עבור מחלות יילודים כגון קרדיומיופתיה, טיפול רגנרטיבי באמצעות תאים המושרים תאי גזע pluripotent נגזר יש פוטנציאל עצום. עם זאת, צמיחת תאים מואצת במבחנה מובילה לנזק DNA על ידי מטבוליטים מצטברים כגון מיני חמצן תגובתי. השתלת תאים אלה פגועי DNA יגרום תחריט לקוי והתחדשות של האיבר.
לפני ההשתלה, יש להעריך את איכות התאים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי להעריך את נזקי הדנ"א בתאי גזע. הפגנת ההליכים תהיה ג'סיקה מילר, חוקרת, ניקיל מרדהקאר, חוקרת, ווסנטי רג'יסקאראן, טכנאי מעבדה.
כדי להתחיל, למקם 500 מיליגרם של אגוארו נמס נמוך ב 100 מיליליטר של מים נטולי DNA-RNA. מחממים את הבקבוק במיקרוגל עד שהתעוררות מתמוססת. לאחר מכן, מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.
להכנת מגלשות שביט מצופות מראש, מניחים כמה טיפות של 0.5% על מגלשת זכוכית. מיד להפיץ את ההתעוררות כדי ליצור שכבה דקה של ציפוי אגרוז באמצעות כיסוי. עובדים בתנאי תאורה נמוכה כדי למנוע נזק לתאים אולטרה סגולים הנגרמים על ידי אור, מערבבים 10 מיקרוליטרים של מתלי תאים ו-90 מיקרוליטרים של תווי אגרוז בצינור.
מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגוז להתגבש. מערבבים את הפתרון מבלי להכניס בועות אוויר, ו pipette 70 microliters לכל נקודה על מגלשת שביט מצופה מראש. בעזרת קצה פיפטה, מורחים את תערובת התאים ויוצרים שכבה דקה.
מניחים את השקופית בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בגורם מכיל, שקוע לחלוטין את השקופית במאגר ת ליסיס קר. מניחים את המיכל בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.
החלף את מאגר התיזה בתתבר אלקליין קר. ודא שהשקופיות שקועות לחלוטין. לאחר השארת המיכל בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות, מניחים את השקופית במיכל אלקטרופורזה אופקי.
מלאו את המיכל במאגר אלקטרופורזה אלקליין קר עד שהשקופיות יהיה שקוע לחלוטין. יש למרוח מתח בסנטימטר אחד במשך 15 עד 30 דקות. במיכל, שקוע לחלוטין את המגלשה במים קרים deionized.
לאחר שתי דקות, להסיר את המים deionized ולהוסיף מים deionized טריים, ולאחר מכן לחזור על צעד זה בפעם השנייה. לאחר מכן, החלף את המים deionized עם קר 70%אתנול. לאחר חמש דקות, להסיר בעדינות את השקופית מבלי להטות אותו ולתת לו אוויר יבש.
לאחר התייבשות, להוסיף 100 microliters של צבע DNA מדולל לכל נקודה, ולחכות 15 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מסנן FITC במיקרוסקופ epifluorescence, לצלם תמונות של 50 עד 100 שביט בסך הכל לכל מדגם. תרבות iPS נגזר קרדיומיוציטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כדי לראות את הקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS בשקופיות קאמריות, השלך תחילה את מדיום התרבות מה בארות, ושטף את התאים שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ל באר, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ לניתוק תאים.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של CMM כדי לעצור את טריפסין. מניחים את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 200 פעמים g. השלך את המדיום, הוסף מיליליטר אחד של CMM ולחץ מחדש על התאים.
ספור את התאים והתאם את ספירת התאים כדי להשיג שני מיליון תאים ב- 1.6 מיליליטר של CMM. עכשיו זרע 200 microliters של השעיית תא ל הבאר של שקופית תא שמונה בארות. הקש על השקופית בעדינות כדי להפיץ את התאים מסביב לרחבה.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לטיפול ב- cardiomyocyte doxorubicin שמקורו ב- iPS, השלך את מדיום התרבות מ בארות קרדיומיוציט שמקורן ב- iPS, ושטוף את התאים עם PBS. לטפל בתאים עם טוקסורוביצין מיקרומולרי אחד במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
שאפו את המדיום, ושטפו את התאים עם PBS. כדי לבצע immunolabeling, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 200 microliters של טרי מוכן 4% paraformaldehyde לכל באר. לתקן את התאים במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
לאחר שטיפת התאים עם PBS, להוסיף 200 microliters של חיץ חסימה ל הבאר, ולחסום במשך 30 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר החסימה והוסף 200 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני. לאחר הדגירה במשך 45 דקות בתא לח כהה בטמפרטורת החדר, לשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS.
