Biz eleştirel okuma ve el yazması geliştirmek için Thomas Bates teşekkür ederiz. Biz de balık bakımı için Christina Ebert ve Sabrina Stötzer teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri &#39;laboratuvar hayvanları bakım İlkeleri&#39; yanı sıra Hayvanları Koruma Kanunu Alman geçerli sürümüne göre yapıldı. Antisens-Morfolino 1. Hazırlama (MO) <ol><li> 3 mm MO stok solüsyonu hazırlamak liyofilize MO (cam şişede 300 nmol) için steril aşırı saf su 100 ul ekleyin. Tam çözünme için, 5 dakika için 65 ° C stok çözeltisi ısıtılır. Parafilm ile şişeyi Seal ve oda sıcaklığında (RT), MO stok solüsyonu saklayın. Bu flakon duvarları ile MO arasında bir ilişki neden olabilir çünkü MO stok solüsyonu soğuk yok. </li><li> steril aşırı saf su ile MO stok çözelti seyreltilerek 1 mM MO çalışma çözeltisi hazırlayın ve% 0.05 arasında bir nihai konsantrasyona kadar% 0.5 fenol kırmızı bir çözelti ilave edin. <ol><li> Bir MO çalışma çözeltisinin 10 ul olsun 3.3 ul MO stok çözeltisi ve 5.7 ul su,% 0.5 fenol-kırmızısı çözelti 1 ul ekleyin. olmakçözeltisi yeni bir çalışma parti hazırlamak nedenle, 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;ye kadar, MO stok solüsyonu ısıtın. </li></ol></li><li> İğne tıkanmasını önlemek için, santrifüj MO çalışma çözümü kullanmak önce. Örneğin, 5 dakika boyunca (RT) 15,000 xg&#39;de MO stok çözeltisi 10 ul spin ve enjeksiyon için süpernatan 8 ul çıkarın. NOT: aktivitenin kaybı zaman 11 üzerinde morfolino çözümleri ortaya çıkabilir. Bu hariç tutmak için, tek bir üretici tarafından sağlanan protokole uyularak, UV spektrometresi ile çözüm test edebilir. Düşürülmüş etkinliği uzun bir depolama süresi boyunca gözlenmemiştir morfolino kullanılan wt1a halinde (3 mM çalışma çözeltisi uzun bir daha depolanmıştır yıl). </li></ol> 2. Çiftleşme Çiftleri Kurma ve Koleksiyon döllenmiş yumurta <ol><li> Ayırmak için çıkarılabilir bir elek ile donatılmış bir ıslah kapta hattı, her biri: (GFP wt1b) Önceki mikroenjeksiyon öğleden sonra Tg beş çift ayarlamakGece boyunca kadın ve erkekler. NOT: çiftleşme çiftleri olarak kullanılan balık ön elemeden ve iyi &quot;üretici&quot; olarak değerlendirilmiştir gerektiği kadar yumurta başarılı bir enjeksiyon deney için kullanılabilir sağlamak. </li><li> ışıklar açıldıktan sonra ertesi sabah, yumurtalarını yiyip balık engeller elek üstünde birlikte erkek ve dişi koyun. </li><li> yumurtlama izleyin. 4-hücreli aşamasından önce enjekte edilebilir koyulur yumurta bir miktar yine kadın dan (yaklaşık 50), ayrı erkek ulaşıldığında. Enjeksiyon bir birinci tur embriyo su ile dolu bir petri Pasteur pipeti ile yumurta transferi. yumurta ilave mermi almak için bir araya ve ayrı birkaç kez çiftleşme çifti yerleştirin. </li></ol> Mikroenjeksiyon 3. Hazırlık Çalışmaları NOT: Önceden adımları 3.1 ve 3.2 gerçekleştirin. <ol><li> enjeksiyonu (mikroenjeksiyon çanak) sırasında pozisyonda embriyolar tutan bir tabak, bir gl eklemek hazırlamak içinSıvı, şeffaf, saf, gıda sınıfı silikon ile dolu bir 94 mm Petri kabı içine bir 40-45 ° açıyla eşek slayt. Silikon sertleşmiş olduğunda slayt çıkarın. Bu silikon katman bir oluk oluşturur. NOT: Alternatif olarak, silikon agaroz yerine 1.5-3% kullanımı ve 4 ° C&#39;de çanak saklayın. </li><li> Bir iğne çektirmesi ile cam kılcal damarlar enjeksiyon iğneleri oluşturun. <ol><li> İç filamentleri ihtiva kılcal kullanın. NOT: Filament (3.3) dolgu sonra iğne ucuna doğru MO çözüm taşımak için yardımcı olacaktır. </li><li> İğne çektirmesi uygun ayarları kurmak. Zebrabalıkları içine enjeksiyon için iyi iğneler ince uzun uçları 12 olması gerekir. yaklaşık 10 mm uzunluğunda ve en sonunda 1.5-2 um bir çapı olan ipucu oluşturur. = Hız = 40, Zaman = 100 0 çekin, Isı = 330: Örneğin, aşağıdaki ayarlarla yatay iğne çektirmesi kullanın. </li><li> Bir küçük iğne kalitesinin incelenmesidiseksiyon mikroskobu ve kısa veya çok uzun ipuçları ile bu sıralamak. NOT: Kısa ipuçları ile İğneler çok uzun ve ince ipuçları viraj böyle koryon dokunurken ise embriyo zarar eğilimindedir ve nüfuz etmezler. </li></ol></li><li> Bir Microloader ucu kullanarak MO çalışma çözeltisi 2 ul iğne dolgu ve mikroenjeksiyon cihazının iğne tutucu takın. </li><li> iğneler ucu sonunda kapalı olarak, diseksiyon mikroskobu altında keskin cımbız ile iğne çok ucunu arka kısma bir açıklık oluşturur. Alternatif hafifçe sert bir yüzeye (örn., Küçük metal blok ya da cımbız arka) ucu itmek için mikroenjeksiyon aparatı kullanın. </li><li> bir mercek ağı yerleştirilen mineral yağı bir damla halinde MO çalışma çözeltisi enjekte edilmesiyle, enjeksiyon hacmi kalibre edin. yaklaşık 200 ul bir enjeksiyon hacmi elde etmek için 75 um&#39;lik bir damla çapı üretilmesi için enjeksiyon süresini ayarlayın. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. mikroenjeksiyon Prosedürü <ol><li> İğne (oluk 45 ° açı doğru) nereden geldiğini yönünde bitkisel kutup mikroenjeksiyon çanak oluk boyunca 1-hücre sahne embriyolar düzenleyin. </li><li> koryon ve iğne ile yumurta sarısı delmek ve 2 hücreli embriyolar, 1- sarısı içine 1mM MO çalışma çözeltisi (0.2 pmol), 200 pl enjekte edilir. </li><li> geniş bir açıklığı olan bir Pasteur pipeti kullanılarak, embriyo, su ile doldurulmuş bir petri tabağına enjekte edilen embriyoların toplamak ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe. </li><li> Öğleden sonra, geniş bir açıklığı olan bir Pasteur pipeti kullanarak ölü embriyolar kaldırmak ve embriyo su yerine. </li></ol> In vivo görüntüleme için embriyo 5. hazırlanması <ol><li> Ertesi sabah, melanization inhibe% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) içeren embriyo su ile embriyo su yerine. gastrulasyon sonunda bunun nedeni interf önce PTU geçerli değildirerken embriyonik gelişimi ile eres. DİKKAT: PTU toksik ve teratojenik olduğunu. her zaman eldiven giyin ve solunması ve cilt ile temasa geçin. </li><li> istenilen gelişimsel aşamada bir diseksiyon mikroskobu altında keskin cımbız ile embriyolar Dechorionate. cımbız bir çift ile koryon kapmak ve cımbız ikinci bir çift ile koryon diğer tarafında kapmak için deneyin. Dikkatle embriyo aksatmadan zıt yönlerde cımbız çekin. </li><li> PTU (% 0.003) ve% 0.02 Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Tricaine) içeren embriyo su ile PTU içeren embriyo su (% 0.003) değiştirerek embriyo anestezisi. </li><li> agaroz 50 mikron taşınma ızgara ile bir coverglass tabanlı μ-çanak düşük erime embriyo gömün. Uygun katıştırma bazı pratik gerektirir. <ol><li> 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpleri içinde% 0.7 agaroz 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve 36 ° C&#39;ye ayarlanmış bir sıcaklıkta bir blok üzerinde koydu. Tra geniş açılması ile Pasteur pipeti kullanınμ-çanak embriyo nsfer. ultra-ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak aşırı embriyo suyu çıkarmak ve temperli agaroz ile embriyo kaplaması. </li><li> Agaroz halen sıvı iken, ilgi konusu yapının yanı sıra yer değiştirme ızgarasına mesafe ile ilgili olarak, arzu edilen bir konumda, iki jel yükleyici uçları embriyo yönlendirmek. ızgara ve yakın çevresinde: olarak (aşağı dorsal burada) cam alt mümkün olduğunca yakın ilgi yapısını (burada pronephros) yerleştirin. </li><li> En iyi görüntü kalitesi için alttan mümkün olduğunca yakın embriyo ilgi yapısını yerleştirerek embriyo ve cam alt kısmı arasındaki agaroz katmanı en aza indirmek. Bunun yanı sıra, ızgaraya yakın çevresinde embriyo bulun ama grid ilgi yapısı ile bindirme olmayacak özen gösterin. Farklı μ-yemekleri 3-4 embriyo her embed ve en iyi konumlandırılmış birini kullanın. </li><li> Agaroz zor olduğunda yeterince 2 için embriyo beklemek tutmak için-3 Dakika ve% 0.003 PTU ve% 0.02 Tricaine içeren embriyo su ile gömülü embriyo kaplaması. Fazla embriyo suyu süzün ya da ultra-ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak kaldırın. buharlaşmasını önlemek için kilit konumunda μ-çanak kapağını kapatın. NOT: Görüntü Kaydı zarar gibi, μ-çanak hava kabarcıklarının oluşumunu kaçının. </li></ol></li></ol> 6. Mikroskopi NOT: yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir mikroskop kullanın. Çok kanallı, Z-Stack, Zaman Serileri, Yazılım otofokus ve Genişletilmiş Odak: aşağıdaki modülleri içeren bir yazılım ile rekor görüntüler. <ol><li> Z-yığınlarının kazanılması <ol><li> μ-çanak ters çevirin. cam alt şimdi objektif dönük ve μ-çanak, bir görüntüleme odası olarak hizmet vermektedir. </li><li> ızgara pozisyonuna kaydırıcıyı geçiş ve yazılım kontrolleri yapılandırılmış aydınlatma modunu etkinleştirin. </li><li> ayarlamaknumune ile seçim kanal (lar) için ızgara odak Odak Kalibrasyon Sihirbazı&#39;nın yönergeleri izleyerek (gömülü embriyo) incelenecek. </li><li> z-Stack edinme modunu etkinleştirmek ve merkez moduna ayarlayın. Numunenin ortasına odaklanın ve Merkezi&#39;ni tıklatarak z yığının merkez düzlemi olarak ayarlayın. merkez konumu etrafında aralığı tanımlayarak z yığının boyutunu ayarlayın. Not: nesne yapıları, birinci ve z yığın son düzlemi dışında keskin görülmemelidir. </li><li> Optik bölümler arasındaki boşluğu ayarlayın. En iyi z çözümü için optimal düğmesine tıklayın. Yazılım Nyquist kriter (% 50 örtüşme) Aşağıdaki önerilen mesafe koyacaktır alan hedefleri derinliği dayalı. Not: daha küçük dosya boyutları ve yapısı izni hedefleyen, el büyük bir aralık boyutunu ayarlayın. Tavsiye edilenden daha küçük adımlar ayarlanması sadece daha sonra arttırmadan daha büyük dosya boyutlarına neden olural bilgiler. </li></ol></li><li> Time-lapse Görüntüleme <ol><li> Zaman Serisi aracını açın ve zaman serisi deney aralığını ayarlayabilirsiniz. örnek kayıt z yığın görüntü 5 saat arasında bir süre boyunca her 30 dakika karıştırıldı. </li><li> zamanla odak kayması düzeltmek için, bir otofokus stratejisi kurdu. Focus Strateji diyalog kutusunu işaretleyin açılan listeden Yazılım Autofocus seçin ve referans kanalı olarak TL-aydınlık kanalı seçin. </li><li> otofokus ile her zaman başlangıç ​​noktası. optimize edilmiş bir zaman dilimi içinde güvenilir bir arama aralığı sağlamak amacıyla, sabit bir 200 mikron bağıl arama aralığını ayarlayın. Bu aralık tamamen maksimum adım boyutu (Numune parametresi) temel kalite (Kalite parametresi) ile (Aralık Kapsama parametresi) taranır. </li><li> Çevrede (odak ROI) ve pozisyon odağı bölgede ölçümü etkinleştirmek, otofokus hassasiyetini artırmak için faiz yapı etrafında canlı görüntü penceresinde odak ROI söyledi. NOT: EğerSistem time-lapse kayıt sırasında otomatik olarak merkez z konumunu günceller Yazılım otofokus modülü yoksun, belirli bir zamanda deney duraklatmak ve Odağı manuel olarak ayarlayabilirsiniz ve denemelerimiz devam ediyor. </li><li> Zaman serisi kayıt sırasında potansiyel bir xy-sürüklenme telafi etmek için, yazılım crosshair&#39;i içine (görüntüleme odasının) baskılı ızgara belirli bir noktaya yerleştirin ve bir ekran yaparak konumlandırma kaydedin. </li><li> Zaman serisi deney başlayın. Zaman serisi aralığı bitmeden gerekirse, konumlandırma ekran göre yeniden ayarlayın, deney duraklatmak ve. deney ile devam edin. </li></ol></li></ol> 7. Görüntü İşleme <ol><li> işleme sekmesine geçin ve Yöntem diyalog kutusunda Focus (EDF) Genişletilmiş Derinliği seçin. Optik bölümler elde edilen bu yana, resim serisi Maksimum Projeksiyon algoritması uygulanır. NOT: Burada algoritma br proje olacakightest ya bir birinci aşamada bir bileşik 2D görüntü istiften en koyu piksel ve en sonunda, her bir zaman noktası için bir sonucu görüntü olarak en varyansı kullanmak. </li><li> EDF resim serisi dışında bir zaman atlamalı film (örneğin avi veya hareket dosyası) oluşturmak için Film verme yöntemini kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Drummond, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+filtration+apparatus+in+zebrafish+requires+Nephrin,+Podocin+and+the+FERM+domain+protein+Mosaic+eyes.">Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes.</a> Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Kreidberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt-1+Is+Required+for+Early+Kidney+Development.">Wt-1 Is Required for Early Kidney Development.</a> Cell. 74 (4), 679-691 (1993).</li><li>Bollig, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).</li><li>Schnerwitzki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Wilms+tumor+suppressor+1+(Wt1)+exon+4+results+in+protein+isoforms+with+different+functions.">Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions.</a> Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).</li><li>Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+morpholino-based+screening+in+zebrafish.">Lessons from morpholino-based screening in zebrafish.</a> Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).</li><li>Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+fish:+efficient+selection+of+transgenic+fish+by+co-injection+with+a+fluorescent+reporter+construct.">Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+imaging,+Part+2:+an+overview+of+fluorescence+microscopy.">Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).</li><li>Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+structured+illumination+microscope.">Optimization and characterization of a structured illumination microscope.</a> Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).</li><li>O'Brien, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1a,+Foxc1a,+and+the+Notch+mediator+Rbpj+physically+interact+and+regulate+the+formation+of+podocytes+in+zebrafish.">Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish.</a> Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).</li></ol>

yazar Michael Graf Bu maddede kullanılan aletleri üreten Carl Zeiss Mikroskopi GmbH&#39;nin bir çalışanıdır.

