぼす。最適な厚さは2から5μmの間です。 5ミクロンより厚い部分は、増加した結合部位に偽陽性の結果が得られます。対照的に、よections薄い2μmよりは少ない結合部位を含有し、正の領域が十分に定義されていません。さらに重要な要素は、エピトープへの特異的結合の品質に影響を与える抗体自体、インキュベーション時間、濃度、さらに温度があります。したがって、抗体濃度およびインキュベーション時間を検証すると、各条件のために必要です。 調査を完了するために、我々は、異なる処理、刺激または共培養することによって拡張することができ、インビトロ脂肪細胞分化プロトコルを提供します。 インビトロで脂肪細胞の培養に用いることにより、脂肪細胞分化及び機能における欠陥を決定することが可能です。信頼性の高い結果を得るためには、すべての主要な細胞用として、ADSCをおよび脂肪細胞の健全な動作と外観は非常に重要です。粒度、細胞質vacuolationsおよび/または剥離は、一次の不十分な媒体であって、微生物汚染や老化を示す劣化の兆候であり、細胞。他のプロトコル36で説明したように、骨髄から単離された間葉系幹細胞を使用することも可能であるのに対し、このプロトコルは、脂肪体組織から単離された脂肪細胞を使用しています。最新の脂肪細胞分化の非常に早い段階で発生する追加の分化の問題を反映しているのかもしれない間質前駆細胞を、含まれ、これは、当社の現在のプロトコルでは見逃される可能性があります。また、ADSCをは急速に（1週間以内に10回以上）に拡張することができ、いくつかの継代後の長期培養したADSCはまだ彼らの間葉系多能性37,38を保持しています。 ADSCをを使用して、もう一つの利点は、ADSCを簡単かつ低侵襲性の方法である脂肪吸引により患者から採取することができるので、一つは簡単に、人間に切り替えることができるということです。 ATは内分泌方法でいくつかの他の臓器に影響を与えるように、プロトコルは、アディポカインに延長すべきです。このようなレプチン、アディポネクチン、腫瘍壊死因子α（TNF）Aとアディポカイン、ND脂肪細胞によって分泌されるレジスチンは、脂肪代謝、エネルギー恒常性およびインスリン感受性39を制御することにより、代謝性疾患に影響を与えることが知られています。したがって、血清および脂肪細胞secretome分析が行われるべきです。 AT機能不全、アディポカインならびにIL-6などの炎症性サイトカインの場合において、例えば肝臓や膵臓などの器官の調節不全につながる、および筋肉機能の4ことができます。全身の臓器不全を排除するために、動物モデルまたは細胞培養物はグルコース刺激および取り込みに対するそれらの応答について試験することができます。 ここでは、ATおよびインビボにおける脂肪細胞の基本的な状態を分析するためのプロトコルを提供し、 インビトロで脂肪細胞の恒常性と機能性の分子機構を明らかにします。

世界保健機関（WHO）から2014年の報告によると、世界の成人人口の39％が太りすぎであり、13％は1肥満です。近い将来、太りすぎの人々は、高齢者人口のかなりの割合を含むことになります。肥満および老化の重要な特徴は、罹患率および死亡率2に関連して脂肪の調節不全です。アディポカイン、脂肪組織（AT）によって分泌されるタンパク質は、肥満などの代謝症候群を誘発し、2型糖尿病3を入力することができます 。代謝性疾患は、主に拡張4 ATで、その結果、脂肪細胞の脂肪滴の過剰なエネルギー貯蔵、によって引き起こされます。それを制御するための機会を見つけるために原因と拡張ATの分子機構を決定することは興味深いことです。 脂肪細胞の脂肪滴に過剰なエネルギー貯蔵プロセス：過栄養二つの事象により調節されるATの拡大につながり肥大（脂肪細胞のサイズの増大）につながる、とも脂肪細胞の肥大5として知られ、脂肪生成を増加させました。脂肪生成は、脂肪細胞への多分化間葉系幹細胞（MSC）の分化の過程です。まず、MSCはコミットメントフェーズ中に前駆脂肪細胞へと発展します。第二に、前脂肪細胞は、さらに成熟した機能的な脂肪細胞6の特徴を獲得するために分化します。いくつかの転写因子は、亜鉛フィンガータンパク質423（Zfp423）および早期B細胞因子1（EBF1）として、前脂肪細胞の決意のマスター調節因子として同定されています。 Zfp423は早期のコミットメントを誘導するのに対し、EBF1は、脂肪細胞の前駆細胞6の生成に必要とされます。分化はしっかりペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）は、必須の転写因子7となる転写カスケードによって制御されます。さらに重要な転写因子はCCAAT /エンハンサー結合タンパク質（Cです/ EBP）ファミリーのメンバー（ すなわち 、C /EBPα、C /EBPβ、およびC /EBPδ）、クルッペル様因子（KLFs）、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB）および早期成長応答20（Krox20）6。 最近では、アクチベータータンパク質-1（AP-1）ファミリーは、脂肪細胞の分化プロセス8,9に関与することが示されています。 