פרסום זה נובע מן המחקר נערך בתמיכת הכספיים של המועצה למחקר הסביבה הטבעית (NERC) תחת מספר מענק NERC NE / JO11959 / 1 ו קרן מדע אירלנד &amp; the COFUND פעולת מארי קירי תחת גרנט מספר 11 / SIRG / B2159awarded כדי CJs ואת קונסורציום המחקר האקדמי המזרח (מזרח ARC).

<ol>
	<li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenomenon+of+microbial+uncultivability.">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li><li>Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+recovery+from+soils+of+diverse+composition.">DNA recovery from soils of diverse composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).</li><li>Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+optimization+of+DNA+extraction+and+purification+procedures+from+soil+and+sediments+samples.">Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).</li><li>Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+optimizing+quality+and+quantity+of+DNA+extracted+from+soil.">A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil.</a> J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).</li><li>Hurt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).</li><li>Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+coextraction+of+DNA+and+RNA+from+natural+environments+for+analysis+of+ribosomal+DNA-+and+rRNA-based+microbial+community+composition.">Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).</li><li>Martins, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lacustrine+sediment+bacteria+involved+in+nutrient+and+iron+cycles.">Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).</li><li>Kuffner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+season+and+experimental+warming+on+the+bacterial+community+in+a+temperate+mountain+forest+soil+assessed+by+16S+rRNA+gene+pyrosequencing.">Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).</li><li>Tatti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+over+winter+conditions+on+denitrification+and+nitrous+oxide-producing+microorganism+abundance+and+structure+in+an+agricultural+soil+amended+with+different+nitrogen+sources.">Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources.</a> Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).</li><li>Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+in+the+Sargasso+Sea+bacterioplankton.">Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton.</a> Nature. 345, 60-62 (1990).</li><li>Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+sequences+reveal+numerous+uncultured+microorganisms+a+natural+community.">16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community.</a> Nature. 345, 63-65 (1990).</li><li>Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+caused+by+template+annealing+in+the+amplification+of+mixture+of+16S+rRNA+genes+by+PCR.">Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).</li><li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification.">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22, 130-138 (1997).</li><li>Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Specific+Polymerase+Chain+Reaction+Product+by+Utilizing+the+5'+3'+Exonuclease+Activity+of+Thermus+aquaticus+DNA+Polymerase.">Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase.</a> PNAS. 88, 7276-7280 (1991).</li><li>Smith, C. J., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+quantitative+PCR+(Q-PCR)-based+approaches+in+microbial+ecology.">Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).</li><li>Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+archaeal+16S+rRNA+and+amoA+genes+to+estimate+the+abundance+and+diversity+of+ammonia-oxidizing+archaea+in+marine+sediments.">Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments.</a> Extremphiles. 12 (4), (2008).</li><li>Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+depth-related+population+variation+in+microbial+communities+of+a+coastal+marine+sediment+using+16S+rDNA-based+approaches+and+quinone+profiling.">Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling.</a> Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).</li><li>Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+in+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonia+process+rates+and+corresponding+key+functional+genes+along+an+estuarine+nitrate+gradient.">Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient.</a> Front. Microbiol. 6, 542 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a laboratory manual. , 205 (2001).</li><li>Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Quantitative+Polymerase+Chain+Reaction+(Q-PCR)+based+approaches+for+determining+gene+copy+and+gene+transcript+numbers+in+environmental+samples.">Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples.</a> Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).</li><li>Suzuki, M. T., Taylor, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeLong+E.F.,+Quantitative+analysis+of+small-subunit+rRNA+genes+in+mixed+microbial+population+via+5'-nuclease+assays.">DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).</li><li>Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+procedure:+a+critical+issue+for+bacterial+diversity+assessment+in+marine+sediments.">DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).</li><li>Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., &#352;antl-Temkiv, T., J&#248;rgensen, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+method+for+the+extraction+of+DNA+and+RNA,+and+the+separation+of+DNA+pools+from+diverse+environmental+sample+types.">A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types.</a> Front. Microbiol. 6, 476 (2015).</li><li>Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+methods+for+RNA+and+DNA+in+marine+sediments:+maximizing+yield+while+overcoming+inhibition.">Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition.</a> FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).</li><li>Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+Operon+copy+number+reflects+ecological+strategies+of+bacteria.">rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria.</a> App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).</li><li>Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+metatrascriptomic+and+metagenomics+analyses+of+stratified+microbial+assemblages+in+the+open+ocean.">Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean.</a> ISME J. 5, 999-1013 (2011).</li><li>Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tringe+S.G.,+Tiedje+J.M.,+&amp;+Brown+C.T.+Tackling+soil+diversity+with+the+assembly+of+large,+complex+metagenomes.">Tringe S.G., Tiedje J.M., &amp; Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes.</a> PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).</li><li>Klaedtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terroir+is+a+key+driver+of+seed-associated+microbial+assemblages.">Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages.</a> Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+of+rRNA+and+DNA+reveals+a+dynamic+methylotroph+community+and+trophic+interactions+with+fungi+and+protozoa+in+oxic+rice+field+soil).">Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil).</a> Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>B&#252;rgmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+Silicibacter+pomeroyi+DSS-3+to+dimethylsulfoniopropionate+(DMSP).">Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP).</a> Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).</li><li>He, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochip:+a+comprehensive+microarray+for+investigating+biogeochemical+ecological+and+environmental+processes.">Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes.</a> ISME J. 1, 67-77 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השילוב של מיצוי DNA / RNA עם qPCR מספק שיטה מהירה, מדויקת, יחסית חסכונית עבור הכימות הרגיש של שכיחותם גני תמליל מתוך מגוון רחב של דגימות סביבתיות, כגון משקעי החוף. מיצוי חומצות הגרעין הראשוני הוא השלב הקריטי כדי להבטיח תצוגת נציג של ההווה קהילת חיידקים מושגים 22. מספר מגבלות צריכים להילקח בחשבון עבור פרוטוקול החילוץ: א) השגת תמוגה התא הכולל, ב) שיתוף החילוץ של תרכובות מעכבות (למשל, חומצות humic או polyphenolics), ג) זיהום DNA בשבריר RNA, ד) שפלה מהירה של חומצות גרעין שחולצו כאשר הם מאוחסנים. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לעקוף מגבלות אלו. לדוגמא, תשומת לב מיוחדת יש לנקוט על מנת להבטיח כי החילוץ של חומצות גרעין מותאם במיוחד עבור סוג המדגם (למשל, משקעים, אדמה, שפכים, וכו &#39;). שיפורים משמעותיים תשואת חומצות גרעין ואיכות הוא DNA ו- RNA יכולים להיות מושגת על ידי ביצוע ניסויים ראשוניים 23. כדי למזער את ההשפעה של תרכובות מעכבות על יישומים מבוססי PCR 24, לבדוק מגוון של דילולים מ- DNA ו- RNA חילוץ. כדי לעקוף את השפלה המהירה של DNA / RNA מופק להקפיא להפשיר מחזורים מרובים למנוע אובדן אפשרי של מידע גנטי, aliquots נפח קטן מרובים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. כאשר תוכנן בקפידה, qPCR היא שיטה חזקה, מאוד לשחזור ורגישה. יש לציין, כי שיטות הגברה ובנייה עקומת בתקן המפורט בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל יעד הגן של עניין, כולל סמנים פילוגנטי אחרים (כלומר, rRNA 16S archaeal, rRNA 18S פטרייתי) או גנים המעורבים פונקציות חשובות בסביבה. מגבלות ידועות בשימוש qPCR הן: א) הדור של באיכות גבוהה לשחזורעקומת tandard כימות מוחלטת, ב) הבחירה של פריימר / בדיקות ואופטימיזציה של תנאי assay q-PCR, ג) השימוש באיכות נמוכה / חומצות גרעין טעון, ד) הבחירה של דילול עובד של RNA DNA / להימנע עיכוב . יתר על כן, זה חייב להיחשב כי טכניקת qPCR מספקת גן / שכיחותם תמליל אשר לא יכול להשוות לתא ספירות: זה נכון במיוחד במקרה כאשר 16S ו 18S גני rRNA ממוקדים, כמו שיש מיקרואורגניזמים מספרים עותק שונה של גן ריבוזומלי בגנום שלהם 25. עקומות סטנדרטיות באיכות ירודה תגרומנה כימות מדויק של הגן של עניין. זה תרגול טוב כדי לאחסן מלאי של סטנדרטי ריכוז גבוהים aliquots הקטן שממנו עקומות סטנדרטיות טריות יכולות להתבצע. אין לאחסן עקומות סטנדרטיות, תמיד לעשות דילולים טריים מלאה של הריכוז הגבוה ביותר בכל פעם. עבור כימות מדויק של דגימות סביבתיות להבטיח את טווח הריכוזים של סטןעקומת dard משתרעת על פני ערכי Cp הצפויים של הדגימות הידועות. כאשר לכימותי תמלילים, לבנות את עקומת סטנדרט מ- RNA לא להכפיל גדילי הדנ&quot;א. במידת האפשר, כימות של דגימות כדי להשוות ישירות צריך להסתיים בתוך assay אחת להימנע וריאציה-assay היתר 20. זה לא תמיד אפשרי. לכן, כדי להשוות שכיחותם גן שנוצרה בין מבחנים רצוי יש סט-משנה אקראי של דגימות המשוכפלות בין מבחנים. מבחר רחב של ערכות פריימר בדיקה זמין כרגע עבור qPCR מיקוד מיני מיקרוביאליים קבוצות פונקציונליות 15. בחינה קפדנית יש צורך בבחירה אלה כדי להבטיח הן כיסוי מרבי וספציפי קבוצת היעד. אם יעילות התגובה של assay qPCR אינה משביעת רצון, פתרון בעיות מתחילות עם בדיקת תנאי רכיבת תרמית שונה (ככל שזמן חישול ו / או טמפרטורה) ו / או תנאי תגובה, למשל, ריכוזים שונים פריימר-בדיקה. ONCE Q-PCR assay ותנאי התגובה ממוטבים, תמיד לערוך בדיקה ראשונית של מגוון רחב של דילולים DNA / cDNA כדי לקבוע את הריכוז תבנית מתאימה. בחר את טווח הדילול וכתוצאה מכך מספר העותק הגבוה ביותר כמו דילול התבנית האופטימלי עבור מבחנים נוספים. נכון לעכשיו, טכנולוגיות רצף הדור הבא לשפוך אור ביעילות על מבנה הקהילה חיידקים ופונקציות בתוך שפע של סביבות 26,27,28. עם זאת, מערכי נתונים אלה מבוססים לעתים קרובות על ספריות amplicon נקודת סיום PCR ולכן מספקים רק ערכות וכמותיות של השפע של מינים מסוימים. לפיכך, את היכולת של טכניקת PCR מבוססת בזמן האמת למקד סמנים טקסונומיות ספציפיים (מדומיין גבוה עד לרמת מתח) מאפשר אימות יעילה של התוצאות שהושגו על ידי רצף של הדור הבא. יתר על כן, qPCR שמש בהצלחה בשילוב עם שיטות מולקולריות אקולוגיה מיקרוביאלית אחרות כגון ISO היציבהלהשתכר חיטוט (SIP) או microarrays פילוגנטי / תפקודי. בשילוב עם הכלי לשעבר, qPCR יכול לשמש כדי לכמת את הקהילה פעילה מבחינה מטבולית 29,30. בשילוב עם ניתוח microarray, qPCR מספק פרשנות כמותית המפתח של מבוססי סמן פילוגנטי גן פונקציונלי סקרים של סביבות 31,32. לכן, אם להשתמש לבד או בשילוב עם אחרים (לעתים קרובות תהליך מבוסס) ערכות של תפקוד מערכת אקולוגי, PCR כמוני הוא כלי חיוני עבור אקולוגים מיקרוביאלי בחיפוש של הקישור החמקמק בין קהילות חיידקי פונקציות מערכת אקולוגיות.