Zebra balığı insan hastalıklarının omurgalı gelişimi ve modelleme çalışmaları için popüler bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar saydam kalır, çünkü beyin ve kalp gibi gelişmekte olan organlar bir standart hazırlama mikroskobu kullanılarak görülebilir. organ spesifik floresan transgenik yararlanarak floresan mikroskobu ile yaşayan embriyoların içinde farklı gelişim aşamalarında organogenez değerlendirmelerini sağlar. Standart Epifloresans mikroskobu ile tüm organların yapısal ayrıntıları görüntüleme için bir sınırlama odak düzlemi üstündeki ve altındaki nesnelerin gelen sinyallerin etkisidir. Bu out-of-focus ışığı değil azalmış görüntü kontrastı ve çözünürlüğü sadece sonuçlar, aynı zamanda ilgi 13,14 önemli yapılarını gizleyebilir. Disk confocal- veya multiphoton mikroskobu iplik gibi lazer tarama confocal- olarak çeşitli teknikler, out-of-focus bilgisini ve böylece increas en aza indirmek için geliştirilmiştire görüntü kontrastı yanı sıra eksenel çözünürlük. Optik bölümleri elde etmek için alternatif bir yöntem lazerli ve tarama ücretsiz yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi, düzenli bir mikroskop 15 uygulamak basit ve geniş bir alan bazlı aydınlatma tekniğidir. Burada sunulan sonuçlar mikroskop uygulanan ve genişletilmiş odak görüntüleri yeniden birlikte yapılandırılmış aydınlatma elde optik kesit, normal yapısal detayları görselleştirme sağladığını göstermektedir ve Zebra balığı böbrek gelişimini rahatsız. Özellikle, wt1a morphants GFP-pozitif hücreler değişik odak derinliklerde disperse edilir ve dışı olma odaklama bulanıklık sadece tek bir düzlemde görüntüleri fenotipi üç boyutlu karmaşık hafife olacaktır. Organ organizasyonu, düzenlenmesi ya da bozulma dinamiklerini takip etmek, zaman atlamalı floresan mikroskopi karmaşık tekniği olsa bir güçlüdür. time-lapse sırasındagörüntüleme hafif titreşimler veya küçük sıcaklık dalgalanmaları x, y veya z yönünde sürükleniyor neden olur. Bu istikrarlı sonuçlar elde etmek için ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) gerektirir. sunulan yöntem ekstra cihazlar olmadan zaman atlamalı görüntüleri kaydetmek için motorlu odak sürücü ile bir mikroskop yeteneği kullanır. istikrarlı bir odak sağlamak için, bir otofokus stratejisi kurulmuş ve görüntüleme odasının dibine baskılı bir tehcir ızgara x düzeltilmesi, y istikrarsızlık kullanıldı. embriyonun uygun gömme protokolü içinde kritik bir adımdır. Bazı uygulama onunla bindirilirken olmadan ızgara olarak cam alt mümkün olduğu kadar yakın ve yakın çevresinde ilgi yapısını yerleştirmek için gereklidir. yöntemin en önemli avantajı bu tür yaşam büyüme ve göç gibi gelişim süreçleri doğrudan gözlem için uygun fiyatlı ve basit bir araçtır olmasıdırbirkaç saat boyunca embriyolar. Ayrıca, bu tür görünüm ve genişletilmiş çalışma mesafesi geniş alanı olarak diseksiyonu mikroskop özgü yararları bütün organları dahil büyük örneklerin incelenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, bazı sınırlamalar göz önünde tutulması gerekir. Kontrol ve konumlandırma yeniden ayarlamak için deney duraklatma işlemi zaman alıcı ve sağlam bir sıcaklık kontrolü yokluğu zebrabalıkları 16 28.5 ° C&#39;de saat sonra döllenme olarak tanımlanan &quot;standart&quot; gelişimsel zaman, değişiklikleri yapar. Bir diğer potansiyel sorun çıkar yapısı embriyo veya larva içinde bulunan, özellikle hayvana görüntüleme kısıtlı derinliğidir. Böyle bir yapı Somitlerin ve yolk kesesi arasında yer almaktadır Zebra balığı Pronephric glomerulus vardır. glomerul görüntüleme için sınırlayıcı derinliği yaklaşık 200 um, gelişme 5 gün sonra ulaşılır bir mesafe olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, L flüoresan yapılar olduğuDaha uzun bir süre için görüntülenebilir hayvanın yüzeyine yakın ocated. Örneğin karaciğer hücreleri en az 9 dpf&#39;e kadar görüntüleme için erişilebilir. Bir başka sınırlama agaroz ve Tricaine tedavisinde embriyo veya larva uzun süreli immobilizasyon sırasıyla büyüme geriliği ve kalp ödemi neden olmasıdır. Bu normal gelişim engel olabilir, çünkü ilgi belirli bir süre için time-lapse kayıt süresini kısıtlamak için önerilmektedir. ilgi görüntüleme yapılarının sırasında emin olmak için bir hayvan olduğu ile genel görünümünü aynı deney koşulları altında, ancak gömme ve Anesthetization olmadan muhafaza (sonunda) karşılaştırmak yararlı olur normalde gelişir. 5 saat ve odak görüntü uzatılmış derinliği daha sonra hesaplama bir süre boyunca her 30 dakikada bir, normal erken olayları mekansal ve zamansal bilgiler ve optik kesit bir z-yığın kayıt b indüklenmiştir böbrek gelişimi rahatsızy wt1a ve demonte morfolino aracılı. Sabit zaman görüntüleme pronephros geliştirilmesi için GFP hattı 9,10 işaret ortaya. Daha önce gerçekleştirilen morfolino demonte deneyler Mevcut böbrek markör 17,18 ve transjenik wt1b istihdamı in situ hibridizasyon Wt1a pronephros oluşumunda bir erken ve gerekli bir rol oynadığı göstermiştir kesintiye glomerüler morfojenezinde o wt1a eksikliği sonuçları ve podosit şartname başarısız oldu. Bu statik yaklaşımların aksine, zaman atlamalı kayıtları doğrudan erken kontrol embriyolar nefrogenezisi ve wt1a morphants uzak Pronephric bölgeden GFP pozitif hücrelerin göç dinamiklerini görselleştirmek. zamanla yanlış yönlendirilmiş hücreleri izlemek için olasılık daha detaylı fenotip analiz sağlar. Genel olarak, burada sunulan yöntem sağlayan ucuz ve karmaşık alternatif kullanımı kolay ve daha az erişilebilir setups normalde böyle (bir çevre odasına ve anti-vibrasyon masası ile donatılmış) lazer tarama mikroskobu veya hafif levha mikroskop gibi zaman atlamalı görüntüleme için kullanılır. sürüklenme sorunları gidermek için açıklanan rutin ayrıca floresan stereo mikroskop gibi optik kesit seçenekleri olmadan kurulumları zaman atlamalı görüntüleri gerçekleştirmek için uygulanabilir. tekniği, sadece böbrek gelişimi araştırmak için uygundur, ancak, aynı zamanda, kalp, karaciğer ve diğer organların normal ve kusurlu morfonogenezi izlemek için uygulanabilir. Bundan başka, metot, yara iyileşmesi veya rejenerasyonu embriyonik ve yetişkin model organizmaların çeşitli dinamik işlemleri gözlemlemek için kullanılabilir.