AP-1ファミリーはフォス、Junおよび/または活性化転写因子（ATF）のメンバーからなる二量体タンパク質複合体により形成されます。 FOS関連抗原1および2（FRA-1とフラ-2）脂肪細胞の分化を調節することができます。フラ-1はFRA - 2コントロール脂肪細胞のターンオーバー9のに対し、C /EBPα8を阻害することにより、脂肪細胞分化を阻害します。フラ-2は、それによってだけでなく、脂肪細胞分化の間にPPARγ2の発現を抑制することにより、脂肪細胞の数が減少するだけでなく、低酸素誘導因子（HIFS）式の直接の抑制を介して脂肪細胞のアポトーシスを減少させます。 HIFファミリーはHETEですHIF-1α、HIF-2αとHIF-1βから成るrodimeric転写因子複合体、。ヘテロは、酸素感受性HIF-αタンパク質（HIF-1αまたはHIF-2α）と酸素と小文字を区別しないHIF-1βサブユニット10から構成されています。酸素正常状態の間に、HIF-αタンパク質は、ポリユビキチン化され、最終的にプロテアソーム11によって分解されます。低酸素条件下では、拡張時にATで発生する、HIF-αタンパク質は、もはや、ヒドロキシル化されません。したがって、これらは、恒常的に発現するHIF-1βで安定化し、フォームダイマーになります。 HIF応答要素によって制御される遺伝子の転写活性化は、血管形成、代謝、炎症12の調節に関与しています。確かに、HIF-1αは、エネルギー消費や脂質の末梢利用を阻害し、グルコース耐性を誘導することにより、同様にレプチンレベルとHFD誘発性脂肪肝13を増加させることにより機能不全AT推進しています。また、HIF-1αはadipocyを調節しますテアポトーシスのin vivoおよびin vitro 9インチ 現在のプロトコルは、成体マウスに脂肪細胞の恒常性の分子的特徴を解明する状態で勉強するための方法を説明します。これは、 インビボおよびインビトロで脂肪細胞のアポトーシス、増殖および分化は、低酸素によって調節することができる方法を示しています。そうするために、我々は、FABP4-CreERTマウス9とフラ-2フロックス対立遺伝子を持つマウスを交配させることによって生成されたフラ-2の脂肪細胞特異的欠失を有するマウスを使用します。 FABP4-CreをERTマウスを使用することにより、削除は、脂肪細胞タモキシフェン注射14による特定および誘導性です。大人のモデルでは、タモキシフェンの腹腔内注射は6週齢で始まる連続5日間にわたって行われています。分析が行われる前に、このように、マウスを6週間、通常食または高脂肪食に供します。本研究で用いたマウスは、雄のようなエストロゲンなどの女性ホルモンを避けるためにのC57BL6背景に基づいていました、体脂肪分布15を調節することが示さ。別の遺伝的背景を使用すると、脂質管理16の歪み関連の違いに起因する代謝表現型を、変更される場合があります。 このプロトコルは、組織学を用いて、低酸素下でATを分析する方法および免疫組織化学とプロファイリング分析遺伝子を用いたin vivoでの脂肪細胞のアポトーシス、増殖および分化を定量化する方法を示しています。研究は、低酸素に暴露することによって変更された一次脂肪細胞分化及びアポトーシスを分析する方法を示す、 インビトロ実験によって完成されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td rowspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td>Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160; Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
			<td>550609</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>640906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb</td>
			<td rowspan="2">Cell signalling</td>
			<td>9664S</td>
			<td>&#160;Clone 5A1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>9664</td>
			<td>Apoptosis marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1 Plus Kit</td>
			<td>Hypoxyprobe</td>
			<td>HP2-200Kit</td>
			<td>Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG&#8321; monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000 Reagent&#160;</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>T3605</td>
