Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

.1 16S rRNA ג&#39;ין Amplicon ספריית הכנה על ידי שיטת Fusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר פריימרים (קדימה, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;- CAT CCA TCT CCC TGC GTG TCT CCG T AC CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; הפוך, R533-IonP1: 5&#39;- CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; נועזים: מתאמים ספציפיים יון Torrent; נטוי: מפתח לקביעת רצף לכיול עוצמת אות בתחילת ריצת הרצף; גופן רגיל: פריימרים ייחודיים לתבנית; X ... X: 10 רקוד נ&quot;ב, ראה טבלה 1 לכמה רצפים ברקוד), תערובת מאסטר 2x HotStartTaq פלוס והדגימות. מערבבים היטב לפני השימוש, פרט לתערובת ההורים שצריכים להיות מעורבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת PCR (20 תגובות μl) עם 0.5 מיקרומטר של פריימר ההפוכה, 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סרום שור Albumine (BSA) ומיקס מאסטר 1x HotStartTaq פלוס. הוספת 18.5 μl של מיקס מאסטר לדוארצינור ACH PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פריימר קדימה (0.5 μl ב20 מ&quot;מ) עם ברקוד שונה לכל אחת מהדגימות שיהיה רצף ביחד. הוסף 1 μl של מדגם (1-10 ng / μl) לצינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות במכונה PCR ולהפעיל את התכנית הבאה: denaturation הראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ו72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; התארכות סופית 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. יכולים להיות כל הזמן מוצרי PCR על 4 מעלות CO / N או קפוא עד שימוש. </li></ol> .2 Amplicon טיהור, כימות ואיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2% agarose ג&#39;ל באמצעות המסרקים הגדולים ביותר זמינים. הוסף 5 μl של טעינת צבע ג&#39;ל 6x לתגובה ועומס על הג&#39;ל, הפרדה כל דגימה על ידי ריק גם. הפעל את הג&#39;ל על 70 V ל50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של ג&#39;ל ולחתוך את הרצועות (גודל צפוי סביב 250 נ&quot;ב: מוצר נ&quot;ב 190 תוספת 63 מתאמים נ&quot;ב ורקודים) באמצעות אזמל נקי. </li><li&gt; לשקול את הלהקות נכרתה ולהמשיך בחילוץ ג&#39;ל וטיהור של מוצרי PCR (עם לדוגמא, ערכת Qiaquick חילוץ ג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת כל מוצר PCR עם PicoGreen ולעשות דילולים להשיג פתרון מניות ב5 x 10 9 מולקולות / μl (כ 1 ננוגרם / μl). אם כמה דוגמאות להראות הגברה נמוכה יותר, להתאים את דילולים לריכוז נמוך יותר, תוך התחשבות כי הריכוז הנמוך ביותר המתאימים לנהלים הבאים הוא 1.57 x 10 7 מולקולות / μl (26 PM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת 10 μl של כל מוצר PCR מדולל כדי לקבל בריכת equimolar של דגימות. הכן בריכה נפרדת אחד עבור כל אחד מריצת הרצף המתוכננת. יכולים להיות כל הזמן מוצרי PCR נקוו במקפיא עד שימוש. </li></ol> .3 אמולסיה PCR ורצף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR תחליב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מוצרי PCR ונקוו ל26 PM בנפח של 25 μl. ריאגנטים הפשרה מערכת תבנית יון PGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת תחליב PCR (ריאגנטים המסופקים בערכה) במנדף PCR ולהוסיף מוצרים ויקוו PCR וחלקיקי הכדור (בתנאי) על הספסל. מערבבים היטב ומכניס את התערובת במחסנית מסנן ולמעלה בזהירות עם שמן תחליב (בתנאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להפוך את מחסנית המסנן ועומס על מנגנון התחליב האוטומטי PCR (למשל, Touch 2 מכשיר יון אחת). בחר את התכנית המתאימה ולהתחיל את ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התחליב האוטומטי PCR השלים, להסיר את supernatant מצינורות האיסוף ואחזור חלקיקי הכדור בחלק התחתון של הצינורות. Resuspend התחומים של פתרון לשטוף (מסופק בערכה) 100 μl ולקחת aliquot 2.0 μl לכימות ספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות הספרייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים של חיץ SSPE (150 mM NaCl, 10mm 4 Napo, 1 המ&quot;מ Na 2 -EDTA) עם 2 μl של מתאם