gastrulasyon ardından, organogenesis bir bireyin yaşam döngüsünün bir sonraki aşamasıdır. Bu doku ve organların üretmek için yeniden düzenleme, etkileşim ve hücrelerin çok sık göç içerir. organların gelişimini altında yatan süreçlerinde yanlışlık genellikle ileri yaşlarda hemen ya da kendilerini ortaya çıkabilir hastalıklara yol açar. Böylece, organogenezi anlama gelişimsel biyoloji ve biyomedikal araştırmalarda önemli bir çaba olmuştur. Belli bir organ gelişimine araştırmak edebilmek için, bu da embriyo gövde duvarı aracılığıyla görünür olması gerekir. Bu gelişim sırasında meydana gelen mekansal ve zamansal değişikliklerin kaydedilmesini sağlar. Ayrıca organogenez katılan faktörlerin önemi analiz etmek amacıyla, bu manipülasyon duyarlı olması gerekir. In vivo organogenez soruşturma son derece uygun olan bir organizma Zebra balığı olduğunu. onun transparFloresan transgenik hatların kullanımı ile kombinasyon halinde, embriyonik gelişimi sırasında Ensi protein lokalizasyonu ve ifade dinamiklerinin gözlem, aynı zamanda, iç organların 1 görselleştirme sağlar. Bu kimin organları mikroskopik analiz için erişilemez memeli modellere göre gerçek zamanlı olarak, organ gelişiminin soruşturma ile ilgili benzersiz bir avantaj sağlar. Ayrıca, farklı araçlar zebrafish embriyo gelişimini işlemek için kullanılabilir. Mutant çizgilerinin üretilmesine yanında, antisens morfolino oligonükleotitler (MO), bazı organların gelişiminde dahil olan belirli bir gen aktivitesinin demonte etmek için kullanılabilir. MOs bir ekleme sitesi veya translasyon başlangıç ​​kodonunu (Ağustos) hedef ve böylece ön-mRNA veya çeviri eklenmesine engel ya. Zebra balığı embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimi ve gen işlevini incelemek için anatomik basit ama değerli bir modeldirböbrek hastalıklarının 2 ile ilgili es. Bu nefron denilen sadece iki fonksiyonel birimden oluşmaktadır. Her nefron kan filtrasyon yer 3 alan bir glomerulus oluşur. Ayrıntılı bileşenler kısa boyunlu bölgenin yanı sıra kloakanın 4 biter sekresyon ve çözünen maddelerin reabsorbsiyonunun ve kanal için parçalı borucuk vardır. Ne olursa olsun basit kompozisyon, organizasyon ve zebra balığı pronephros farklı hücre tipleri memeli böbrek 5,6 çok benzer. Böbrek gelişiminde kritik rol oynayan bir faktör, Wilms Tümör baskılayıcı gen WT1 7 tarafından kodlanmıştır. Balığı wt1a adlandırılan iki paralog sahiptir ve pronephros 8 geliştirilmesi sırasında üst üste binen, ancak aynı desen içinde ilave edildiği, wt1b. GFP-etiketli pronephros yapılarla transgenik zebrafish kullanılarak, wt1a &lt;o tam devirerek gösterilmiştir/ em&gt; veya belirli bir ekleme formu embriyonik böbrek ağır ya da hafif malformasyonlar, sırasıyla 9,10 yol açar. Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş nefrogenezisi zaman atlamalı analiz sağlar. Genel olarak optik kesitler sadece odak içi bilgi içeren görüntü edinme sağlar. Out-of-odak bilgiler, matematiksel algoritmalar (örn. Deconvolution), optik tasarım (örneğin Konfokal lazer tarama mikroskopisi) ya da her ikisinin kombinasyonu (örneğin yapılandırılmış aydınlatma) gibi çeşitli yaklaşımlarla önlenebilir. Böbrek geliştirme kusurları neden biz bir antisens bir transgenik zebrafish hattı enjekte edildi wt1a karşı MO (GFP) Tg (wt1b) kullanılır. Bu hat glomerulus, boyun ve ön GFP floresan gösterirtübül 9,10 parçası. Böyle lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıtları için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolay ve ucuzdur. Ayrıca, yapılandırılmış aydınlatma ekipmanı kolayca uzun bir çalışma mesafesi ve bakış geniş alanı olarak geleneksel floresan ekipmanı (örneğin floresan lamba, filtreler) ve mikroskop özel avantajlar diseksiyon teklifler ile kombine edilebilir. sürüklenme ile ilgili sorunlar genellikle istikrarlı sonuçlar için gerekli olan ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) kullanmadan çözüldü. bir otofokus stratejisi kurulmuş ve baskılı taşınma ızgaraları ile görüntüleme odaları x veya y yönünde bir sürüklenme aşağıdaki konumlandırma yeniden ayarlamak için kullanılmıştır odak kayması için düzeltmek için. Bu çözümler aynı zamanda, floresans, stereo m optik kesit amaç olmadan mikroskoplar uygulanabiliricroscopes ve normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">Gene tools, LLC</td>
			<td style="width:148px;">Standard control oligo</td>
			<td style="width:252px;">Prepared&#160;control&#160;oligo</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">wt1a Morpholinos&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Gene tools, LLC</td>
			<td style="width:148px;">customized</td>
			<td style="width:252px;">Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0,5% Phenol red solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P0290</td>
			<td style="width:252px;">Injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peqGOLD universal agarose</td>
			<td style="width:147px;">peqlab</td>
			<td style="width:148px;">35-1020</td>
			<td style="width:252px;">To prepare microinjection dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass capillaries&#160; (GC100F-10)</td>
			<td style="width:147px;">Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td style="width:148px;">30-0019</td>
			<td style="width:252px;">To generate injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;">5242956003</td>