מיקרואורגניזמים הם אבן הפינה של הפונקציה האקולוגית נהיגה הביוספרה. רוב מיקרואורגניזמים להישאר חסרי תרבות 1. לכן גישות מולקולריות מבוססות הם יסוד לקדם את הבנתנו את המגוון והתפקוד של מיקרואורגניזמים בסביבה. מרכז גישות אלה הוא המיצוי של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות לבין ההגברה הבאה של גני המטרה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). הצעד הראשון של מיצוי DNA / RNA שואפת lyse את דופן התא של ההווה קהילת חיידקים, להסיר מולקולות גרעין-חומצה הלא רצויים (למשל, חומרים אורגניים ואי-אורגניים) ולשמר DNA / RNA בתמיסה לניתוח נוסף במורד הזרם. בין מספר אפשרויות זמינות בספרות 2,3,4,5, כוללים מגוון רחב של ערכות הפקה מסחריות, שיטת גריפיתס 6 מועסק נרחב 7,8,9. זהו חסכוני particularly גם מתאים משקע כפי שהיא משתמשת צעד להכות חרוז כדי lyse תאים משלב צעדים כדי למזער את שאיבת שיתוף של מעכבי ה- PCR, כגון חומצות humic, תוך מחל DNA ו- RNA זמנית. הצעד השני משתמש תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר גני המטרה, כגון סמן 16S rRNA טקסונומיות, מן חומצות גרעין שחולצו. יש גישה זו וממשיכה להקל על החיפושים של 10,11 קופסה שחורה מיקרוביאלי uncharacterized. עם זאת, בשיטות מבוססות PCR קצה לסבול ממגבלות שונות שיכולות להטות את האפיון של קהילות מיקרוביאלי 12. כדי לכמת במדויק שכיחותם הגן / תמליל, בזמן אמת PCR, הידוע גם בשם PCR כמותי (qPCR) חייב לשמש. qPCR מנצל מערכות צבע כתב ניאון העוקבות אחר הצטברות amplicon לאחר כל מחזור של PCR. זה משמעותי כי זה אומר כי כימות יכול להתרחש במהלך שלב המעריכים מוקדם, ולאמתום הנקודות, השלב של תגובת PCR, כאשר תשואת amplicon עדיין ביחס ישר השפע הראשוני של גן המטרה. שתי מערכות הכתב משמשות: כתם חומצות גרעין intercalating 13 ו 5 &#39;3&#39; פעילות exonuclease של פולימראז DNA 14. מאחר שרשת הכתב לשעבר נקשרה indistinctively לכל הדנ&quot;א הדו-גדילית, זה עלול להוביל יתר של רצף היעד אם amplicons שאינו ספציפי הרצוי או פריימר דיימר ידי מוצרים להתרחש. כדי לעקוף זאת, אופטימיזציה הנרחבת של הגברה ייתכן שתידרש. במערכת האחרונה, הגברת תבנית הוא אתר באמצעות שילוב של פעילות nuclease 5 &#39;של פולימראז תקי מסלקת fluorophore מן התחקיר פנימי. תכונה זו מגבירה את הספציפיות של assay בשל הניצול של חללית fluorogenic שקושר רק sequenc היעד ספציפי משליםדואר בין זוג פריימר. בשתי כימי כימות מושגת על ידי קביעת הנקודה-המעבר (CP) שם ההצטברות של amplicons PCR, כפי שהיא נמדדת על ידי גידול קרינה, היא משמעותי מעל קרינת רקע. qPCR כבר נעשה שימוש נרחב באקולוגיה מיקרוביאלית לקבוע שכיחותם גן בסביבות שונות 15. יתר על כן, שעתוק לאחור של RNA ל cDNA בשילוב עם qPCR ו RT-qPCR לכמת ביטוי גנים. לפיכך, qPCR ו RT-qPCR מייצגים מהירים, שיטות יעילות עבור כימות של מספרי גן ו / או תמליל בתוך דגימות סביבתיות. מיקרואורגניזמים במשקעי החוף לנהוג תהליכים אקולוגיים שונים, כוללים מינרליזציה של חומר אורגני, השפלתה של מזהמים ואת אופני biogeochemical של macronutrients כגון 16,17,18 חנקן. ההבנה הממצה של השינויים הללו דורשת accoun הקיףt של אוכלוסיות חיידקים התורמות, כוללים נתונים כמותיים על שכיחותם גני תמליל. כאן אנחנו מציגים סדרה של בדיקות מקיפות, נהלים פשוטים הסטנדרטיים עבור כימות של חיידקי 16S rRNA שכיחותם גני תמליל במשקעי החוף. הפרוטוקול מתאר אוסף מדגם, DNA סימולטני מיצוי RNA, הכנת RNA חופשי-DNA, בדיקת איכות של חומצות גרעין שחולצו, דור של 16S rRNA-DNA וסטנדרטי -RNA וכימות של דגימות סביבתיות. נתונים כמותיים נגזרו השיטות שתוארו כאן יש צורך לשפוך אור על קהילות חיידקי נהיגת מערכות אקולוגיות החוף.

