Gli autori desiderano ringraziare il Dr. J. gentilmente Lutero e K. Ubieta per la preparazione dei dati e il dottor B. Grötsch per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli adipociti sono caratterizzati fenotipicamente per le loro dimensioni, numeri e zona, rivelando degli adipociti iperplasia e ipertrofia, indotta da stoccaggio eccessivo di energia a causa di un eccesso di nutrizione 5. Questi eventi portano alla disregolazione di acidi grassi e successive sindromi metaboliche sono afferma anche di un aumento della massa grassa con metabolismi conservati, che è indicato anche come l&#39;espansione grasso &quot;sano&quot;. Ad esempio, Kusminski et al. 21 hanno mostrato che i topi con espansione grasso massiccia rimangono metabolicamente sani, suggerendo che l&#39;espansione grasso non è necessariamente legata sindromi metaboliche e deve essere attentamente determinata a valutare le caratteristiche degli adipociti. Il tessuto adiposo (AT) gioca un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo del corpo. AT è il più grande organo endocrino che potrebbe influenzare la dislipidemia, l&#39;aterosclerosi, l&#39;iperinsulinemia e iperglicemia 3. Valutare AT omeostasi e la m molecolareECCANISMI regolano potrebbe consentire una migliore comprensione dei disturbi del sistema metabolici. Pertanto, svelare i meccanismi che regolano la differenziazione degli adipociti, le dimensioni degli adipociti e la massa cuscinetto adiposo aiuterebbero a sviluppare nuovi trattamenti terapeutici per i disturbi di obesità. Uso in vivo e metodi in vitro, è possibile determinare il ruolo degli impatti alimentari e di espressione genica sulla differenziazione e l&#39;attività degli adipociti. Per determinare l&#39;omeostasi AT, determinare l&#39;equilibrio tra differenziazione degli adipociti, proliferazione e apoptosi come suggerito dal nostro protocollo è importante come analizzare il glucosio e insulina metabolica risposta 22-24. Profili di espressione analisi di geni coinvolti nella adipogenesi, lipogenesi, la lipolisi, l&#39;assorbimento degli acidi grassi, ipossia, l&#39;apoptosi e la proliferazione in adipociti primari e viscerale AT è un metodo di alto rendimento per ottenere una panoramica degli adipociti omeostasi e la loro possibile disfunzione.i candidati interessanti dovrebbero essere ulteriormente analizzati a livello proteico mediante western blot o colorazione immunohistological. Per ottenere risultati ottimali attraverso tempo reale sistema PCR utilizzando coloranti cianinici asimmetrici, le concentrazioni di cDNA da 1 a 10 ng di primer e le concentrazioni ottimali da 50 a 900 nm dovrebbero essere testati per minimizzare l&#39;amplificazione non specifica. I componenti critici sono i primer; Per ciascuna prova, le curve di fusione devono essere controllati strettamente per garantire la specificità ed escludere la formazione di dimeri di primer. Pertanto, è consigliabile utilizzare un controllo negativo con H 2 O invece di cDNA. Inoltre, commerciali disponibili coloranti cianinici asimmetriche sono forniti come Master Mix contenenti un colorante di riferimento passivo (come ROX) per fornire un segnale di riferimento interno. Il segnale cDNA è normalizzata durante l&#39;analisi dei dati ai segnali ROX per correggere le fluttuazioni del segnale ben-to-bene. Un altro punto da considerare al fine di stabilire un good sistema qPCR è la scelta del gene housekeeping. Per ogni condizione, diversi geni housekeeping vengono utilizzati, ad esempio, HPRT, β-actina, GAPDH, β-2-mg o HSP90. Proteine ​​HIF stabilizzati da condizioni di ipossia sono regolatori principali che determinano non solo adipociti sopravvivenza, ma anche cambiamenti metabolici, come il glucosio, la tolleranza di insulina e il metabolismo dei lipidi 11,25,26. Per accertare le aree ipossiche nel cuscinetto adiposo, HIF-1α è determinato in AT sezioni di immunoistochimica. Poiché le proteine ​​HIF si stanno rapidamente degradati entro 5 o 10 minuti in condizioni normossiche, la procedura e la fissazione del cuscinetto adiposo per l&#39;analisi istologica devono essere strettamente controllati