			<td style="width:252px;">To load the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont forceps&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fine Sience Tools</td>
			<td style="width:148px;">91150-20</td>
			<td style="width:252px;">To generate an opening at the needle tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Embryo water (0.3x Danieaus&#180; solution)</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4,&#160; 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graticule 5mm / 0.05mm</td>
			<td style="width:147px;">Science Services</td>
			<td style="width:148px;">PY68039-02</td>
			<td style="width:252px;">For calculation of injection amount</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml</td>
			<td style="width:147px;">Roth</td>
			<td style="width:148px;">E305.1</td>
			<td style="width:252px;">To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml</td>
			<td style="width:147px;">Roth</td>
			<td style="width:148px;">E304.1</td>
			<td style="width:252px;">To remove excess of water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P7629</td>
			<td style="width:252px;">For suppression of melanization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">E10521</td>
			<td style="width:252px;">To anethesize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:147px;">Biozym</td>
			<td style="width:148px;">850111</td>
			<td style="width:252px;">For embedding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">&#181;-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50</td>
			<td style="width:147px;">ibidi</td>
			<td style="width:148px;">81148</td>
			<td style="width:252px;">Imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel loader tips</td>
			<td style="width:147px;">Hartenstein</td>
			<td style="width:148px;">GS05</td>
			<td style="width:252px;">To orient the embryo for proper embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette puller (model P-97)</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">To generate injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:147px;">Saur Laborbedarf</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermomixer copact</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">Thermoblock for tempering the low melting agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SZ61 (Stereomicroscope)</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For injection control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axio Zoom. V16</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For embedding and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApoTome.2 slider</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For optical sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AxioCam MRm</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For image acquisition&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ZEN 2012</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning

organogenez anlamak için, doku gelişimi sırasında meydana gelen uzamsal ve zamansal değişiklikler kaydedilmesi gerekir. Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma ve z-yığın edinimi için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş böbrek gelişiminin time-lapse analiz sağlar. Ile floresan etiketli böbrek yapıları kullanılmıştır: nefrogenezisi, transgenik zebra balığı (GFP) Tg (wt1b) görselleştirmek için. Böbrek kusurları Wilms tümörü geni wt1a, böbrek gelişimi için çok önemli olduğu bilinen bir faktör karşı antisens morfolino oligonükleotid enjeksiyonu ile tetiklenmesi. deney düzeneği avantajı ek donanım olmadan x, y veya z yönünde yeniden ayarlama hareketler için basit stratejileri ile zoom mikroskop birleşimidir. sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan odak kayması aşmak içinBir otofokus stratejisi yerine genellikle gerekli çevresel odasını kullanan uygulandı. nedeniyle xy-sürüklenme için konumsal değişiklikler yeniden ayarlamak için, baskılı tehcir ızgaraları ile görüntüleme odaları istihdam edilmiştir. Böyle konfokal lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıt için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolaydır. Ayrıca, bu tür alan yüksek derinliği ve uzun bir çalışma mesafesi olarak mikroskop özgü yararları diseksiyon sunmaktadır. Burada sunulan organogenez çalışma yöntemi aynı zamanda optik olarak kısımlara ayırma yeteneğine sahip değildir Flüoresans stereo mikroskobu ile birlikte kullanılabilir. yüksek verimlilik için sınırlı olmasına rağmen, bu tekniğin normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.

Time-lapse mikroskopi uzun bir süre boyunca dinamik biyolojik süreçleri izlemek için güçlü bir tekniktir. Time-lapse görüntüleme sırasında sık meydana gelen bir sorun sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan sürüklenme denir x, y veya z yönünde bir hareket, olduğunu. Burada sunulan yöntem, çevre odasında ve anti-vibrasyon tablo olmadan bir diseksiyon mikroskobu Zebra balığı embriyolarının veya larva içinde floresan etiketli yapıları kayıt time-lapse sağlar. Xy-sürüklenme tazmini için, numune bir baskılı tehcir ızgara (Şekil 1) ile bir görüntüleme odasında gömülü idi. Yazılım aracı kursöre ilgili ızgara belirli bir noktasının konumu önceden ayarlanmış bir konumda (Şekil 2A) için numune dönmek için kullanılmıştır. Sunulan sonuçlar, bir yakınlaştırma mikroskobu kullanılarak elde edilmiştiryapılandırılmış aydınlatma (Şekil 2B) üzerinden optik