Name: analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning
Uploaded: 2016-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

אנו מודים תומאס בייטס לקריאת האנושות ושיפור כתב היד. אנו מודים גם כריסטינה אברט וסברינה Stötzer לצורך תחזוקת דגים.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם &quot;העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה&quot; וכן את הפריט לגרסה הנוכחית של החוק הגרמני על ההגנה על בעלי החיים. 1. הכנת אנטיסנס-Morpholino (MO) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון המניה 3 מ&quot;מ MO, להוסיף 100 μl של מים סטריליים, ultrapure אל MO lyophilized (300 nmol ב בקבוקון זכוכית). עבור פירוק מוחלט, לחמם את פתרון מניות 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חותם את הבקבוקון עם Parafilm ולאחסן את פתרון המניות MO בטמפרטורת החדר (RT). אל לצנן את פתרון המניות MO, כיוון שזה עלול לגרום עמותה של MO עם קירות בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה 1 מ&quot;מ MO על ידי דילול פתרון המניות MO עם מים סטריליים, ultrapure ולהוסיף פתרון אדום 0.5% פנול לריכוז סופי של 0.05%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל 10 μl של פתרון עובד MO, להוסיף 3.3 μl MO פתרון המניות 1 μl של 0.5% פתרון פנול אדום כדי 5.7 מים μl. לִהיוֹתקדמי מכינה קבוצה חדשה של פתרון עובד לחמם את פתרון מניות MO עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, צנטריפוגות הפתרון עובד MO כדי למנוע סתימת המחט. לדוגמה, ספין 10 μl של פתרון המניות MO ב 15,000 XG במשך 5 דקות (RT) ולהסיר 8 μl של supernatant להזרקה. הערה: הפסד של פעילות עלולה להתרחש בפתרונות morpholino לאורך זמן 11. כדי לא לכלול את זה, אפשר לבחון את הפתרונים על ידי ספקטרומטריית UV בעקבות הפרוטוקול המסופק על ידי היצרן. במקרה של wt1a בשימוש morpholino אפקטיבית מופחת לא נצפה על פני תקופה ארוכה של אחסון (3 פתרון עובד מ&quot;מ אוחסן זמן רב יותר מאשר אחד שָׁנָה). </li></ol> 2. הגדרת זוגות זיווג וגביית ביצים מופרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחר הצהריים לפני microinjection, להגדיר חמישה זוגות של Tg (wt1b: GFP) קו, כל במיכל רבייה מצויד מסננת נשלפת להפרידזכרים ונקבות במהלך הלילה. הערה: כדי להבטיח כי ביצים מספיק זמינות עבור ניסוי זריקה מוצלח, דגים משמשים זוגות הזדווגות צריכים כבר הוקרנו מראש ומוערכים כמו &quot;מפיקים&quot; טובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, אחרי שהאורות נדלקים, לשים את הזכר והנקבה ביחד מעל המסננת שמונעת את הדגים אוכלים את ביציהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה ההשרצה. לאחר שסכום של הביצים מוטלות כי ניתן להזריק לפני שלב 4 תאים הוא הגיע (כ -50), נפרדים לגברים מנקבה שוב. מעבירים את הביצים עם פיפטה פסטר לתוך צלחת פטרי מלא מים העובר לסיבוב הראשון של הזריקה. כדי לקבל סיבובים נוספים של ביצים, למקם זוג הזדווגות יחד ונפרד מספר פעמים. </li></ol> 3. עבודת ההכנה Microinjection הערה: בצע את השלבים 3.1 ו -3.2 מראש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מנה שמכילה את העוברים בעמדה במהלך (צלחת microinjection) הזריק להכניס GLשקופית תחת בזווית 40-45 מעלה לתוך צלחת 94 מ&quot;מ פטרי מלא סיליקון נוזלי, שקוף, טהור, מזון כיתה. להסיר את השקופית כאשר סיליקון מוקשה. שמייצר חריץ בשכבת סיליקון. הערה: לחילופין, להשתמש 1.5-3% agarose במקום סיליקון ולאחסן את המנה על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מחטי הזרקה מתוך נימי זכוכית עם חולץ מחט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נימים המכילים סיבים פנימיים. הערה: הנימה תעזור להעביר את פתרון MO לכיוון קצה המחט לאחר למלא את המשבצות (ראה 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים הגדרות מתאימות על חולץ המחט. מחטים טובות להזרקה לתוך דג זברה צריכות טיפים ארוכים ודקים 12. צור טיפים באורך של כ 10 מ&quot;מ ו בקוטר של 1.5-2 מיקרומטר שנמצאים בשלב האחרון שלהם. לדוגמה, השתמש חולץ מחט אופקי עם ההגדרות הבאות: חום = 330, משוך = 0, מהירות = 40, זמן = 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות המחטים תחתמיקרוסקופ לנתח ולמיין אותם החוצה עם טיפים קצרים או ארוכים מדי. הערה: מחטים עם טיפים קצרים נוטות לפגוע בעובר בזמן כזה עם מאוד ארוכים ודק טיפים לכופף כשנוגעים סיסי ואינה לחדור אותו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשאים למלא את המחט עם 2 μl של פתרון עובד MO באמצעות טיפ microloader והכנס אותו לתוך מחזיק מחט של מנגנון microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו מחטים סגורות בסוף טיפ, ליצור פתח ידי צובט בחזרה הסוף של המחט עם פינצטה חדה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לחלופין להשתמש במנגנון microinjection לדחוף בעדינות את הקצה על גבי משטח קשיח (למשל. גוש מתכת קטנה או אחורי של פינצטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את עוצמת הזריקה על ידי הזרקת הפתרון עובד MO לתוך טיפה של שמן מינרלי להציב על graticule. התאם את משך ההזרקה להפקה בקוטר ירידה של 75 מיקרומטר להשיג נפח הזרקה של כ 200 pl. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. נוהל microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדר את בעוברי 1 תאים לאורך החריץ של מנת microinjection עם המוט הצמחי לכיוון לכיוון שממנו המחט מגיעה (לכיוון זווית 45 ° של החריץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את סיסית ואת החלמון עם מחט להזריק 200 pl של הפתרון עובד 1 מ&quot;מ MO (0.2 pmol) בחלמון של 1- עוברי 2 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר עם פתח רחב, לאסוף את כל עוברים המוזרקים בצלחת פטרי מלאת מים העובר דגירה אותם על 28.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעות אחר הצהריים, להסיר עוברת מתים באמצעות פיפטה פסטר עם פתח רחב ולהחליף את המים העוברים. </li></ol> 5. הכנה עוברת עבור in vivo הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להחליף את המים העובר במי עובר המכילים 0.003% N-phenylthiourea (PTU) לעכב melanization. אין ליישם PTU לפני תום gastrulation כי זה interfEres עם התפתחות עוברית מוקדמת. זהירות: PTU הוא רעיל טרטוגניות. יש להשתמש בכפפות בכל עת ולהימנע משאיפת ומגע עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים עם פינצטה חדה תחת מיקרוסקופ לנתיחה בשלב ההתפתחותי הרצוי. תפוס את סיסי עם אחד פינצטה ולנסות לתפוס את הצד השני של סיסי עם זוג נוסף של פינצטה. משוך בזהירות את פינצטה בכיוונים מנוגדים מבלי לשבש את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העובר על ידי החלפת המים העובר המכיל PTU (0.003%) עם מים העובר המכיל PTU (0.003%) ו- 0.02% אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את העובר התכה נמוכה agarose על צלחת-μ תחתית-coverglass עם רשת רילוקיישן 50 מיקרומטר. הטבעה פרופר דורש קצת תרגול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 aliquots מ&quot;ל של agarose 0.7% ב 1.5 מ&quot;ל צינורות התגובה ולשים אותם על גוש חום מוגדר 36 ° C. השתמש פיפטה פסטר עם פתח רחב TRAnsfer העובר על צלחת μ. סר מים העובר עודפים באמצעות פיפטה פסטר עם קצה אולטרה-דק כיסוי העובר עם agarose מחוסמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד agarose עדיין נוזלי, כוון את העובר עם שני טיפים ג&#39;ל מטעין במיקום הרצוי, בכל הנוגע למבנה של עניין, כמו גם את המרחק לרשת רילוקיישן. מניחים את המבנה של עניין (כאן כִּליַת רֵאשִׁית) קרוב ככל האפשר אל תחתית זכוכית (כאן: הגב למטה) ואת באזור קרוב לרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת איכות תמונה אופטימלית למזער את שכבת agarose בין העובר לבין תחתית זכוכית על ידי הצבת מבנה עניין של העובר קרוב ככל האפשר אל תחתית. חוץ מזה, לאתר את העובר באזור קרוב לרשת אבל לדאוג כי הרשת לא שכבה עם המבנה של עניין. להטביע 3-4 עוברים μ-מנות שונות בכל ולהשתמש אחד כי הוא בעמדה הטובה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר agarose הוא מספיק חזק כדי להחזיק את ההמתנה העובר על 2-3 דקות ו כיסוי העובר המוטבע עם מי עובר המכילים PTU 0.003% ו- 0.02% Tricaine. למזוג את המים העובר העודפים או להסיר אותו באמצעות פיפטה פסטר עם קצה דק במיוחד. סגור את המכסה של μ-מאכל למצב נעילה כדי למנוע אידוי. הערה: למנוע את התרחשותם של בועות אוויר μ-הצלחת, כפי שהם יפגעו הקלטת תמונה. </li></ol></li></ol> מיקרוסקופי 6. הערה: השתמש מיקרוסקופ מצויד חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. תמונות שיא עם תוכנה המכילה את המודולים הבאים: רב-ערוצים, Z-Stack, סדרות עתיות, מיקוד אוטומטי תוכנת פוקוס מורחב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת ערימות-Z <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את צלחת μ. תחתית הזכוכית עומדת עתה בפני לעבר המטרה לבין μ-הצלחת משמשת תא הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתג את המחוון למצב הרשת ולאפשר מצב תאורה מובנית בבקרת התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְדַרֵגמוקד הרשת עבור הערוץ (ים) של בחירה עם הדגימה להיבדק (עובר מוטבע) על ידי ביצוע ההוראות של אשף כיול הפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מצב הרכישה z-סטאק אותה למצב במרכז. פוקוס לאמצע הדגימה ולהגדיר אותו כשהמטוס במרכז ערימת z- ידי לחיצת המרכז. הגדר את הממד של Z- מחסנית על ידי הגדרת הטווח סביב למצבה האמצעית. הערה: מבני אובייקט אין לראות בחדות מחוץ הראשון והמטוס האחרון של Z- המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המרווח בין חלקים אופטיים. עבור z ​​ברזולוציה הטובה ביותר ללחוץ על הכפתור האופטימלי. בהתבסס על עומק המטרות בתחום התוכנה תקבע מרחק מומלץ בעקבות קריטריום נייקוויסט (חפיפת 50%). הערה: אם מכוון קבצים קטנים יותר ואת היתרי המבנה, להגדיר גודל מרווח גדול באופן ידני. הגדרת צעדים קטנים יותר מהמומלץ רק תגרום גדלי קבצים גדולים יותר מבלי להגדיל מאוחר יותרמידע al. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן לשגות הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את כלי סדרה עתית להגדיר את מרווח הזמן של הניסוי סדרת זמן. לדוגמא שיא Z- מחסנית תמונות כל 30 דקות במשך תקופה של 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את נדידת מוקדים לאורך זמן, להגדיר אסטרטגית פוקוס אוטומטית. בדוק את תיבת הדו-שיח אסטרטגית הפוקוס, בחר מיקוד אוטומטי תוכנה מהרשימה הנפתחת ולבחור את ערוץ TL-Brightfield כערוץ התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל כל נקודת זמן עם הפוקוס האוטומטי. על מנת להבטיח טווח חיפוש אמין בתוך מסגרת זמן אופטימיזציה, להגדיר טווח חיפוש ביחס קבוע 200 מיקרומטר. טווח זה נסרק באופן מלא (פרמטר טווח כיסוי) עם איכות בסיסית (פרמטר איכות) בתוך גודל צעד מקסימאלי (פרמטר דגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיל את הדיוק של הפוקוס האוטומטי, הפעל את שיטת המדידה בתוך אזור מיקוד של עניין (ROI פוקוס) ומצבה אמר ROI הפוקוס בחלון התצוגה החי סביב המבנה של עניין. הערה: אםהמחשב חסר מודול המיקוד האוטומטי תוכנה אשר מעדכן את Z-Position המרכז אוטומטי במהלך הקלטת הזמן לשגות, להשהות את הניסוי בכל זמן נתון ולהתאים את הפוקוס באופן ידני להמשיך בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפצות על xy להיסחף פוטנציאל במהלך הקלטת סדרות זמן, מקם נקודה מסוימת של הרשת המוטבעת (של חדר ההדמיה) לתוך הכוונת של התוכנה ולשמור את המיצוב על ידי ביצוע צילום מסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ניסוי סדרת הזמן. לפני הפסקת סדרת הזמן נגמר, להשהות את הניסוי, ואם יש צורך, להתאים מחדש מיצוב לפי המסך. המשך עם הניסוי. </li></ol></li></ol> עיבוד תמונה 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסיית העיבוד ובחר את העומק המורחב של הפוקוס (EDF) בתיבת הדו-שיח השיטה. מאז חלקים אופטיים נרכשים, להחיל את אלגוריתם ההקרנה המקסימאלי לסדרת התמונה. הערה: הנה האלגוריתם יהיה להקרין את brightest או הפיקסל הכהה ביותר מ ערימת תמונת 2D מורכבת בשלב ראשון, ובסופו של דבר להשתמש אחד עם השונות הגבוהות ביותר כתמונת תוצאה עבור כל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשיטת יצוא הסרט ליצור סרט זמן לשגות (למשל קובץ avi או להזיז) מתוך הסדרת תמונת EDF. </li></ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Drummond, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+filtration+apparatus+in+zebrafish+requires+Nephrin,+Podocin+and+the+FERM+domain+protein+Mosaic+eyes.">Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes.</a> Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Kreidberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt-1+Is+Required+for+Early+Kidney+Development.">Wt-1 Is Required for Early Kidney Development.</a> Cell. 74 (4), 679-691 (1993).</li><li>Bollig, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).</li><li>Schnerwitzki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Wilms+tumor+suppressor+1+(Wt1)+exon+4+results+in+protein+isoforms+with+different+functions.">Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions.</a> Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).</li><li>Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+morpholino-based+screening+in+zebrafish.">Lessons from morpholino-based screening in zebrafish.</a> Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).</li><li>Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+fish:+efficient+selection+of+transgenic+fish+by+co-injection+with+a+fluorescent+reporter+construct.">Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+imaging,+Part+2:+an+overview+of+fluorescence+microscopy.">Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).</li><li>Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+structured+illumination+microscope.">Optimization and characterization of a structured illumination microscope.</a> Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).</li><li>O'Brien, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1a,+Foxc1a,+and+the+Notch+mediator+Rbpj+physically+interact+and+regulate+the+formation+of+podocytes+in+zebrafish.">Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish.</a> Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).</li></ol>

המחבר מיכאל גראף הנו עובד GmbH המיקרוסקופית Carl Zeiss שמייצרת ומכשירים המשמשים במאמר זה.