B&#39;-Fam (5&#39;- FAM -CT 100 μlG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) בדיקה ו2 μl של המתאם-Cy5 (5&#39;- CAT Cy5 -CCA TCT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) בדיקה. הוספת 52 μl של תערובת זו לaliquot 2.0 μl נלקח בשלב 3.2 ולהוסיף 2 μl של פתרון לשטוף (מערכת התבנית) ל52 μl שנותר כריק כדי לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לאחר מכן על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. העבר את תערובת בצינורות 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.0 מ&quot;ל של חיץ TEX (10 מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA, 0.01% טריטון X-100, pH 8.0), לערבב וצנטריפוגות ב XG 15,500 עבור 3 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהשאיר 20 μl בצינור אחד. חזור על תהליך זה הכביסה שתי פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 180 μl של חיץ TEX, resuspend חלקיקי טבליות ולהעביר לתוך 500 צינורות קיוביט μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הקרינה לFAM וCy5 באמצעות מנגנון קיוביט ולחשב את היחס של תחומים חיוביים באמצעות המחשבון ניתן למצוא באתר יון הקהילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר את שארית חלקיקי הכדור לתחומים חיוביים (המכילים DNA המוגבר) באמצעות מערכת אוטומטית להעשרה (לדוגמא, מערכת העשרת Touch יון אחת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים Pipet בבארות המתאימות של רצועת 8 היטב סיפקה: ובכן 1: חלקיקי תחום משלב 3.2; ובכן 2: מראש שטף חרוזים MyOne streptavidin C1 (13 μl); ובכן 3, 4 ו -5: פתרון לשטוף (מסופק בערכת התבנית); ובכן 6: ריק; ובכן 7: להמס-off פתרון (125 מ&quot;מ NaOH, 0.1% Tween 20); ובכן 8: ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן טיפ על זרוע pipetting וצינור 0.2 מ&quot;ל לאיסוף דגימה. התחל המכשיר. בסופו של ההעשרה, להוסיף 10 μl לנטרל פתרון (בתנאי). יכולים להישמר חרוזים המועשר 4 ° C. עד 15 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתחל את המכשיר לקביעת רצף: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחבר למכשיר לקביעת רצף ולהכין תכנית ריצת רצף, המפרטים את הפרטים של ריצת הרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Install פתרון לשטוף # 2 (מסופק בערכת רצף יון PGM), פתרון לשטוף # 1 (350 μl 100 מ&quot;מ NaOH) והפתרון האוטומטי pH החיץ (מסופק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את הליך האתחול וכאשר תתבקש להוסיף dATP, dGTP dCTP ונוקלאוטידים dTTP (בתנאי) ב50 מ&quot;ל צינורות המיוחסים להם. הברג את הצינורות על מכונת הרצף ולהמשיך את הליך האתחול. כאשר האתחול הושלם, להתחיל הליך הריצה באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות עבור סידור ולטעון את השבב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הכדורים מועשרים מצעד 3.4 בחלק התחתון של הצינור על ידי צנטריפוגה ב15,500 XG ל1.5 דקות. הסר את supernatant עוזב בדיוק 3 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של פריימר רצף (מסופק בערכת הרצף), ומערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend החלקיקים. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לאחר מכן על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של פולימראז (בתנאי), מערבב היטב וincubאכלתי בRT במשך 5 דקות. המשך לטעון את תערובת אנזים-כדור על שבב הרצף בתוך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך דגירה, לטעון את שבב הרצף ברצף ולבצע בדיקת איכות שבב. הסר את הנוזל מהשבב על ידי צנטריפוגה ולטעון את המדגם בשבב על ידי pipeting באיטיות במורד תערובת אנזים-הכדור (7 μl) והימנעות כניסתה של בועות בשבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השבב שלוש פעמים דקות 1 בmicrocentrifuge. שנה את הכיוון של השבב בכל צנטריפוגה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בין כל ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השבב במכשיר ולהתחיל לרוץ. </li></ol></li></ol> ניתוח .4 יסוד רצף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחבר לשרת נתונים הרצף ולהוריד את קובץ fastq. צור קובץ מופרד באמצעות טאבים &quot;oligos&quot; המכיל את מידע פריימר וברקוד (ראה דוגמא בטבלה 1). הורד את קבצי התייחסות Greengenes מהמוותאתר חור <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">(http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Mothur ולבצע ניתוחים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את קובץ fastq לfasta וקובץ באיכות באמצעות הפקודה הבאה: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את החברות בקבוצה של כל רצף ולקצץ את הרצפים באמצעות הפקודה הבאה: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לשנות האפשרויות השונות בהתאם לחומרה הרצויה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג את הרצפים בטקסונומיה greengenes באמצעות הפקודה הבאה: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, שיטה = wang, קבוצה = test.groups, תבנית = gg_99_otus.fasta, טקסונומיה = gg_99_otus.tax, הפסקת = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sipos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+PCR+biases+in+environmental+microbiology+studies.">Addressing PCR biases in environmental microbiology studies.</a> Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+PCR+amplification+and+sequencing+artifacts+on+16S+rRNA-based+studies.">Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies.</a> PLoS ONE. 6, e27310 (2011).</li><li>Tringe, S. G., Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+for+the+pioneering+16S+rRNA+gene.">A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).</li><li>Margulies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+in+microfabricated+high-density+picolitre+reactors.">Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.</a> Nature. 437, 376-380 (2005).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+resemblance+methods+differ+in+their+ability+to+detect+biologically+relevant+patterns.">Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.</a> Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).</li><li>Bondici, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+communities+in+low-permeability,+high+pH+uranium+mine+tailings:+characterization+and+potential+effects.">Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).</li><li>Auffret, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+quality+on+the+bacterial+populations+and+off-flavours+in+recirculating+aquaculture+systems.">Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems.</a> FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).</li><li>Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+microbial+community+structure+affects+diesel+biodegradation+in+an+Arctic+soil.">Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).</li><li>Bell, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+bacterial+composition+and+hydrocarbon+degradation+in+Arctic+soils+following+diesel+and+nutrient+disturbance.">Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance.</a> ISME J. 7, 1200-1210 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+microbial+communities+in+the+Athabasca+River+and+its+tributaries+in+relation+to+oil+sands+mining+activities.">Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+biofilms+grown+from+Athabasca+watershed+sediments+are+inhibited+by+increasing+bituminous+compounds+concentrations.">Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+expression+profiles+in+the+rhizosphere+of+willows+depend+on+soil+contamination.">Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination.</a> ISME J. 8, 344-358 (2013).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+sequence+proportions+in+a+DNA-based+diet+study+using+Ion+Torrent+amplicon+sequencing:+which+counts+count.">Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count.</a> Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).</li><li>Milani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+fecal+microbiota:+an+optimized+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene-based+analysis+protocol.">Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol.</a> PLoS ONE. 8, e68739 (2013).</li><li>J&#252;nemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+shift+in+treated+periodontitis+patients+revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing.">Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing.</a> PLoS ONE. 7, e41606 (2012).</li><li>Petrof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stool+substitute+transplant+therapy+for+the+eradication+of+Clostridium+difficile+infection:+'RePOOPulating'+the+gut.">Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut.</a> Microbiome. 1, 3 (2013).</li><li>Whiteley, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+16S+rRNA+Ion+Tag+and+community+metagenome+sequencing+using+the+Ion+Torrent+(PGM)+Platform.">Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Kozich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).</li><li>Hamady, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+UniFrac:+facilitating+high-throughput+phylogenetic+analyses+of+microbial+communities+including+analysis+of+pyrosequencing+and+PhyloChip+data.">Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data.</a> ISME J. 4, 17-27 (2010).</li><li>Quince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+noise+from+pyrosequenced+amplicons.">Removing noise from pyrosequenced amplicons.</a> BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).</li><li>Huse, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ironing+out+the+wrinkles+in+the+rare+biosphere+through+improved+OTU+clustering.">Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering.</a> Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).</li><li>Edwards, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+dynamics+of+initial+bacterial+colonization+of+nonconserved+forage+in+the+bovine+rumen.">Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).</li><li>Rastogi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+toolbox+for+the+culture-independent+quantification+of+total+bacterial+abundances+in+plant+environments.">A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments.</a> J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).</li><li>Baker, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers.">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).</li><li>Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+alignment+quality,+distance+calculation+method,+sequence+filtering,+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies.">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).</li><li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> השיטה המוצגת כאן היא פשוטה ולא יקרה, וצריכה לאפשר מעבדות רבות כדי לגשת לכוחו של רצף metagenomic. למרות שזה משתנה בהתאם לפלטפורמת הרצף בשימוש, פעם אחת הספריות בנויות על ידיים מעט מאוד זמן נדרש, עם רוב של התהליך automatized. עבור פלטפורמת הרצף משמשת כאן (יון Torrent PGM), ההליך המלא ניתן לבצע בתוך שני ימי העבודה. ברגע הכתיבה (ספטמבר 2013), עלויות מגיב הקשורים לדוגמא המפורטת לעיל היו כדלקמן: הגברה של 36 דגימות PCR: $ 25, quantitation טיהור ג&#39;ל וPicoGreen DNA של 36 דגימות: $ 125, תחליב PCR למדגם amplicon נקווה אחד : $ 150 וריאגנטים רצף: $ 250, עבור הסכום כולל של 550 $ או 15 $ למדגם או 0.0015 $ לקריאה מסונן באיכות. מחיר זה אינו כולל מכשיר חוזה שירות, פחת מכשיר, שכר טכנאי ושימוש בשטח מעבדה. אוהל &quot;&gt; אחד הצעדים החשובים ביותר הוא לאגם את כל המוצרים ביחס equimolar, כדי לאחזר מספר דומה של קורא לכל אחת מהדגימות. כימות PicoGreen שימש כאן, אלא בשיטות אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי פחות מדויק (למשל, כימות UV, כימות מבוסס ג&#39;ל). גם על ידי עושה כימות ואיגום מדויקים ביותר, יש כמה השתנות במספר קורא לדגימה, ובטווח האופייני המפורטים בטבלה 2, זה נע בין 4,380 ל 32,750 קורא, עם ממוצע של 10,338 קורא. אם עיבוד מספר גדול של דגימות (יותר מ 40-50), ניתן להחליף טיהור ג&#39;ל עמודה אחת על ידי טיהור ג&#39;ל בחרוזי צלחת או טיהור באמצעות עם הפסקת גודל מחמיר (למשל, חרוזים AMPure) . נכון להיום, טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא ביותר בשימוש לגן 16S rRNA היא 454. טכנולוגיית ריצוף יון Torrent שימוש בפרוטוקול זה באופן רעיוני דומה מאודל454 ושני הטכנולוגיות נוטות לאותו הסוג של טעויות רצף. באופן לא מפתיע, זה היה הראה כי רצף יון Torrent הביא תוצאות רצף דומות מאוד ל454 רצף 10. לאחרונה, חוקרים רבים בחנו את השימוש בטכנולוגית Illumina עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 18,19. בכל מקרה, זה יהיה קל להתאים את הפרוטוקול הנוכחי למרצפים המעבדתיים אחרים כמו מיסק Illumina או 454 GS Junior על ידי שינוי רצפי פריימר ההיתוך כדי להתאים את המתאמים ורקודים דרושים לטכנולוגיות רצף אלה, כמו בשיטה שתואר לאחרונה לIllumina מיסק 19. לחלופין, חוקרים יכולים בצע את השלבים 1 ו -2 של הפרוטוקול המפורט כאן ולשלוח amplicons נקוותה למרכז רצף שבו התחליב PCR וסדר היה להתבצע. גן 16S rRNA כניסות היו גזוז ומסווג באמצעות Mothur, אבל יכולים להתבצע על הרבה ניתוחים אחריםamplicons גן 16S rRNA. לדוגמא, גיוון בטא יכול להיות מוערך על ידי חישוב מרחקי Unifrac בין כל זוג מדגם באמצעות ההליך המתואר <a href="http://unifrac.colorado.edu/">בhttp://unifrac.colorado.edu/</a> 20. מדדי גיוון אלפא ומספר יחידות מיון שונים מבצעיות של כל דגימה יכולים להיות מחושבים באמצעות כלים בתוך QIIME כמו AmpliconNoise 21 או באמצעות ההליך המתואר על ידי Huse et al. 22 וזמינים בתוך Mothur. פריימרים משמשים כאן מוגברים האזורים משתנים 3 ו -4 מגן 16S rRNA, אבל יכולים להיות ממוקדים אזורים רבים אחרים. במחקר נוכחי, גני 16S rRNA היו מוגברים מחומר צמחי והבחירה של פריימר נעשתה כדי למנוע הגברה של הכלורופלסט 16S rRNA גן 23,24. יש מגוון רחב של צבעי יסוד זמינים אחרים המשתנים בטווח של אורך המוצר, כוח הטקסונומי ו25,26 תועלת. עם זאת, בכל המקרים 200-400 נ&quot;ב קורא של גן 16S rRNA לא יכול להיות מסווג באופן אמין, ברמת המין, וניתוחים מוגבלים לסוג ורמות מיון השונים גבוהות יותר. גנים אחרים יכולים להיות מתאימים יותר אם יש צורך במידע ברמת מינים, כמו גני cpn60 וrpoB 27,28. טיפות דרסטית בעתיד בעלות של רצף ועלייה בכוחם של כלים אנליטיים עשויות לעשות את זה אפשרי להחליף לסידור של גני 16S rRNA על ידי metagenomics רובה, אבל עד אז סידור של גני 16S rRNA נשאר סטנדרטי למיקרוביולוגיה הסביבתית זהב.

רצף metagenomic הוא טכנולוגיה מאוד חזקה כפי שהוא מתמקד בשלמותו של המידע הגנטי הכלול במדגם סביבתי. יש טעמים שונים של רצף metagenomic, כוללים רצף רובה ציד, ספריות גדולות להוסיף ורצף amplicon. רצף Amplicon מציע את היתרון של להיות זול יחסית, מהיר ומסוגלים לייצר קורא מאזור הגנומי יחיד שיכול להיות מתואם בדרך כלל. בנוסף, זרימת העבודה ניתוח נתונים עבור סידור amplicon בעיקר טופל. עם זאת, מאחר שהוא מבוסס על PCR, יש לו את כל ההטיות הקשורים לייחוד שלם, כיסוי חלקי ופריימר מטה את 1,2, מה שהופך את הגישה זו חצי כמותית, במקרה הטוב. מספר אזורים הגנומי יכולים להיות ממוקדים עבור סידור amplicon כוללים גנים פונקציונליים, אבל האפשרויות הפופולריות ביותר הן להשתמש בגני סמן כגון גן 16S rRNA כדי ליצור פרופיל קהילה. באופן מסורתי, seque amplicon גן 16S rRNAncing בוצע תוך שימוש בטכניקות עבודה אינטנסיביות שכללו שיבוט בE. coli, קטיף מושבה והפקת פלסמיד ואחריו סנגר רצף על פלסמידים המבודדים, וכתוצאה מכך, רוב המחקרים ניתחו לדגימה פחות מ -100 שיבוטים. רצף של הדור הבא הביא שתי התקדמות גדולה: במקביל מסיבית של תגובות ברצף, והכי חשוב, הפרדה משובט של תבניות ללא הצורך להכניס שברי גנים במארח. זה פישט מאוד את הרצף של amplicons גן 16S rRNA, שנמצא עכשיו בחזרה כתכונה שגרתית של לימודי מיקרוביולוגיה הסביבתית רבים, וכתוצאה מכך &quot;רנסנס&quot; עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 3. מאז כניסתו של רצף רוש 454 ב2005 4, מספר טכנולוגיות רצף של הדור הבא אחרות הופיעו בשוק (למשל, Illumina, מוצק, PacBio). לאחרונה, את ההקדמה של רצף ספסל העליוןrs הובא למעבדות קטנות קיבולת הרצף פעם אחת בלעדית למרכזי רצף גדולים. חמש מכונות benchtop זמינות כעת: GS Junior 454, אישי הגנום מכונת יון Torrent (PGM) ופרוטון, ומיסק Illumina וNextSeq 500. בעוד שכל מרצפים אלה מציעים פחות קוראים לריצה ופחות בסיסים לדולר ממה שרוב המשרה מלאה מרצפי קנה מידה, הם יותר גמישים, מהירים, ועלויות הרכישה והפעלתם נמוכות הופכים אותם במחיר סביר עבור מעבדות אקדמיות קטנות. מרצפים המעבדתיים במיוחד מתאימים גם לamplicon, הגנום קטן ורצף metagenome נמוכות מורכבות בלימודי מיקרוביולוגיה סביבתיות, כי זה סוג של לימודים בדרך כלל אינו דורש עומק קיצוני של רצף. לדוגמא, אותו יש הסכמה כללית כי לסידור של גני 16S rRNA חוקר את מספר קורא לדגימה הוא לא בעל חשיבות עליונה, כ~ 1,000 קורא יכול ליצור את אותם דפוסים כמרובים מיליון קוראים מערכי נתונים 5. אחרי שאמר את זה, הבא generatio המעבדתיים<html> n sequencers עדיין מייצר כמויות גדולות של נתונים ברצף, עם תשואות מקסימליים של ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (יון Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (יון Torrent פרוטון), ~ 10 Gbp (Illumina מיסק) ו~ 100 Gbp (Illumina הבא Seq 500), וזה יותר ממספיק עבור רוב מחקרי מיקרוביולוגיה הסביבתיים. רצף של הדור הבא של amplicons 16S rRNA באמצעות מרצפים המעבדתיים הוחל לאחרונה למגוון רחב של סביבות. לדוגמא, יון Torrent PGM היה בשימוש כבר קהילת ניתוחים של שבבים מכרה אורניום שהיו גבוה במיוחד pH ונמוכים חדירות 6, הסירקולציה מחודשת מערכות חקלאות ימית 7, של קרקעות הארקטי מזוהם פחמימנים 8,9, של משקעים מושפעים כריית חולות נפט ו biofilms מנהר Athabasca 10,11, של rhizosphere של עצי ערבה ניטעו בקרקעות מזוהמות 12, של גופות אדם ובעלי חי 13-16 ושל מעכלים אנאירוביים 17. jove_content &quot;&gt; בפירוט אנו תרומה זו הגישה שלנו לרצף amplicons גן 16S rRNA בתוך הבית באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא (יון Torrent PGM). לאחר מיצוי DNA, גני 16S rRNA הם מוגברים באמצעות פריימרים חיידקים ברמת תחום המכילים מתאמי רצף ורצפים ייחודיים, מדגם ספציפי (ברקודים). amplicons הם מטוהרים, לכמת ונקוו ביחס equimolar. אז הדגימות נקוו הם מוגברות clonally בתחליב PCR ורצף. רצפי כתוצאה מכך הם ניתחו באמצעות כלים ביואינפורמטיקה זמינים לציבור ( למשל, Mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

אחת השאלות החשובות באקולוגיה של חיידקים הוא &quot;מי נמצא שם?&quot; שאלה זו ניתן לענות באמצעות כלים שונים, אבל אחד מסטנדרטי זהב לטווח הארוך הוא רצף amplicons 16S RNA ריבוזומלי גן (rRNA) שנוצרה על ידי ברמת תחום PCR תגובות הגברה מהדנ&quot;א הגנומי. באופן מסורתי, זה בוצע על ידי שיבוט וסנגרתי (אלקטרופורזה נימים) רצף של amplicons PCR. כניסתו של רצף של הדור הבא פישטה מאוד והגדילה את עומק הרצף לסידור של גני 16S rRNA. כניסתה של מרצפים המעבדתיים עכשיו מאפשרת מעבדות קטנות לבצע רצף rRNA 16S שלהם בבית בעניין של ימים. כאן, גישה לרצף amplicon גן 16S rRNA באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא מפורטת. DNA הסביבתי מוגבר לראשונה על ידי PCR באמצעות פריימרים המכילים מתאמי רצף וברקודים. אז הם מצמידים את חלקיקים כדוריים באמצעות תחליב PCR. החלקיקים הם loaded על שבב חד פעמי והשבב מותקן במכונת הרצף לאחר שהרצף מתבצע. רצפי תאוחזרנה בפורמט fastq, מסונן וברקודים משמשים להקמת חברות במדגם של הקורא. מסונן וזרק לפח כניסות לאחר מכן ניתח נוסף תוך שימוש בכלים זמינים בפומבי. ניתוח דוגמא שבה קורא סווגו עם אלגוריתם מציאת-טקסונומיה בתוך חבילת תוכנת Mothur הוא נתון. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה, זולה ופשוט, וצריכה לעזור למעבדות קטנות יותר כדי לנצל מהמהפכה הגנומי המתמשכת.