הסר את PBS ולהוסיף 200 microliters של תערובת נוגדנים משנית. דגירה במשך 45 דקות בתא לח כהה בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS.
לשטוף עם מים deionized לפני הרכבה את המגלשות עם antifade. מניחים כיסוי, ולאחסן את המגלשות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל, לקחת שלוש עד חמש תמונות של שדות אקראיים לכל מדגם ולהמשיך ניתוח תמונה.
כדי לספור את מוקד התגובה נזק DNA, להוריד ולהתקין CellProfiler. בחר קובץ, ייבוא, צינור מהקובץ ובחר את קובץ הצבר בשם puncti gamma-H2AX. גרור ושחרר את התיקיה המכילה את התמונות שנרכשו של מוקדי גאמא-H2AX לחלון רשימת הקבצים בסעיף תמונות מודולי קלט לניתוח.
לאחר מכן בצע את ההוראות כפי שמוצג בפרוטוקול הטקסט. כדי להגדיר את הפרמטרים לתמונות, גרור את התמונה הרצויה לניתוח לרשימת הקבצים. תחת מודולי קלט, בחר תמונות.
גם במודולים של קלט, בחר מטה-נתונים ולאחר מכן בחר שמות וסוגים. עבור קבוצות, בחר לא. עבודה במודולים ניתוח, לבחור צבע לאפור.
לאחר מכן בחרו 'החלק', בחרו 'זהה אובייקטים ראשיים' ובחרו שוב 'חלק'. לאחר מכן בחר שפר או העלם תכונות ולאחר מכן בחר זהה אובייקטים ראשיים. עדיין עובד במודולים ניתוח, לבחור קשר אובייקטים, לאחר מכן לסווג אובייקטים, ולבסוף לבחור ייצוא לגיליון אלקטרוני.
לחצו על 'נתח תמונות' בחלונית הימנית התחתונה כדי לבצע ניתוח תמונה. עם השלמתו המוצלחת של הניתוח, נוצרות מספר תמונות. שים לב לקובץ ה- CSV שנוצר ו נשמר במיקום המתאים במחשב.
קובץ זה מכיל את הנתונים הכמותיים לניתוח נוסף. בגיליון האלקטרוני שנקרא תמונת הניסוי שלי, בעמודה B יהיה מספר הגרעינים שיש להם עד חמישה פנצ'טי, ולעמודה D יהיה מספר הגרעינים שיש להם יותר מחמישה פנצ'טי. הוסף עמודות B ו- D כדי לקבל את המספר הכולל של גרעינים.
חזור על שלבים אלה עבור כל התמונות, שינוי שם קובץ הניסוי שלי לפני כל ניתוח. מיקרוגרפים מייצגים של שביטים מתאים iPS שטופלו בטוקסו ולא טופלו מוצגים כאן. כמות בסיס של נזק לדנ"א נמצאה בתאי IPS, שבאה לידי ביטוי כשבר של נזק לדנ"א ולרגע הזנב.
עם זאת, טיפול טוקסו הגדיל את נזק ה-DNA בתאי iPS כצפוי, המציין כי ניתן להשתמש בבדיקת שביט כדי להעריך את שלמות ה- DNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים. מיקרוגרפים מייצגים של אימונאבלינג גאמא-H2AX מוצגים כאן, בהגדלה נמוכה יותר ובהגדלה גבוהה יותר. בשליטה iPS נגזר cardiomyocytes, יותר מ 90% של התאים היו פחות מחמישה FOCI DDR לכל גרעיני.
ובסך הכל פחות מ-10% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. עבור קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPS במשך שישה חודשים, פחות מ-90% מהתאים היו עד חמישה מוקדי DDR לכל גרעינים, ובסך הכל יותר מ-13% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. בעוד שבקרדיומיוציטים שטופלו ב-iPS, פחות מ-80% מהתאים היו עד חמישה מוקדי DDR לכל גרעינים.
ובסך הכל כ -24% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. נתונים אלה מצביעים על כך שתרבות תאי קרדיומיוציט ממושכת שמקורה ב- iPS וטיפול בדוקסו גרמו לנזק משמעותי בדנ"א, מה שהופך אותם ללא מתאימים להשתלת תאים. חשוב מאוד להימנע משתנים תוך ערבוב ההשעיה התא, כמו זה עשוי להשפיע על אלקטרופורזה.
בעקבות הליך זה, אתה יכול לבצע את בדיקות שביט ואת ההליכים immunolabeling עם תאים מסוגים שונים. טכניקות אלה יאפשרו תאים מסוגים שונים להיות מוערך עבור נזק DNA לפני שימוש במחקרים השתלת תאים.