דג הזברה הפכה אורגניזם מודל פופולרי ללימודי פיתוח חוליות והכנת דגמים של מחלות אנושיות. בגלל עובר דג זברה לשמור על שקיפות, איברים מתפתחים כמו מוח ולב ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ הכנה סטנדרטית. ניצול קווים מהונדסים עם קרינה ספציפית איבר מאפשר הערכות של organogenesis ברחבי בשלבים שונים של פיתוח בתוך עוברי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מגבלה אחת הדמית פרטים מבניים של איברים שלמים עם מיקרוסקופיה epifluorescence הסטנדרטית היא ההשפעה של אותות מעצמים מעל ומתחת מישור המוקד. Out-of-ההתמקדות זו אור לא רק תוצאות בניגוד תמונת ירד ורזולוציה, זה גם עלולה לטשטש מבנים חשובים של עניין 13,14. מספר טכניקות כגון confocal- סריקת לייזר, ספינינג דיסק confocal- או מיקרוסקופיה multiphoton פותחו כדי למזער את המידע מחוץ פוקוס ובכך והעלייהדואר ניגודיות תמונה וכן פתרון צירי. שיטה חלופית להשיג חלקים אופטיים היא מיקרוסקופיה תאורת laser- וסריקה חינם המובנה, טכניקת תאורה רחבה מבוסס בתחום שהוא ופשוט ליישם על מיקרוסקופ רגיל 15. התוצאות המוצגות כאן להמחיש כי חתך אופטי, מושגת על ידי תאורה מובנהית, מיושם על מיקרוסקופ לנתח בשילוב עם שחזור של תמונות מוקד מורחבות, מאפשר הדמיה של פרטים מבניים של נורמה ומוטרדת פיתוח כלית דג זברה. בפרט, תאי GFP-חיובי morphants wt1a מפוזרים בעומקים שונים מוקדים, ותמונות של רק במישור אחד עם טשטוש מוקד out-of-היו לזלזל שלוש מורכבות הממדים של פנוטיפ. כדי לעקוב אחר הדינמיקה של ארגון איבר, התארגנות או שיבוש, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות הוא חזק אם כי טכניקה מורכבת. במהלך זמן לשגותתנודות הדמיה קלות או תנודות טמפרטורת קטין לגרום ונסחפו x, בכיוון y או z. זה דורש ציוד נוסף (בתא סביבתי, שולחן נגד רעידות) על מנת להשיג תוצאות יציבות. השיטה המוצגת משתמשת היכולת של מיקרוסקופ לנתח עם כונן מוקד ממונע להקלטת זמן לשגות תמונות ללא התקנים נוספים. כדי לשמור על מיקוד יציב, אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה רשת רילוקיישן המוטבעת לתוך החלק התחתון של תא ההדמיה שמשה תיקון של x, חוסר יציבות y-. הטבעה תקינה של העובר היא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול. חלק באימון יש צורך למקם את המבנה של ריבית קרובה ככל האפשר אל תחתית הזכוכית באזור קרוב לרשת ללא שכיסה עם זה. היתרון העיקרי של השיטה היא שהיא כלי זול ופשוט להסתכלות ישירה של תהליכים התפתחותיים כגון צמיחה והגירה בשנתי חייםעובר על פני כמה שעות. יתר על כן, את היתרונות מיקרוסקופ ספציפי לנתיחה כגון שדה גדול של תצוגת מרחק עבודה ממושכת להקל בחינת מדגמים גדולים כולל איברים שלמים. עם זאת, כמה מגבלות צריכות לזכור. ההשהייה של הניסוי כדי לבדוק ולתקן את המיקום שהופכת את ההליך זמן רב והיעדר בקרת טמפרטורה חזקה משנה את הזמן התפתחותי &quot;הרגיל&quot;, אשר מוגדר הפרית שעות שלאחר על 28.5 מעלות צלזיוס למשך דג זברה 16. בעיה נוספת היא פוטנציאל העומק המוגבל של הדמיה לתוך החיה, במיוחד כאשר המבנה של העניין ממוקם בתוך העובר או זחלים. מבנה כזה הוא glomerulus pronephric דג הזברה, אשר ממוקם בין somites ואת שק החלמון. עומק הגבלת הדמית glomerulus נמצא כ -200 מיקרומטר, מרחק כי הוא הגיע אחרי 5 ימים של התפתחות. בניגוד לכך, מבנים פלורסנט שאינן located קרוב לפני השטח של החיה ניתן הדמיה למשך זמן ארוך יותר. לדוגמא תאי כבד נגישים הדמיה לפחות עד 9 DPF. מגבלה נוספת היא כי חוסר תנועה לטווח ארוך של העובר או זחלי agarose וטיפול Tricaine לגרום פיגור גדילה בצק לב, בהתאמה. בגלל זה עלול להפריע להתפתחות תקינה, מומלץ להגביל את משך ההקלטה זמן לשגות לתקופה מסוימת של עניין. לוודא שבתקופת מבני הדמיה של עניין להתפתח בצורה תקינה כדאי להשוות (בסוף) המראה הכללי עם זה של חיה כל זמן תחת אותם תנאים ניסיוניים אך ללא הטבעת הרדמה. קלטת Z- מחסנית של חלקים אופטיים כל 30 דקות במשך תקופה של 5 שעות והחישוב הבא של עומק תמונות מוקד מורחב ספקו מידע במרחב ובזמן על אירועים המוקדמים של נורמה ומוטרדת פיתוח כליה אשר הושר בy morpholino בתיווך מציאה של wt1a. בעבר ניסויים שבוצעו מציאת morpholino כבר הראו כי Wt1a ממלא תפקיד מוקדם והכרחי ביצירת