לאחר הטיהור בג&#39;ל, עם 25 מחזורים של PCR הגברה, מוצרי ההגברה הם בדרך כלל בריכוז של .2-10.0 ng ב50 μl מים. זה עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לריכוז מתחיל DNA, הסוג של מדגם וערכת הטיהור משמשת. מומלץ לשמור את מספר מחזורי PCR לנמוך ביותר האפשרי כדי למנוע היווצרות הכימרה ולהקטין הטיות הגברה, תוך התחשבות כי כל הדגימות צריכה להיות מוגברות תוך שימוש באותו מספר המחזורים. כדי למזער את מספר polyclonal קוראת ותחומים ריקים ומקסם את מספר קורא, יחס קיוביט צריך להיות בין 0.1 ו0.3 וקרינת FAM צריכה להיות מעל 200. שימוש שבב 314 על יון Torrent PGM, התפוקה הממוצעת היא בסביבות 0.3-0.5 באיכות טובה M קוראת אחרי הסינון של התוצאות בMothur. טבלה 2 מראה התפלגות טיפוסית של מספר קורא אחרי כל צעד של ההליך לריצה המכילה 36 Environ המרובבדגימות נפשיות מוגברות עם פריימרים מיקוד אזור V3-4 של 16S ונותחו באמצעות Mothur. בMothur, הליך trim.seqs ליצור קובץ &quot;* .trim.fasta&quot; המכיל את הרצפים שעברו את מסנני איכות ו&quot; * .scrap.fasta &quot;המכיל את הרצפים שלא עברה את מסנני האיכות יחד עם הסיבה לדחייה בכותרת הרצף. כשהוא מוזן ברקודים בקובץ &quot;oligos&quot;, בפקודה זו תהיה גם ליצור קובץ &quot;* .groups&quot; המכיל את החברות בקבוצתו של כל רצף המבוסס על הרצף ברקוד. Classify.seqs ההליך יוצר &quot;.tax.summary&quot; שניתן לפתוח בExcel. קובץ זה מכיל הסיכום של ההשתייכות הטקסונומית (בשורות) לכל אחת מהדגימות (בעמודות). קובץ זה יכול לשמש לניתוחים סטטיסטיים במורד הזרם וכדי להמחיש הרכב קהילה ברמות טקסונומיות שונות. קובץ &quot;.taxonomy&quot; מכיל הטקסונומית מפורטתהשתייכות לכל רצף. הרכב הקהילה הממוצע ברמת המיון הצמחי / כיתה בכל 36 הדגימות מוצג באיור 1. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 הרכב הקהילה ממוצע ברמת המיון הצמחי / המעמד מעבר לכל דוגמאות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> קדימה </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> דוגמא 1 &quot;oligos&quot; קובץ שולחן לשימוש בMothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # של קורא </td><td style="width:123px;"> % משלב קודם </td><td style="width:107px;"> ממוצע. לדגימה </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> מספר הבארות </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35,070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> ולס עם חרוזים </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> חרוזים עם תבניות </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90% </td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> חרוזים חד שבטיים </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> איכות טובה קוראת (יציאה מהרצף) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Pass Mothur מסננים (דקות. ממוצע. ציון איכות של 20 מעל חלון -50 נקודתי בסיס, דקות. אורך של 150bp) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10,338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> מסווג ברמת המיון הצמחית בGreenGenes (50% סף ביטחון) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> מסווג ברמת המשפחה בGreenGenes (50% סף ביטחון) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50% </td><td align="center"> 8,792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> מסווג ברמת הסוג בGreenGenes (50% סף ביטחון) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> מספר 2 בטבלה של כניסות המופקים מריצה אופיינית ל36 דגימות סביבתיות multiplexed על אחד שבב יון Torrent 314.

Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

82.9K Views.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

Video: Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...