			<td>Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation&#8260;Emission: 642&#8260;661 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hemalum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109249</td>
			<td>hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pegGOLD TriFast</td>
			<td rowspan="3">Peqlab</td>
			<td>30-2030</td>
			<td>TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percellys Ceramic Kit 1.4 mm</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>tubes containing ceramic beads (1.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24</td>
			<td>91-PCS24</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody</td>
			<td rowspan="2">Pierce</td>
			<td>PA1-16601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13</td>
			<td>700505</td>
			<td>Hypoxia marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 684 795 001</td>
			<td>TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>318906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Solution (1 unit/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="4">Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>PK-4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanism of regulation of adipocyte numbers in adult organisms through differentiation and apoptosis homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

我々は、野生型同腹子と比較して、フラ-2 FL / FL FABP4-CreERTマウスの例を用いて、 インビボおよびインビトロで脂肪細胞の恒常性を決定する方法を示しています。私たちのプロトコルが増加し、脂肪細胞のアポトーシスによって示されるように、低酸素状態によって増加したHIFの発現が脂肪細胞の機能不全と相関する方法を定義します。 高脂肪食で増加した脂肪細胞の大きさや面積（HFD）で処置したマウス過栄養、他の要因の中で、脂肪滴に過度のエネルギー蓄積によって引き起こされる、脂肪細胞の肥大をもたらします。脂肪細胞の大きさおよび面積は、肥大の指標です。正常からの脂肪パッドのセクション（ND; 図6a）と高脂肪食（HFD; 図6b）が 6週間後に、脂肪細胞の大きさや面積のマウスと同様に定量化が明確に示す脂肪細胞の肥大HFD処置したマウス（ 図6cおよびd）に増加した脂肪細胞のサイズによって示されHFDの秒。 増加し、成人の脂肪組織（AT）における低酸素フラ-2 FL / FL FABP4-CreERTマウスが増加し、HIF-1αレベルと脂肪細胞のアポトーシスに導きます ATで低酸素症のin vivoでの状態を決定するために、フラ-2 FL / FL FABP4-CreERTマウス6週、12週齢でフラ-2削除後に分析し、野生型同腹子と比較しています。ピモニダゾールは、効果的な低酸素症マーカーとしてマウスの腹腔内に投与されます。それは無毒でATに配布することが可能です。 in vivoでの ATで低酸素脂肪細胞を免疫組織化学的抗体染色（ 図7a）によって定義されています。また、マウスでのATの増加、低酸素状態が増加したHIF-1αの正ADIPを伴っていますHIF-1αの発現レベルとその標的遺伝子9の定量化によって確認された免疫組織染色図7B）によって示されるようにocytes。さらに、脂肪細胞のアポトーシスは、低酸素およびHIF-1α発現の存在と相関しているの増加フラ-2 FL / FL FABP4-CreERTマウスおよび対照同腹子からAT切片のTUNEL染色（ 図7c）を示しています。 低酸素誘導性の脂肪細胞のアポトーシスを介して一次脂肪細胞におけるHIF-1αの発現を増加させました他の場所で20説明したように、in vitroで脂肪細胞のアポトーシスを分析するために、我々は、皮下脂肪パッドから生成された脂肪細胞を使用しています。予想されたように、脂肪細胞におけるHIF-1αの発現は、低酸素（ 図8a）の24時間後に増加されます。さらに、HIF-1α活動、HIF標的のRNAレベルを分析するために、このようなイノス（誘導型一酸化窒素合成酵素）などの遺伝子を定量PCRによって定量化されている。 図8bは、低酸素条件下でHIF-1αの発現増加がアイノスmRNAレベルの増加につながることを示しています。我々はすでに、in vivoで示されているので、脂肪細胞におけるHIF-1αの発現を増加させた（ 図8）が増加した脂肪細胞のアポトーシスと相関し、アポトーシスはまた、低酸素条件下でアネキシンV染色によりin vitroでの培養において定量化されます。 in vivoデータ（ 図7）と一致して、増加したHIF-1αレベルは、低酸素状態（ 図8b）によって誘発される増加した脂肪細胞のアポトーシスを伴っています。また、その低酸素誘導性アポトーシスを証明するためには、HIF-依存します。 HIF-1αまたはHIF-2αは、野生型またはフラ-2欠損マウス由来の脂肪細胞におけるRNA干渉によってサイレンシングされます。アネキシンによって示されるように増加した脂肪細胞のアポトーシスは、HIF-1αまたはHIF-2αをサイレンシングすることによって復元されます<html>低酸素センサHIF-αは、脂肪細胞のアポトーシスを調節することを証明する図8bにおけるV染色、。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> 図6：高脂肪食（HFD）マウスにおける脂肪細胞の大きさや面積の増加普通食（ND）を与えた雄の野生型マウスのperigonadal脂肪パッドからのセクションの（a、b）は、H＆E染色（a）または高いです。 6週間-fat食（HFD）（B）。バーは500μmで表します。 （C、D）、（b）は、6週間のND（a）またはHFDを与えた野生型マウスのperigonadal脂肪パッドから脂肪細胞の大きさ（C）と領域（D）の定量。 n = 10のデータは、平均値±SEMとして示されています。統計分析は、スチューデントさt検定を用いて行きました。 ***はp &lt;0.0001。：//www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> 図7：大人フラ-2の脂肪細胞においてHIF-1αレベルおよびアポトーシスの増加 FL / FL FABP4-CreERTマウス 。低酸素（a）とHIF-1α男性フラ-2 FL / FL FABP4-creERTマウスと男性の対照同腹子タモキシフェン注射後6週間のATにおける（b）の染色。倍率20Xは、40Xを挿入します。黒矢印は、低酸素領域とHIF-1α陽性細胞を示しています。 （c）のタモキシフェン注射後6週間ATフラ-2 FL / FL FABP4-CreERTマウスおよび対照同腹子におけるTUNEL染色。倍率20Xは、40Xを挿入します。黒矢印はTUNEL陽性細胞を示しています。この図は、ルターらから変更されていますアル。9。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> 図8： 低酸素によって誘導される一次脂肪細胞における増加したHIF-1αの発現と脂肪細胞のアポトーシス低酸素室に配置された一次脂肪細胞におけるHIF-1αとHIFSターゲットアイノスmRNAレベルの（a）のリアルタイムPCR分析は、指示された時点で分析しました。単離された初代脂肪細胞におけるアネキシンV FACS染色によるアポトーシスの（b）の定量フラ-2 FL / FL shの制御またはHIF-1αまたはHIF-2αに対するshのプラスミドでトランスフェクトし、低酸素下に置かFABP4-CreERTマウスまたは野生型対照24時間（1％O 2）。この図は、ルターらから変更されています。 <sup&gt; 9。データはSD統計分析±値はスチューデントのt検定を用いて行った、平均示されています。 * P &lt;0.05、**はP &lt;0.01を有意であると受け入れられた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis at JoVE.com

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.9K ビュー.  Universitätsklinikum Erlangen. Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

ビデオ: Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

導出とイヌの卵巣間葉系幹細胞の分化

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.