kesit için entegre bir kaydırıcı ile. Sürekli odak düzeltme, bir otofokus stratejisi kuruldu. Bu stratejide, yazılım otofokus her zaman noktasından önce maksimum kontrast dayalı odak bulmak için kullanılır. Bu yüzden tanımlanmış odak düzlemi sonradan z yığın edinimi için merkez planı olarak ayarlanır. Otofokus aşama (Şekil 2C) esnasında yeterince kısa bir kalma süreleri verir gibi numunede fototoksisite en aza indirmek için, iletilen ışık aydınlık kanalı referans kanalı olarak kullanılır. Yöntem, bir transgenik zebra balığı hattının kontrol ve wt1a morphant embriyolar (GFP) Tg (wt1b) böbrek gelişimi karşılaştırmalı analizi uygulandı. Erken nefrogenezisi sırasında bu hat böbrek atalarıdır 9,10 ve daha sonra ortaya çıkan, orta tabaka mezodermin yeşil floresan gösterirşekillendirme tübüller ve nefron primordia (Şekil 3). Time-lapse görüntü kayıt kontrol morfolino enjekte edilen embriyolar nefrogenezisi (sonuçlar gösterilmemiştir) uninjected olanlar karşılaştırıldığında değiştirilmemiş ve erken zebrabalıkları böbrek gelişimi 3 açıklanan adımları takip ettiğini ortaya koymaktadır. Gelişmekte olan Pronephric tübüller hpf 20 görünür ve onların ön ucunda at, şekillendirme nefron Primordia temsil hücrelerin küresel birikimleri, tespit edilebilir. Bir sonraki saatlerinde, tübüller ve nefron taslakları büyür ve daha sonra primordia üzerinde orta hat (Şekil 4, Video 2) de kaynaşmaya başlar. Bunun aksine, nefrogenezisi ciddi wt1a morphant embriyolarda bozulur. GFP-pozitif boru şekilli yapılar 20 hpf görebilir de, daha yaygın ve daha az gelişmiş olduğu görülmektedir. Ayrıca, hiçbir şekilde nefron taslakları oluşturulmuştur. En çarpıcı fark tAncak o gelişmekte pronephros (Şekil 4, Video 2) dışında floresan hücrelerin çok sayıda ortaya çıkmasıdır, bu zaman noktasında kontrol embriyolarına. Daha sonra, bu hücreler Pronephric alanını terk ve ventral (Video 2) göç. Kontrol embriyo ve wt1b transgenik hattın wt1a morphants Böbrek gelişme, daha önce farklı sabit zaman noktalarında 9,10 görüntüleri alarak karşılaştırılmıştır. Bu statik yöntemi aksine, time-lapse kayıt normal nefrogenezisi ve wt1a tükenmesi nedeniyle böbrek progenitör hücrelerin yanlış iletilmesi dinamiklerini takip etmesini sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> Şekil 1: Tehcir Izgaralar ile Ticarete Elverişli Odası Gömülü Embriyo şematik İllüstrasyon. çanak varDört ızgaralar, her biri bir cam lamel altına baskılı 50 um bir tekrarlanma mesafesi bölünmüştür. Yansıması için embriyo bir gözlem kareye yakın böbrek yapısı ile, baş aşağı gömülü ama ızgara ile kaplanacağı olmadan. Olan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> Şekil 2:. Time-lapse Görüntüleme ve Yapılandırılmış Aydınlatma Izgara Projection içinde Drift Tazminat için ayarlamalar taşınma ızgara bir farklı pozisyon görüntü merkezi haline getirildi (sarı crosshairs ile işaretlenmiş) ve daha sonra xy-uyum için bir referans noktası olarak hizmet küçük vardiya halinde. Kırmızı dikdörtgen otofokus stratejisi (A) kullanılan faiz (ROI) bölgesini temsil eder. Optik kesit wayapılandırılmış aydınlatma ile elde s. Görüntü doğru kalibrasyon (B) sonrasında odak düzlemi öngörülen bir ızgara yapısını göstermektedir. Otofokus stratejisi (kırmızı dikdörtgen) için ROI faiz (C) yapısına güvenilir otomatik netleme sağlayan (Somitlerin burada) aksine yüksek ayırt edici embriyonik yapıların kapsayacak şekilde ayarlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> Şekil 3: Transgenik wt1b. Yeşil Floresan ile GFP Embriyolar Gelişmekte Böbrek dorsal (A) veya yan (B) iletim ve floresan görüntüleri Kaplamaları sol anterior gösterilir. np, nefron primordium; nk, Pronephric tübül; Eh işteakar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> Şekil 4: wt1a demonte Embriyonik Böbrek Geliştirme bozan Temsilcisi time-lapse kayıtları odak görüntüleri genişletilmiş derinliği.. Kontrol morfolino enjekte edilen embriyolar, böbrek gelişme orta hatta sigorta başlangıç ​​büyüyen tübüller ve nefron primordiasında normal ilerleme gösterir. Bunun aksine, wt1a morphants uygun nefron Primordia formu başarısız ve GFP pozitif hücrelerin büyük bir miktarı Pronephric alanının dışındadır. (np, nefron primordium, pt, Pronephric tübül). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">Bu fi büyük halini görmek için tıklayınız</a>şekil. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">Kontrol morfolino enjekte edilen embriyoların normal böbrek gelişiminin Ek Video 1. Time-lapse kayıt. . (Sağ indirmek için tıklayın)</a> tübül büyür ve nefron taslakları kaynaştırmak başlar nasıl bir video gösterir. 20 HPF başlayarak, görüntü 5 saat arasında bir süre boyunca 30 dakika aralıklarla alındı. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">Wt1a morphant embriyolarda rahatsız nefrogenezisi arasında Ek Video 2. Time-lapse kayıt. (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Video Pronephric bölge dışına GFP pozitif hücrelerin göçünü gösteriyor. 20 hpf başlayarak, görüntüler 30 mi alınmıştır5 saat arasında bir süre boyunca N aralıkları.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

analysis-zebrafish-kidney-development-with-time-lapse-imaging-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Görüntüleme.  Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute (FLI).  Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar. 

Video: Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...