<table><tbody><tr><td>Diethylpyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Toxic, open under chemical hood</td></tr><tr><td>cetrimonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td>Irritant, open under chemical hood</td></tr><tr><td>potassium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>Equilibrate at pH 8 before using</td></tr><tr><td>Chloroform : Isoamylalcohol</td><td>Sigma</td><td>25666</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>VWR</td><td>1.06404.0500</td><td></td></tr><tr><td>polyethylenglycol 6000&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>528877-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Molecular Grade</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix E tubes</td><td>MP Biomedical</td><td>116914050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNAse&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Sigma</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse free 0.2&amp;nbsp;ml PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>SureCleanPlus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>pGEM Easy T Vector</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JM109 competent cells</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Sigma</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>59349</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Bioline</td><td>BIO-37035</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioline</td><td>BIO-37036</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>20768.235</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT DNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q-33120</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT RNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript kit</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-84002</td><td></td></tr><tr><td>qPCR machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous dna-rna extraction from coastal sediments and quantification of 16s rrna genes and transcripts by real-time pcr

תגובת שרשרת פולימראז Real Time הידוע גם בשם PCR כמותי (q-PCR) הוא כלי בשימוש נרחב אקולוגיה מיקרוביאלית לכמת שכיחותם הגן של קבוצות טקסונומיות ופונקציונלי דגימות סביבתיות. להשתמש בשילוב עם תגובת transcriptase הפוכה (RT-q-PCR), זה יכול גם להיות מועסק לכמת תמלילי גן. Q-PCR עושה שימוש כימי איתור פלורסנט רגישות גבוהה המאפשרות כימותים של amplicons PCR בשלב המעריכים של התגובה. לכן, ההטיות הקשורות &#39;הקצה&#39; PCR זוהו בשלב הרמה של תגובת PCR נמנעות. פרוטוקול לכמת גני rRNA 16S חיידקי תמלילים ממשקעי החוף דרך בזמן אמת PCR מסופק. ראשית, שיטה שיתוף החילוץ של DNA ו- RNA ממשקעים החוף, כולל הצעדים הנוספים הדרושים לעריכת RNA DNA ללא, מפורט. שנית, מדריך צעד-אחר-צעד עבור כימות של גני 16S rRNA ו TRanscripts מן חומצות גרעין שחולצו באמצעות q-PCR ו RT-q-PCR המתואר. מידע זה כולל פרטים לבניית עקומות סטנדרטיות DNA ו- RNA. שיקולים עיקריים לשימוש מבחני RT-q-PCR באקולוגיה מיקרוביאלית כלולים.