per evitare di tempo di latenza. Pertanto, per assicurare ipossia non solo attraverso HIF colorazione, pimonidazole viene utilizzato per determinare le aree ipossiche in AT. Pimonidazole è in grado di distribuire nei tessuti, come è stato già indicato in ossa 27, Ed effettivamente indicare le zone ipossiche legandosi alle proteine ​​contenente il tiolo specificatamente nelle cellule ipossiche, che viene ulteriormente rilevati in sezioni istologiche legandosi anticorpo specifico 28. Tuttavia, altri marcatori e metodi possono essere utilizzati per analizzare il percorso ipossia. Ad esempio, il coinvolgimento dell&#39;enzima prolyl idrossilasi (PHD), che inducono idrossilazione dei residui di prolina sotto normoxia, così come la proteina di von Hippel-Lindau (VHL), che riconoscono proline idrossilati e indurre il poli-ubiquitinazione di mediare proteasomale HIF degradazione, devono essere analizzati per una panoramica completa del percorso 29,30. Inoltre, il rilevamento onnipresente di HIF potrebbe anche determinare la stabilità proteica e la degradazione che può essere alterare 31,32. Inoltre, proliferazione Ki67 e l&#39;apoptosi da TUNEL sono determinati in vivo attraverso la colorazione di AT sezioni istologiche. La quantificazione della proliferazione da Ki67 e unpoptosis da TUNEL o annessina V colorazione attraverso citometria a flusso di analisi viene effettuata anche 33. Proliferazione potrebbe naturalmente essere misurata con altre tecniche come l&#39;analisi del ciclo cellulare adipociti, che non viene affrontato dalla misurazione di cellule positive Ki67. Inoltre, lo studio apoptosi mediante TUNEL può essere completata mediante FACS analisi di annessina V e TOP-PR-3 che determinerà i livelli di necrosi rispetto al processo di morte cellulare apoptosi. L&#39;apoptosi è un processo fondamentale per il programma di morte cellulare, che è importante per AT omeostasi. Infatti, disregolazione di adipociti apoptosi è stato implicato in precedenza nei processi che contribuiscono all&#39;obesità e lipodistrofia 34. Inoltre, nel 2011, Keuper et al. Legato adiposo infiammazione dei tessuti di adipociti apoptosi. Essi hanno dimostrato che i macrofagi apoptosi indotta in preadipocytes e adipociti, che a loro volta attirano macrofagi. Il reclutamento di macrofagi accelera infiammazione, che contributes a sindromi metaboliche come glucosio e di insulina tolleranza 35. Tuttavia, adipociti l&#39;apoptosi è un fenomeno ancora poco studiato, nonostante l&#39;ipotesi che l&#39;apoptosi indotta adipociti potrebbe portare ad una riduzione del peso. Il presente protocollo utilizza approcci immunoistochimica per studiare fenomeno diverso, come la proliferazione, l&#39;apoptosi e ipossia in vivo. Pertanto, il tessuto è stato fissato con 4% di formaldeide, che è un passaggio critico. Un tempo di fissaggio del tessuto prolungato porta al cambiamento degli epitopi, che diventano non accessibili per l&#39;anticorpo. Al contrario, un breve tempo di fissazione aumenta la sensibilità di epitopi ai reagenti. Il momento ottimale raccomandata di fissaggio è di 24 ore. Inoltre, lo spessore delle sezioni influenza anche gli anticorpi leganti ai loro epitopi; spessore ottimale è compreso tra 2 e 5 micron. Le sezioni più spesse di 5 micron darà risultati falsamente positivi a causa di un aumento dei siti di legame. Al contrario, sriflessioni più sottile di 2 micron contengono siti meno vincolante e le aree positive non sono ben definiti. Ulteriori fattori critici sono l&#39;anticorpo stesso, tempo di incubazione, la concentrazione e la temperatura uniforme, che influenzano la qualità del legame con gli epitopi specifici. Pertanto, convalidando la concentrazione e l&#39;incubazione tempo anticorpo è necessaria per ogni condizione. Per completare lo studio, mettiamo a disposizione in vitro adipociti protocollo di differenziazione, che potrebbe essere esteso per diversi trattamenti, la stimolazione o co-culture. Utilizzando nelle culture adipociti in vitro, è fattibile per determinare difetti di differenziazione degli adipociti e funzioni. Per ottenere risultati affidabili, come per tutte le celle primarie, il comportamento sano e l&#39;aspetto delle ADSCs e adipociti è molto importante. La granularità, vacuolations e / o distacco citoplasmatici sono segni di deterioramento, che indica medio inadeguata, la contaminazione microbica o senescenza del primariocellule. Questo protocollo utilizza adipociti isolati dal tessuto cuscinetto adiposo, che è pure possibile utilizzare mesenchimali cellule staminali isolate dal midollo osseo come descritto da altri protocolli 36. L&#39;ultima include cellule progenitrici stromali, che potrebbero riflettere problemi differenziazione supplementare che si verificano nella fase molto precoce di differenziazione degli adipociti, questo potrebbe essere perso nel nostro protocollo corrente. Inoltre, ADSCs possono essere espanse rapidamente (più di 10 volte entro una settimana), e ADSCs in coltura a lungo termine dopo alcuni passaggi ancora mantengono la loro pluripotenza mesenchimali 37,38. Un altro vantaggio utilizzando ADSCs è che si può facilmente passare a umano, dal momento che ADSCs possono essere raccolte da pazienti con la liposuzione, che è un metodo semplice e poco invasivo. Al influenza diversi altri organi in modo endocrino, il protocollo dovrebbe essere estesa a adipochine. Adipochine, come la leptina, adiponectina, fattore di necrosi tumorale-α (TNF) unND resistina, secreto dagli adipociti sono noti per influenzare malattie metaboliche controllando il metabolismo dei grassi, omeostasi energetica e la sensibilità all&#39;insulina 39. Pertanto, siero e adipociti secretoma analisi dovrebbero essere effettuate. Nel caso di AT erettile, adipochine e citochine pro-infiammatorie come IL-6, può portare a disregolazione di organi quali il fegato e pancreas, e della funzione muscolare 4. Al fine di escludere disfunzione d&#39;organo sistemica, modelli animali o colture cellulari potrebbero essere testati per la loro risposta al glucosio stimolazione e l&#39;assorbimento. Qui forniamo un protocollo per analizzare lo stato di base della AT e adipociti in vivo e in vitro per rivelare meccanismi molecolari di adipociti omeostasi e funzionalità.

Secondo il rapporto 2014 dell&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità, il 39% della popolazione adulta del mondo è in sovrappeso, e il 13% è obeso 1. Nel prossimo futuro, le persone in sovrappeso comprenderanno una quota significativa della popolazione anziana. Una caratteristica importante di obesità e l&#39;invecchiamento è disregolazione del grasso in relazione alla morbilità e mortalità 2. Adipochine, proteine ​​secrete dal tessuto adiposo (AT), possono innescare le sindromi metaboliche come l&#39;obesità e il diabete di tipo 2 3. Malattie metaboliche sono principalmente causati da eccessivo accumulo di energia nelle goccioline lipidiche di adipociti, che si traduce in AT espansione 4. E &#39;quindi di interesse per determinare le cause ed i meccanismi molecolari di espansione AT, al fine di trovare opportunità per controllarlo. Over-nutrizione porta ad espansione AT, che è regolata da due eventi: lo stoccaggio eccessivo di energia nelle gocce lipidiche di adipociti, un processoportando ipertrofia (aumento delle dimensioni degli adipociti), e aumento adipogenesis, noto anche come iperplasia adipocita 5. Adipogenesi è un processo di differenziazione delle cellule multipotenti mesenchimali staminali (MSC) in adipociti. In primo luogo, MSC sviluppano in preadipociti durante la fase di impegno. In secondo luogo, preadipocytes ulteriormente differenziano per acquisire le caratteristiche di adipociti maturi e funzionali 6. Diversi fattori di trascrizione sono stati identificati come maestri regolatori per la determinazione preadipocyte, come la proteina zinc finger 423 (Zfp423) e fattore di cella precoce B 1 (Ebf1). Mentre Zfp423 induce impegno precoce, Ebf1 è necessario per la generazione di progenitori degli adipociti 6. Differenziazione terminale è strettamente controllata da una cascata trascrizionale, per cui perossisomi γ del recettore proliferator-activated (PPAR) è il fattore di trascrizione essenziale 7. Ulteriori fattori trascrizionali chiave sono l&#39;/ proteine ​​enhancer-binding CCAAT (C/ EBP) i membri della famiglia (ad esempio, C / EBPα, C / EBPβ, e C / EBPδ), fattori Kruppel-like (KLFs), cAMP elemento sensibile binding protein (CREB) e di risposta rapida crescita 20 (Krox20) 6. Recentemente, è stato dimostrato che la proteina-1 (AP-1) famiglia attivatore è coinvolto nel processo di differenziazione degli adipociti 8,9. La famiglia AP-1 è costituito da un complesso proteico dimerica, composto Fos, Jun e / o l&#39;attivazione del fattore di trascrizione (ATF) membri. Fos-correlate antigene 1 e 2 (Fra-1 e Fra-2) sono in grado di regolare la differenziazione degli adipociti. Fra-1 altera differenziazione degli adipociti inibendo C / EBPα 8, mentre Fra-2 controlli adipociti fatturato 9. Fra-2 in tal modo non si riduce solo il numero degli adipociti reprimendo espressione PPARγ2 durante la differenziazione degli adipociti, ma diminuisce anche adipociti apoptosi attraverso la repressione diretta dei fattori ipossia-inducibile (HIF) espressione. La famiglia HIF è un heterodimeric complesso fattore di trascrizione, composto da HIF-1α, HIF-2α e HIF-1β. I eterodimeri sono costituiti da una proteina di ossigeno-sensibili HIF-α (HIF-1α o HIF-2α) e l&#39;HIF-1β subunità ossigeno-insensitive 10. Durante normoxia, proteine ​​HIF-α sono poli-ubiquitinylated e sono finalmente degradati da proteasomi 11. In condizioni di ipossia, si verificano in corso di espansione, proteine ​​HIF-α non sono più idrossilato. Essi hanno quindi diventano dimeri stabilizzati e forma con l&#39;HIF-1β costitutivamente espresso. Attivazione trascrizionale di geni controllati dagli elementi di risposta HIF è coinvolto nella regolazione dell&#39;angiogenesi, il metabolismo, e l&#39;infiammazione 12. Infatti, HIF-1α promuove AT disfunzione inducendo tolleranza al glucosio, inibendo dispendio energetico e l&#39;utilizzo periferico lipidi, nonché aumentando livello leptina e HFD indotta steatosi epatica 13. Inoltre, HIF-1α regola adipocyte apoptosi in vivo e in vitro 9. Il presente Protocollo descrive i metodi per lo studio in uno stato di svelare le caratteristiche molecolari di adipociti omeostasi in topi adulti. Essa mostra come l&#39;apoptosi, la proliferazione e la differenziazione di adipociti in vivo e in vitro possono essere regolate da ipossia. Per fare ciò, usiamo topi con adipociti specifico delezione di Fra-2 generato incrociando topi che trasportano i Fra-2 alleli floxed con i topi FABP4-CreERT 9. Utilizzando topi FABP4-Cre ERT, l&#39;eliminazione è adipociti specifica e inducibile per iniezione tamoxifene 14. Per il modello per adulti, intra iniezioni peritoneali di tamoxifene sono eseguite in 5 giorni consecutivi a partire all&#39;età di 6 settimane. Così, i topi sono sottoposti ad una dieta ricca di grassi o normale dieta per 6 settimane prima dell&#39;analisi è fatto. I topi utilizzati in questo studio sono stati maschio basano su uno sfondo C57Bl6 evitare ormoni femminili, quali estrogeni, Mostrato per regolare la distribuzione del grasso corporeo 15. Utilizzando un altro background genetico potrebbe anche alterare il fenotipo metabolico, a causa delle differenze di deformazione connessi nella gestione dei lipidi 16. Questo protocollo dimostra come analizzare al di sotto ipossia con istologia e come quantificare l&#39;apoptosi degli adipociti, proliferazione e la differenziazione in vivo utilizzando immunoistochimica e analisi del gene profiling. Lo studio è completato da esperimenti in vitro, che mostra come analizzare differenziazione degli adipociti primaria e l&#39;apoptosi alterato da esposizione a ipossia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td rowspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td>Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160; Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
			<td>550609</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>640906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb</td>
			<td rowspan="2">Cell signalling</td>
			<td>9664S</td>
			<td>&#160;Clone 5A1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>9664</td>
			<td>Apoptosis marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1 Plus Kit</td>
			<td>Hypoxyprobe</td>
			<td>HP2-200Kit</td>
			<td>Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG&#8321; monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000 Reagent&#160;</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>T3605</td>
			<td>Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation&#8260;Emission: 642&#8260;661 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hemalum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109249</td>
			<td>hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pegGOLD TriFast</td>
			<td rowspan="3">Peqlab</td>
			<td>30-2030</td>
			<td>TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percellys Ceramic Kit 1.4 mm</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>tubes containing ceramic beads (1.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24</td>
			<td>91-PCS24</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody</td>
			<td rowspan="2">Pierce</td>
			<td>PA1-16601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13</td>
			<td>700505</td>
			<td>Hypoxia marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 684 795 001</td>
			<td>TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>318906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Solution (1 unit/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="4">Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>PK-4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanism of regulation of adipocyte numbers in adult organisms through differentiation and apoptosis homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Mostriamo come determinare adipociti omeostasi in vivo e in vitro, utilizzando l&#39;esempio di Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT rispetto al wild-type cucciolata. Il nostro protocollo definisce come una maggiore espressione di HIF da ipossia è correlata con una disfunzione degli adipociti, come indicato da un aumento della apoptosi degli adipociti. topi aumento delle dimensioni degli adipociti e la zona a dieta ricca di grassi (HFD) trattati Over-nutrizione, tra gli altri fattori, si traduce in adipociti ipertrofia, causata da un eccessivo accumulo di energia nelle goccioline lipidiche. La dimensione degli adipociti e la zona è un indicatore di ipertrofia. Le sezioni del cuscinetto adiposo da normale (ND, figura 6a) e dieta ricca di grassi (HFD, figura 6b) topi e quantificazioni della dimensione degli adipociti e la zona mostrano chiaramente l&#39;ipertrofia degli adipociti dopo 6 settimanes di HFD, che è indicato da un aumento della dimensione degli adipociti nei topi trattati HFD (Figura 6c e d). L&#39;aumento ipossia nel tessuto adiposo (AT) degli adulti Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT porta ad un aumento di livello di HIF-1α e adipociti apoptosi Per determinare lo stato in vivo di ipossia in AT, Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT vengono analizzati 6 settimane dopo Fra-2 delezione all&#39;età di 12 settimane e confrontati con wild-type cucciolata. Pimonidazole viene somministrato a topi per via intraperitoneale come un marcatore ipossia efficace; non è tossico e in grado di distribuire in AT. Adipociti di ipossia in AT in vivo sono definiti dalla colorazione anticorpale immunoistochimica (Figura 7a). Inoltre, l&#39;aumento dello stato ipossico della AT nei topi è accompagnata da un aumento di HIF-1α ADIP positivoocytes come indicato dalla colorazione immunoistochimica figura 7b), che viene confermato dalla quantificazione dei livelli di espressione di HIF-1α e suoi obiettivi geni 9. Inoltre, TUNEL colorazione di sezioni a da Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT e nidiata di controllo (Figura 7c) mostra che l&#39;aumento degli adipociti apoptosi è correlata con la presenza di ipossia e di espressione di HIF-1α. L&#39;aumento dell&#39;espressione di HIF-1α in adipociti primari attraverso l&#39;ipossia indotta l&#39;apoptosi degli adipociti Per analizzare adipociti apoptosi in vitro, usiamo adipociti generati da cuscinetti di grasso sottocutaneo come descritto altrove 20. Come previsto, l&#39;espressione di HIF-1α in adipociti aumenta dopo 24 ore di ipossia (figura 8a). Per analizzare ulteriormente le attività di HIF-1α, i livelli di RNA di destinazione HIFgeni, come Inos (inducibile ossido nitrico sintasi) sono quantificati per qPCR. Figura 8b mostra che l&#39;aumentata espressione di HIF-1α in condizioni di ipossia porta ad aumento del livello di mRNA Inos. Dal momento che abbiamo già dimostrato in vivo (Figura 8), che ha aumentato l&#39;espressione di HIF-1α in adipociti correla con un aumento dell&#39;apoptosi degli adipociti, l&#39;apoptosi è anche quantificato in colture in vitro per annessina V colorazione in condizioni di ipossia. In accordo con i dati in vivo (Figura 7), un aumento del livello di HIF-1α è accompagnato da un aumento della apoptosi degli adipociti indotta da condizioni di ipossia (figura 8b). Inoltre, per dimostrare che l&#39;apoptosi ipossia indotta è HIF-dipendente; HIF-1α o HIF-2α è tacere da RNA interference in adipociti derivati ​​da wild-type o Fra-2 topi deficienti. L&#39;aumento di apoptosi degli adipociti viene ripristinata mettendo a tacere HIF-1α o HIF-2α come mostrato da Annessina<html> V colorazione in figura 8b, dimostrando che il sensore di ipossia HIF-α regola l&#39;apoptosi degli adipociti. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> Figura 6: Aumento della dimensione degli adipociti e la zona a dieta ricca di grassi topi (HFD) (a, b) H &amp; E colorazione di sezioni del cuscinetto adiposo perigonadal di topi wild-type maschi alimentati con dieta normale (ND) (a) o alto. dieta -Fat (HFD) (b) per 6 settimane. Barre rappresentano 500 micron. (C, d) quantificazioni delle dimensioni degli adipociti (c) e l&#39;area (d) del cuscinetto adiposo perigonadal di topi wild-type alimentati con ND (a) o HFD (b) per 6 settimane. n = 10. I dati sono riportati come valori medi ± SEM. L&#39;analisi statistica è stata effettuata utilizzando dello studente t-test. *** P &lt;0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> Figura 7: Aumento del livello di HIF-1α e apoptosi negli adipociti di adulti Fra 2-FL / FL topi FABP4-CreERT. L&#39;ipossia (a) e HIF-1α (b) colorazione in AT di Fra-2 fl / fl topi FABP4-creERT e controllo littermates maschi di 6 settimane dopo l&#39;iniezione tamoxifene maschile. Ingrandimento 20X, 40X inserire. frecce nere indicano le aree ipossiche e cellule positive HIF-1α. (C) TUNEL in Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT e fratellini di controllo a 6 settimane dopo l&#39;iniezione tamoxifene. Ingrandimento 20X, 40X inserire. frecce nere indicano cellule positive TUNEL. Questa cifra è stata modificata da Lutero etal. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> Figura 8:. L&#39;aumento dell&#39;espressione di HIF-1α e adipociti apoptosi in adipociti primari indotti da ipossia (a) Real-time PCR di HIF-1α e di destinazione HIF livelli Inos mRNA in adipociti primari sistemati in camere ipossiche analizzato nei punti di tempo indicato. (B) Quantificazione dell&#39;apoptosi da annessina V FACS colorazione in adipociti primari isolati da Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT o controlli wild-type trasfettate con controllo sh o sh plasmide contro HIF-1α o HIF-2α e posto sotto l&#39;ipossia (1% O 2) per 24 ore. Questa cifra è stata modificata da Lutero et al. <sup&gt; 9. I dati vengono visualizzati come valori medi ± SD L&#39;analisi statistica è stata effettuata utilizzando t-test di Student. * P &lt;0.05 e ** P &lt;0,01 sono stati accettati come significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l&#39;apoptosi omeostasi

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.9K Views.  Universitätsklinikum Erlangen. Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

Derivazione e differenziazione delle cellule mesenchimali ovarico canini

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Visualizzare Drosophila gamba del neurone di motore assoni attraverso la cuticola adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.