כִּליַת רֵאשִׁית הכלאה באתרו בטוש כליות 17,18 ותעסוקה של wt1b המהונדס. שורת GFP לפיתוח כִּליַת רֵאשִׁית הדמיה בזמן הקצוב מצביעה 9,10 גילו כי תוצאות מחסור wt1a ב morphogenesis גלומרולרי שבש ונכשלו מפרט podocyte. בניגוד לגישות סטטי אלה, הקלטות הזמן לשגות לדמיין דינמיקה ישירות של nephrogenesis מוקדם עובר מלא נדידת תאי GFP חיובי משם מאזור pronephric ב morphants wt1a. האפשרות לעקוב אחר תאים misrouted לאורך זמן מאפשר ניתוח פנוטיפ מפורט יותר. באופן כללי, השיטה המוצגת כאן מספקת זול וקל לשימוש חלופי למתחם, ופחות נגיש setups המשמש בדרך כלל זמן לשגות הדמיה כגון מיקרוסקופ סורק לייזר (מצויד בתא סביבתי ושולחן נגד רעידות) או מיקרוסקופ גיליון אור. שהגרה תארה לתקן בעיות להיסחף יכולה להיות מיושמת גם לבצע זמן לשגות תמונות על setups ללא אפשרויות חתך אופטיות, כגון מיקרוסקופי סטריאו הקרינה. הטכניקה היא לא רק מתאים לחקור פיתוח כליות אבל יכולה להיות מיושמת גם כדי לפקח המורפוגנזה נורמלי ופגום של איברים אחרים, כגון לב או כבד. יתר על כן, השיטה יכולה לשמש כדי לבחון תהליכים דינמיים שונים יותר באורגניזמים מודל עוברי המבוגר כגון ריפוי פצעים או התחדשות.

בעקבות gastrulation, organogenesis הוא השלב הבא של מחזור החיים של הפרט. היא כוללת את הסידור מחדש, אינטראקציה ולעתים קרובות הגירה של תאים לייצר רקמות ואיברים. חוסר דיוק בתהליכים שבבסיס התפתחות האיברים מוביל לעתים קרובות מחלות שיכולות להתבטא מייד או גם בשלב מאוחר יותר בחיים. לפיכך, הבנת organogenesis כבר מאמץ אדיר בביולוגיה התפתחותית מחקר ביו. על מנת להיות מסוגל לחקור את הפיתוח של איבר מסוים, זה חייב להיות גלוי אפילו דרך קיר הגוף של העובר. זה מאפשר הקלטה של ​​שינויים במרחב ובזמן המתרחשות במהלך הפיתוח. כמו כן על מנת לנתח את החשיבות של הגורמים המעורבים organogenesis, זה צריך להיות רגיש מניפולציה. אורגניזם אחד כי הוא מתאים מאוד לחקירת organogenesis in vivo הוא דג הזברה. שלה transparency במהלך התפתחות עוברית בשילוב עם השימוש בקווים מהונדסים ניאון מאפשר תצפית של דינמיקת לוקליזציה ביטוי חלבון, כמו גם ההדמיה של האיברים הפנימיים 1. זה מספק יתרון ייחודי בדבר בירור פיתוח איברים בזמן אמת לעומת דגמים יונקים שאיבריהם אינם נגישים עבור ניתוח מיקרוסקופי. יתר על כן, כלים שונים זמינים כדי לתפעל התפתחות עוברית של דג זברה. לצד הדור של קווים מוטנטים, oligonucleotides morpholino antisense (MO) יכול לשמש מציאה הפעילות של גנים מסוימים כי הם מעורבים בהתפתחות איברים מסוימים. MOS למקד אתר שחבור או קודון ההתחלה translational (אוגוסט), ובכך להפריע שחבור של טרום mRNA או תרגום. הכליה העוברית דג הזברה, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל פשוט אנטומית אבל יקר ללמוד פיתוח כליות הפונקציה של genes הקשורים למחלות כליה 2. הוא מורכב רק שתי יחידות תפקודיות בשם nephrons. כל נפרון מורכב glomerulus שבו סינון הדם מתבצע 3. מרכיבים נוספים הם באזור הצוואר הקצר והן אבובית המפולחת להפרשה ואת הספיגה של מומס ואת הצינור, המסתיימת הביב 4. לא משנים הרכבו פשוט, הארגון ואת סוגי התאים השונים של כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה דומים מאוד בכליות היונקות 5,6. גורם אחד, אשר הוא קריטי מעורב בפיתוח כליות, מקודד על ידי הגן המדכא גידולים ע&quot;ש ווילם Wt1 7. דג זברה להחזיק שני paralogs שנקרא wt1a ו wt1b לידי ביטוי בתבנית חופפת אך לא זהה במהלך פיתוח של כִּליַת רֵאשִׁית 8. באמצעות דג הזברה מהונדס עם מבנים כִּליַת רֵאשִׁית GFP שכותרתו, הוכח כי עקום למטה המלא של wt1a &lt;/ em&gt; או של צורה אחוי מסוימת מוביל מומים חמורים או מתונים של הכליה העוברית, בהתאמה 9,10. השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של nephrogenesis נורמלי לקוי עוברי דג הזברה על ידי העסקת מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי מצויד עבור חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. סעיפים אופטיים בכלל מאפשרים רכישת תמונות שרק מכילות מידע פוקוס. Out-of-מוקד מידע יכול להימנע על ידי גישות שונות כגון אלגוריתמים מתמטיים (למשל. Deconvolution), עיצוב אופטי (מיקרוסקופיית לייזר confocal למשל) או שילוב של שניהם (למשל תאורה מובנה). כדי להשרות פגמים בפיתוח כליות השתמשנו antisense MO נגד wt1a שהזריקו קו דג הזברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)). שורה זו מציגה-GFP קרינה ב glomerulus, הצוואר הקדמיחלק אבובית 9,10. בהשוואת setups מורכב יותר להקלטות זמן לשגות עם חתך אופטי כגון סריקת ליזר או מיקרוסקופי גיליון אור, מיקרוסקופ זום קל לטפל ופחות יקר. יתר על כן, ציוד תאורה מובנה ניתן לשלב בקלות עם ציוד הקרינה קונבנציונאלי (למשל הקרינה מנורה, מסננים) והצעות לנתח יתרונות ספציפיים מיקרוסקופ כגון מרחק עבודה המורחבת שדה גדול של תצוגה. בעיות עם להיסחף נפתרו ללא שימוש בציוד נוסף (בתא סביבתי, שולחן נגד רעידות) בדרך כלל נדרש עבור תוצאות יציבות. כדי לתקן את נדידת מוקדי אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה ותאי הדמיה עם רשתות רילוקיישן מוטבעות נוצלו כדי להתאים מחדש את המיצוב בעקבות סחף x או בכיוון y. השיטה המוצגת יכולה לחול גם על מיקרוסקופים ללא אפשרויות חתך אופטיות, כגון מ &#39;סטריאו הקרינהicroscopes ומציע אלטרנטיבה ציוד מורכב יותר כי משמשת בדרך כלל עבור ההקלטה זמן לשגות של רקמות בפיתוח ודינמיקה איברים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Morpholino</td><td>Gene tools, LLC</td><td>Standard control oligo</td><td>Prepared&amp;nbsp;control&amp;nbsp;oligo</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;wt1a&lt;/em&gt; Morpholinos&amp;nbsp;</td><td>Gene tools, LLC</td><td>customized</td><td>Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. &lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>0.5% Phenol red solution</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Injection tracer</td></tr><tr><td>peqGOLD universal agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td>To prepare microinjection dish</td></tr><tr><td>Glass capillaries&amp;nbsp; (GC100F-10)</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>30-0019</td><td>To generate injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>To load the microinjection needle</td></tr><tr><td>Dumont forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Sience Tools</td><td>91150-20</td><td>To generate an opening at the needle tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Embryo water (0.3x Danieaus&amp;acute; solution)</td><td></td><td></td><td>1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;,&amp;nbsp; 0.6 Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!</td></tr><tr><td>Graticule 5 mm/0.05 mm</td><td>Science Services</td><td>PY68039-02</td><td>For calculation of injection amount</td></tr><tr><td>Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml</td><td>Roth</td><td>E305.1</td><td>To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos</td></tr><tr><td>Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml</td><td>Roth</td><td>E304.1</td><td>To remove excess of water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>For suppression of melanization</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>To anethesize zebrafish</td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>Biozym</td><td>850111</td><td>For embedding&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;micro;-dish&lt;sup&gt; 35 mm, high&lt;/sup&gt; Glass Bottom Grid-50</td><td>ibidi</td><td>81148</td><td>Imaging chamber</td></tr><tr><td>Gel loader tips</td><td>Hartenstein</td><td>GS05</td><td>To orient the embryo for proper embedding</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller (model P-97)</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>To generate injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Saur Laborbedarf</td><td></td><td>For microinjection</td></tr><tr><td>Thermomixer copact</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermoblock for tempering the low melting agarose</td></tr><tr><td>SZ61 (Stereomicroscope)</td><td>Olympus</td><td></td><td>For injection control</td></tr><tr><td>Axio Zoom. V16</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For embedding and imaging</td></tr><tr><td>ApoTome.2 slider</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For optical sectioning</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For image acquisition&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZEN 2012</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging software</td></tr></tbody></table>

analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning

על מנת להבין organogenesis, תיקונים במרחב ובזמן המתרחשות במהלך ההתפתחות של רקמות צריכים להיות מוקלטים. השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח כלייתי תקין ולקויי עוברי דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי מצויד לתאורת מובנים ורכישת Z- מחסנית. כדי להמחיש nephrogenesis, דג הזברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)) עם מבנים כליות שכותרתו fluorescently היו בשימוש. פגמי כליות היו מופעלים על ידי הזרקה של oligonucleotide morpholino antisense נגד wt1a גן הגידול ע&quot;ש ווילם, גורם ידוע להיות חיוני לפיתוח כליות. היתרון של הגדרת הניסוי הוא שילוב של מיקרוסקופ זום עם אסטרטגיות פשוטות עבור תנועות התאמת מחדש ב x, y או z בכיוון ללא ציוד נוסף. כדי לעקוף מוקדים להיסחף כי הוא מושרה על ידי הפרשי טמפרטורות ותנודות מכני, אסטרטגית פוקוס אוטומטית יושמה במקום ניצול תא סביבתי הנדרש בדרך כלל. כדי להתאים מחדש את השינויים שנרשמו במיקום בשל XY להיסחף, תאי הדמיה עם רשתות רילוקיישן מוטבעות הועסקו. בהשוואת setups מורכב יותר להקלטת הזמן לשגות עם חתך אופטי כגון סריקת ליזר confocal או מיקרוסקופי גיליון אור, מיקרוסקופ זום קל לטפל. חוץ מזה, היא מציעה לנתח יתרונות ספציפי מיקרוסקופ כגון עומק שדה גדול יותר וכן מרחק עבודה ממושך. השיטה ללמוד organogenesis המוצגת כאן יכולה לשמש גם עם מיקרוסקופי סטריאו הקרינה לא מסוגלים חתך אופטי. למרות מוגבל עבור תפוקה גבוהה, טכניקה זו מציעה אלטרנטיבת ציוד מורכב יותר כי משמש בדרך כלל עבור הקלטת הזמן לשגות של רקמות בפיתוח ודינמיקת איברים.

זמן לשגות מיקרוסקופית היא טכניקה רבת עוצמה לצפות בתהליכים ביולוגיים דינמי על פני תקופה ארוכה של זמן. בעיה לעתים קרובות המתרחשת במהלך הדמית הזמן לשגות היא תנועה x, y או z כיוון, שנקראה להיסחף, אשר נגרמה עקב הפרשי טמפרטורות ותנודות מכאניות. השיטה המוצגת כאן מאפשרת זמן לשגות הקלטת מבנים שכותרתו של fluorescently עוברי דג זברה או זחלים על מיקרוסקופ לנתח ללא קאמרית סביבתית שולחן נגד רעידות. לקבלת פיצוי של סחיפת XY, הדגימה ננעצה תא הדמיה עם רשת רילוקיישן מוטבעת (איור 1). המיקום של נקודה מסוימת של הרשת הקשורים על הכוונת של כלי התוכנה שמש להחזיר את הדגימה למצב טרום פורמה (איור 2 א). התוצאות המוצגות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ זוםעם מחוון משולב עבור חתך אופטי באמצעות תאורה מובנהית (איור 2 ב). עבור תיקון מתמשך מוקדים, אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה. באסטרטגיה זו, הפוקוס אוטומטי התוכנה משמש כדי למצוא את המיקוד מבוסס על ניגוד מרבי לפני כל נקודת זמן. כך מוגדר מוקדים זה מטוס מוגדר לאחר מכן כמו תכנית מרכז לרכישת Z- מחסנית. על מנת למזער phototoxicity במדגם, ערוץ brightfield האור מועבר משמש כערוץ התייחסות שכן היא מאפשרת פעמי חשיפה קצרות מספיק במהלך שלב הפוקוס האוטומטי (איור 2 ג). השיטה יושמה עבור ניתוח השוואתי של התפתחות כליות בעוברי morphant בקרה ואת wt1a של קו דג זברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)). במהלך מוקדם nephrogenesis קו זה מראה פלואורסצנטי ירוק ב mesoderm ביניים, היו אבות הכליות לנבוע 9,10 ומאוחר יותרב tubules להרכיב primordia נפרון (איור 3). זמן לשגות הקלטת תמונה מגלה כי nephrogenesis בעוברי morpholino מוזרק שליטה הוא ללא שינוי בהשוואה לאלו uninjected (תוצאות לא מוצגות) ועוקב אחר השלבים המתוארים של פיתוח כלית דג זברה מוקדם 3. בגיל 20 hpf צינוריות pronephric המתפתחות גלויים על הקצוות הקדמיים שלהם, הצטברויות כדוריות של תאים, המייצגות את primordia נפרון הטביעה יכולות להתגלות. במהלך השעות הקרובות, tubules ו primordia נפרון לגדול מאוחר יותר על primordia להתחיל הפתיל על קו האמצע (איור 4, וידאו 2). לעומת זאת, nephrogenesis מופרת קשות בעוברים morphant wt1a. למרות כגלילי GFP החיובי גלויים ב 20 hpf, הם נראים יותר מפוזרים ופחות מפותחים. יתר על כן, אין primordia נפרון הראויה נוצרה. ההבדל הבולט ביותר ל- tהוא לשלוט עובר בנקודה זו בזמן, לעומת זאת, הוא המראה של מספר רב של תאי פלורסנט מחוץ כִּליַת רֵאשִׁית פיתוח (איור 4, וידאו 2). כתוצאה מכך, התאים הללו יש להשאיר את השדה pronephric ולהעביר ventrally (וידאו 2). פיתוח כליה בעוברים מלאים morphants wt1a של הקו המהונדס wt1b כבר לעומת בעבר על ידי לקיחת תמונות בנקודות זמן קבוע שונות 9,10. בניגוד שיטה סטטית זה, הקלטת הזמן לשגות מאפשרת לעקוב דינמיקה של nephrogenesis הנורמלי misrouting של ובתאים כליות הנגרמים על ידי דלדול wt1a. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> איור 1: איור סכמטי של עובר Embedded בתא זמין מסחרי עם רשתות רילוקיישן. יש המנהרשתות ארבע, כל מחולק במרחק חוזר של 50 מיקרומטר, המוטבע לתוך תחתית זכוכית coverslip. העובר להיות צילמו מוטבע במהופך, עם מבנה כליות בסמיכות לכיכר תצפית אבל בלי שכיסה עם רשת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> איור 2:. תיאומים בשל פיצוי של דריפט בגיוון זמן לשגות ורשת הטלה של תאורה מובנית עמדה ברורה של הרשת רילוקיישן הובא למרכז התמונה (מסומן על ידי הכוונת צהוב) ומשמש כנקודת התייחסות XY יישור מאוחר יותר במקרה של משמרות קטנות. המלבן האדום מייצג את האזור של (ROI) הריבית ששמש באסטרטגית הפוקוס האוטומטית (א). ווה חתך אופטישעות מתקבל על ידי תאורה מובנית. התמונה מראה מבנה רשת מוקרן במישור המוקד לאחר כיול נכון (B). את ההחזר על ההשקעה עבור אסטרטגית הפוקוס האוטומטית (מלבן אדום) מוגדרת לכסות מבנים עובריים ייחודיים גבוהים בניגוד (כאן somites) המאפשרים autofocusing האמין לתוך המבנה של עניין (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> איור 3: טרנסגניים wt1b:. GFP עובר עם גרין קרינת כלית פיתוח שכבות של הגבי (א) או לרוחב (B) שידור ותמונות קרינה מוצגים עם קדמי בצד השמאל. np, נפרון primordium; pt, אבובית pronephric; ככה ככהקרדית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> איור 4: מציאה של wt1a משבש פיתוח כליה עוברי נציג, עומק מורחב של תמונות מוקד מהקלטות הזמן לשגות.. בשנת עוברים מוזרקים morpholino שליטה, פיתוח כליות מראה התקדמות נורמלית עם tubules גדל primordia נפרון אשר מתחילים פתיל על קו האמצע. לעומת זאת, wt1a morphants מצליח ליצור primordia נפרון נכון כמות מסיבית של תאי GFP חיוביים הם מחוץ לשדה pronephric. (np, נפרון primordium; pt, אבובית pronephric). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה</a>איור. <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">הקלטת זמן לשגות משלימת וידאו 1. פיתוח כלייתי תקין בעוברים מוזרקים morpholino שליטה. (קליק ימני להוריד).</a> הווידאו מראה כיצד tubules לגדול primordia נפרון מתחיל פתיל. החל מ 20 hpf, התמונות צולמו ב 30 מרווחי דקות על פני תקופה של 5 שעות. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">משלימה וידאו 2. הקלטה זמן לשגות של nephrogenesis מופרע בעוברים wt1a morphant. (קליק ימני להוריד).</a> בסרט רואים את הנדידה של ה- GFP חיובי תאים מחוץ לאזור pronephric. החל מ 20 hpf, התמונות צולמו ב 30 מיילn במרווחים על פני תקופה של 5 שעות.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

analysis-zebrafish-kidney-development-with-time-lapse-imaging-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute (FLI).  השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים. 

Video: Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Medicine

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biology

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...