<html> הפקת DNA באיכות טובה ו- RNA ממשקעים היא הצעד הראשון בכימות שכיחותם גני תמליל. תשואות חילוץ מוצלחות להקות ה- DNA ו- RNA ברורות כמצוין באיור 1 עבור המדגם AC, שבו 23S ו 16S חדו להקות rRNA גלויות בנוסף להקת הדנ&quot;א הגנומי המשקל המולקולרית הגבוהה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" width="400" /> באיור 1. DNA / RNA החילוץ. תוצאות אופייניות מ- DNA / מיצוי RNA מן בשלושה עותקים (ABC) 0.5 גרם משקעים החוף. 5 μl של רנ&quot;א DNA / נדרס על agarose 1.4% ב 85 V עבור 40 דקות. סמן מולקולרי בטווח 10,037-200 נ&quot;ב היה בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> -together.within-page = &quot;1&quot;&gt; כדי להכין RNA, עיכול של ה- DNA שיתוף חילוץ הוא חובה. זה חייב להיות מלווה 16S rRNA נקודת הסיום PCR של רנ&quot;א על ​​מנת להבטיח כי ה- DNA הוסר בהצלחה. אם ה- DNA הוסר לחלוטין רק להקה בבקרה החיובית הוא ציין. חשוב להשתמש בשני מסודר 1:10 דילול של RNA כדי להבטיח מעכבים אינם מונעים ההיווצרות של מוצר ה- PCR. RNA יכול עכשיו לעבור את התגובה transcriptase הפוכה להמירו cDNA. זה יכול להתבצע עם פריימרים משני או hexamers אקראי גן ספציפי. בדרך כלל, התגובה מתבצעת במכונת PCR, כדי להבטיח שפרופיל טמפרטורה אופטימלי. cDNA זה משמש כתבנית תגובת qPCR הבאה. DNA ו- RNA הוא לכמת לקביעת ריכוז התבנית בשימוש כל תגובה. פרוטוקול התגובה qPCR המתואר מיקוד 16S rRNA DNA. עבור 16S rRNA תמלילים להחליף את מ&quot;ק התקןRVE ותבנית עם cDNA. כמו דגימות ידועות הן לכמת נגד עקומת הסטנדרט, זה הכרחי כדי להבטיח את העקומה הסטנדרטית היא באיכות טובה. תרשים 2 מציג את ההכנה (א), עקומות סטנדרטיות דילולי DNA הסביבתי, (B), ההגברה של עקומת הסטנדרט דגימות סביבתיות (C) מרה של עקומת סטנדרט כדי רגרסיה ליניארית וחישוב של מספרי עותק הגן. כאשר מגוון דילול של פי 10 מוכן כראוי ומוגברי הבדל 3.3 מחזור בין כל דילול סטנדרטי נתפסת (זה לוקח 3.3 מחזורי גידול של פי עשר תבנית ב 100% יעילים הגברה) (איור 2Bi). מתארי עקומות סטנדרטיים, כוללים ערכי 2 R של 0.99 ויעילויות PCR בתוך בין 90 ל- 110% (איור 2 ג) הם רצויים. חשוב לדווח על נתוני Cp מן אין שליטת תבנית (NTC) אם הוא קיים. במקרה כזה הפסקת Cp עבור תקני דגימות ידועות 3.3 מחזורים (&lt;em&gt; כלומר, קפל יומן) גבוה משווי Cp של NTC מוטל 20 (איור 2Cii). תבנית לא ידועה מופקת DNA המשקע הייתה לכמת מ מסודר, 10 -1, 10 -2 ו 10 -3 דילולים (B). המדגם המסודר לא להגביר, ערכי Cp של 10 -1 עד 10 -3 דילולים היו 24.12, 26.02 ו 28.40 בהתאמה. NTC Cp היה 30.5, גידול הפסקת NCT של 27.2 הוטל. המרת שכיחותם גן g -1 משקעי משקל רטובים הביאו 2.5 x 10 7 ו 7.1 x 10 7 ל -10 -1 ו -10 -2 בהתאמה עבור מגוון הדילול. 10 -3 Cp דילול היה מתחת לציון NTC, והיה ולכן לא נעשה שימוש. במקרה זה 10 -2 נבחרת דילול התבנית האופטימלית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2. 16S rRNA גן QPCהגברת R של תקני DNA הסביבה מופק משקעי החוף. הכנה (א) i) עקום DNA סטנדרטי ii) דילולי DNA הסביבתי הגברת qPCR, (B) qPCR הגברה של i) עקום סטנדרט DNA ו- II) דגימות סביבתיות, Cp עבור כל דגימה מוצגות. (C) i) רגרסיה לינארית של עקומת סטנדרט עם מתארי עקומת סטנדרט; ii) חישוב שכיחותם גנים בין דגימות סביבתיות. NTC:. בקרת תבנית שלילית <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> CTAB </td><html><td> 5 גרם </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 x3H 2 O </td><td> 2.58 גרם </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.1 גרם </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2.05 גרם </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> עד 100 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הכנת טבלה 1. חיץ CTAB-פוספט. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> PEG 6000 </td><td> 30 גרם </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 9.35 גרם </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> עד 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> הערה: להוסיף PEG 6000 לאט מתחת לחימום ערבוב מתון של 50 מ&quot;ל של DH 2 O. </td></tr></tbody></table><html> בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; הכנת טבלה 2. פתרון ממטרים PEG-NaCl. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> RNA חי RNA / 01:10 מדולל </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> 10x PCR הצפה </td><td> 5.0 μl </td></tr><tr><td> dNTPs 10 מ&quot;מ </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> פריימר 63F קדימה </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> CAG GCC TAA GTC CAA CAC ATG </td><td></td></tr><tr><td> פריימר 518R ההפוך </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> ATT ACC מהפקולטה לרוקחות אוכלים GCT GCT GG </td><td></td></tr><tr><td> פולימראז תקי </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> DH RNAse ללא 2 O </td><td> 40.6 μl </td></tr></tbody></table>e = &quot;1&quot;&gt; לוח 3. שילוב הורים PCR בדיקת איכות RNA ללא DNA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> RNA </td><td> 0.5-5 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> dNTPs 10 מ&quot;מ </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> פריימר הפוך 10 מיקרומטר / Random hexamers 50 מיקרומטר </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC-H 2 O </td><td> עד 13 μl </td></tr></tbody></table> תמהיל לוח 4. cDNA תגובת סינתזת א <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> מאגר 5x </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 μl </td><html></tr><tr><td> RNAse מונע </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> transcriptase הפוכה </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> תמהיל לוח 5. cDNA תגובת סינתזת B. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יַעַד </td><td> שם פריימר </td><td> סדר פעולות </td><td> T חישול (° C) </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td rowspan="3"> 16S rRNA חיידקים </td><td> Bact1369F </td><td> CGG TGA ATA CGT TCY CGG </td><td rowspan="3"> 56 </td><td rowspan="3"> סוזוקי et al 2000. 19 </td></tr><tr><td> Prok1492R </td><td> GGW TAC CTT GTT ACG ACT T </td></tr><tr><td> TM1389F (בדיקה) </td><td> CTT GTA CAC ACC GCC CGT C </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; פריימר לוח 6 ו בדיקות עבור assay 16S rRNA q-PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> 2x מיקס מאסטר </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> פריימר קדימה (10 מיקרומטר) </td><td> 0.8 μl </td></tr><tr><td> פריימר הפוך (10 מיקרומטר) </td><td> 0.8 μl </td></tr><tr><td> Probe (10 מיקרומטר) </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> מַיִם </td><td> 7.0 μl </td></tr><tr><td> נפח סופי </td><td> 19 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 7. בזמן אמת תגובת PCR לערבב. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתאר </td><td> מַשְׁמָעוּת </td></tr><tr><td> מקדם המתאם (R 2) </td><td> מדד של הליניאריות של עקומת סטנדרט. באופן אידיאלי זה צריך להיות R 2 = 1. ערך של R 2 = 0.98-0.99 כשרים. </td></tr><tr><td> סלופ (α) </td><td> מדד של יעילות התגובה. באופן אידיאלי זה צריך להיות שווה ערך ל -3.32. ערך בטווח שבין -3.58 ו -3.1. </td></tr><tr><td> יעילות (= 10 (-1 / שיפוע) -1) </td><td> אם זה 100%, את התבניות מכפילות לאחר כל מחזור תרמי במהלך הגברת מעריכים. מגוון יעיל טוב הוא בין 90 ו -110%. </td></tr><tr><td> Y יירוט (β) </td><td> לגבול התיאורטי של זיהוי של התגובה. אמנם לא משמש לכמת רגישות התגובה, חשוב כאשר משווים עקומות סטנדרטיות שונות של אותה מטרה. </td></tr></tbody></table> לוח 8: QPCמתארי תגובת R.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR at JoVE.com

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

simultaneous-dna-rna-extraction-from-coastal-sediments-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

17.5K Views.  National University of Ireland Galway. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction. 

Video: Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genetics

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biology

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

מיצוי DNA דיאטומי חסכוני באמצעות ערכה מותאמת

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

מחבר זרקור: בדיקות דיאטום לבדיקת טביעה משפטית 

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

דלדול של רנ"א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג'ין RNA

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג'ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות