Questa pubblicazione ha emanato da una ricerca condotta con il sostegno finanziario del Natural Environment Research Council (NERC) con il numero concessione NERC NE / JO11959 / 1 e Science Foundation Ireland e la Marie-Curie Azione COFUND sotto Concessione Numero 11 / SIRG / B2159awarded a CJS e il Consorzio di ricerca accademica Orientale (ARC orientale).

1. DNA e RNA Estrazione da Marine sedimenti costieri <ol><li> Preparazione di ribonucleasi (RNasi) materiale-free e di lavoro <ol><li> Preparare acqua distillata priva di RNAsi (DH 2 O) trattando con 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) e incubare a 37 ° CO / N. Rimuovere DEPC residua in autoclave dH 2 O a 121 ° C per 15 min. Usa DEPC trattati dH 2 O per fare tutte le soluzioni. </li><li> Cuocere tutto in vetro a 180 ° CO / N. Rimuovere coperchi di plastica e cerchi, ammollo in una soluzione di 2 M NaOH O / N, e sciacquare con DEPC trattati dH 2 O prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione tampone CTAB-fosfato come da Tabella 1. </li><li> Preparare la soluzione di precipitazione PEG-NaCl come da Tabella 2. </li><li> Pulire tutte le superfici di lavoro (ad esempio, panca, microcentrifuga, fumi-cappuccio) e micropipette con RNasi-decontaminazione soluzione prima di iniziare. Indossare guanti durante l&#39;intera procedura. </li&gt; <li> Utilizzare Plasticware RNasi-free con punte di filtro micropipetta per evitare campione contaminazione incrociata. </li></ol></li><li> raccolta di campioni ambientali e di stoccaggio <ol><li> Raccogliere sedimenti costieri durante la bassa marea con una sterile tubo da 50 ml falco dalla parte superiore di 2,5 cm. Raccogliere circa 15-20 g di sedimenti. chiudere con cautela il coperchio dopo la raccolta del campione. Transport immediatamente al laboratorio in un dispositivo di raffreddamento a 4 ° C per l&#39;elaborazione immediata. </li><li> Omogeneizzare il campione mescolando con una spatola sterile e un&#39;aliquota 0,5 g di peso umido sedimenti in 2 ml tubo tallone battitura. Aliquota repliche aggiuntive, flash-freeze mettendo in azoto liquido. Aliquote conservare a -80 ° C. Attenzione: Indossare guanti protettivi e occhiali di sicurezza durante la manipolazione di azoto liquido. Nota: Se il sito campo non si trova vicino ad un laboratorio, un&#39;aliquota 0,5 g di sedimento in 2 ml microprovette sterili presso il sito di campo. Flash-congelare i tubi mettendo immediatamente in Liazoto quid e il trasporto al laboratorio. Conservare i campioni a -80 ° C fino al trattamento. </li></ol></li><li> Co-Estrazione di DNA e RNA da sedimenti Nota: Il protocollo che segue è una versione modificata del metodo Griffiths 6. <ol><li> Aggiungere 500 microlitri tampone CTAB-fosfato e 500 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1) al 2 ml tubo tallone-lisi contenente 0,5 g di sedimenti e invertire la provetta 5-10 volte per omogeneizzare il campione. Attenzione: Eseguire questo passaggio in un fumi-cappuccio indossare adeguato equipaggiamento protettivo (vale a dire, camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza) in ogni momento. </li><li> Vortex a tutta velocità per 2,5 min. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> In un fumi-cappa estrarre lo strato acquoso superiore e trasferire in una nuova 1,5 ml provetta sterile. Mantenere i campioni sul ghiaccio, aggiungere 500 ml di cloroformio ghiacciata: alcool isoamilico (24: 1). </li><li> Capovolgere varie volte fino un&#39;emulsione è visibLe. Centrifugare per 10 min a 16.000 xg a 4 ° C. </li><li> In un fumi-cappa estrarre lo strato acquoso superiore e inserirlo in un nuovo 1,5 ml provetta sterile. Precipitare gli acidi nucleici con l&#39;aggiunta di due volumi di soluzione al 30% di NaCl PEG e mescolare bene. </li><li> Incubare in ghiaccio per 2 ore o lasciare i campioni a 4 ° CO / N. </li><li> Alla fine di centrifugare i campioni una incubazione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C. Nota: Un pellet può essere visibile nella parte inferiore del tubo. </li><li> Rimuovere delicatamente il surnatante con una micropipetta, fare attenzione a non disturbare il pellet. Lasciare circa 10 ml di soluzione di PEG nel tubo e aggiungere 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare per 20 minuti a 16.000 xga 4 ° C. Rimuovere lentamente etanolo con una micropipetta facendo attenzione a non toccare il pellet. </li><li> Centrifugare per 5 secondi e rimuovere l&#39;etanolo residuo utilizzando una micropipetta. Lasciare il pellet asciugare all&#39;aria per circa 5 minuti. </li><li> Risospendere il pellet in 50 microlitri DEPC trattatiH 2 O. Esaminare la qualità e la resa di DNA / RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio in esecuzione 5 microlitri su un gel di agarosio 1% 19. Dividere gli acidi nucleici in due aliquote, 15 microlitri per DNA e 30 microlitri per l&#39;RNA. </li><li> Conservare il DNA a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. Isolare RNA come descritto nella sezione successiva. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di RNA e di verifica della qualità di RNA privi di DNA <ol><li> Digestione del DNA <ol><li> Aggiungere 3 ml di DNAsi I buffer e 1,5 ml di DNAsi I volume 30 microlitri di acidi nucleici, incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Mescolare il reagente DNAsi inattivazione vortexando per 30 sec. Aggiungere 4,8 ml di soluzione al campione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, occasionalmente toccare il fondo dei tubi per miscelare la soluzione. </li><li> Centrifugare a 10.000 xg per 90 sec a RT, trasferire il surnatante (RNA) in una nuova provetta, facendo attenzione a non trasferire precipitato che può inibire reazioni a valle. </li&gt; </ol></li><li> controllo di qualità RNA <ol><li> Aggiungere 2 ml di RNA a 18 ml di sterile dH RNasi-free 2 O per diluire 1:10. <ol><li> Nelle reazioni di PCR separati, aggiungere 1 ml di puro o diluizione 1:10 di RNA ad uno sterile 0,5 ml provetta PCR. Aggiungere componenti di reazione PCR per amplificare il gene 16S rRNA come da Tabella 3. Includere un (per es., DNA estratto da una coltura batterica pura), un &quot;inibitore PCR&quot; controllo &quot;positivo&quot; (cioè, 1 ml di DNA positivo coltura pura e 1 ml di RNA estratto ordinata) e un controllo &quot;negativo&quot; di sterili dH RNasi-free 2 O. </li></ol></li><li> Impostare il termociclatore con i seguenti parametri di amplificazione: 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 sec, 57 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min) x 35 cicli, 72 ° C 10 min. </li><li> Eseguire il 10% del prodotto di PCR su un gel di agarosio 1% a 85 V per 40 min. Ripetere il trattamento DNAsi I se un prodotto PCR è formata nella RN ambientaleA campioni. </li></ol></li></ol> 3. Generazione di First Strand cDNA da RNA <ol><li> Aggiungere i reagenti come da Tabella 4 ad un RNAsi / DNAsi libera 0,2 ml provetta PCR. </li><li> Incubare il campione a 65 ° C 5 min. Mettere in ghiaccio per almeno 1 min e poi incubare a 25 ° C per 10 min. </li><li> Per lo stesso tubo di aggiungere i reagenti elencati nella Tabella 5. </li><li> Incubare il campione a 55 ° C per 50 min. Inattivare la reazione a 72 ° C per 10 min. </li><li> Conservare cDNA a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. PCR quantitativa <ol><li> Generazione di standard di DNA per qPCR <ol><li> Amplificare batterica sequenza 16S rRNA 20 (o qualsiasi altra sequenza di interesse) da DNA genomico estratto da colture pure con primers q-PCR (1369F e 1492R 21). </li><li> Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Clonare il purificato PCRprodotto in una sporgenza 3&#39;-T sistema vettore di clonazione in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Trasformare il vettore contenente la PCR inserto in Escherichia coli JM109 cellule competenti in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Piatto 50 ml di trasformazione Onto ampicillina (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) e IPTG (0,5 mM) Luria Bertani piastre di agar (triptone 10 g / L, estratto di lievito 5 g / L, NaCl 10 g / L, Agar 15 g / L). Incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Selezionare un singolo trasformante bianco positivo dalla piastra. Seminare trasformante positivo in 50 ml di brodo LB contenente 100 mg / ml di ampicillina e incubare O / N agitazione a 250 rpm a 37 ° C. </li><li> Dalla cultura O / N, isolare e purificare il plasmide utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Linearizzare il plasmide con un enzima di restrizione adeguato che è in grado di tagliare il plasmide volta (per esempio, EcoRI). </li><li<html> &gt; Analizzare la purezza del plasmide misurando il rapporto di assorbimento A 260 / A 280 19. Se il rapporto è inferiore a 1,8, ri-estrarre il plasmide con fenolo-cloroformio 19. Nota: DNA puro ha un rapporto di 1,8. </li><li> Determinare la concentrazione di DNA plasmidico da assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro 19. Nota: In alternativa, la precisione di quantificazione può essere migliorata mediante l&#39;uso di un colorante legante il DNA fluorescente usato in congiunzione con un fluorimetro. </li><li> Sequenza plasmide inserto confermare il formato del bersaglio in basi. Calcolare la quantità (cioè, percentuale) di DNA dell&#39;inserto nel plasmide (ad esempio, in un vettore 3.000 bp, un frammento di DNA 123 bp è 3,9% del DNA totale) e moltiplicarlo per la concentrazione ottenuta in 4.1.10, per determinare la concentrazione di DNA del target (inserto). </li><li> Utilizzare la seguente equazione per calcolare le copie del bersaglio per ml: carico / 54067 / 54067eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Calcolare l&#39;obiettivo Peso molecolare (TMW) moltiplicando il numero di coppie di basi del DNA bersaglio per il peso molecolare medio del DNA a doppio filamento (dsDNA, 660 Daltons per coppia di basi). </li><li> Diluire il DNA bersaglio in un intervallo da 10 a 10 10 2 copie utilizzando 2 ml di DNA e 18 ml di dH sterile 2 O. Mescolare ogni ben di diluizione e spin down brevemente prima di effettuare la successiva diluizione. </li></ol></li><li> Generazione di curva standard RNA per qPCR <ol><li> Dal punto 4.1.5, schermo un numero di colonie bianche (circa 5) dalla colonia PCR 19 utilizzando il contrario di fondo di destinazione (ad esempio, R1492) e l&#39;attaccante plasmide vettore fondo M13F. Nota: Questa combinazione di primer amplificherà inserti clonati nel corretto orientamento senso con un sito promotore T7 a monte. </li><li> Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Quantificare il purificato PCR product a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Aggiungere 200 ng del prodotto di PCR in un volume finale di 20 ml con 7,5 mM di ogni ribonucleotide, tampone di reazione 1 e T7 polimerasi T7 1 enzimatico per la reazione di trascrizione in vitro in. </li><li> Incubare la reazione per 4 ore a 37 ° C. Aggiungere 1 unità di RNase-free DNasi I alla reazione, incubare per 15 minuti a 37 ° C per rimuovere DNA stampo. </li><li> Recuperare in vitro RNA trascritto da precipitazione in etanolo 19 e quantificare le rese di RNA utilizzando un fluorimetro o assorbanza a 260 nm. </li><li> Calcolare il numero trascrizione per ml di RNA. Aggiungere il numero di coppie di basi in RNA bersaglio (ad esempio, 123 basi) alla lunghezza del promotore T7 (153 basi) e moltiplicare per il peso molecolare medio di RNA, 340 Daltons per base. </li><li> Aggiungere 500 ng di RNA quantificato obiettivo di una reazione della trascrittasi inversa (RT), come descritto nella sezione 3. In serie diluire il cDNA come indicato in 4.1.13 per l&#39;usocome la curva standard. </li></ol></li><li> Real-Time PCR <ol><li> Scongelare il DNA ambientale / campioni di cDNA, standard e reagenti qPCR su ghiaccio. Proteggere la sonda fluorogenica dalla luce. </li><li> Diluire gli standard per la curva standard come indicato in 4.1.14. Fare 1:10 diluizioni del DNA ambientale / cDNA da pulito per 10 -3 con l&#39;aggiunta di 2 ml di campione a 18 ml di dH sterili 2 O. </li><li> Fare una reazione master mix per il numero totale di reazioni più il 10% come da Tabella 6 (primer e sonda) e Tabella 7 (miscela di reazione). Mescolare bene e centrifugare brevemente. </li><li> Aggiungere 19 ml di master mix e 1 ml di modello (Standard, campioni ambientali o acqua per il controllo negativo) in ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti ottica qPCR. Eseguire ogni reazione (standard, campioni ambientali e controlli negativi) in triplice copia. </li><li> Coprire la piastra a 96 pozzetti con una copertura ottica q-PCR. Centrifugare brevemente la piastra. caricare ilpiastra nel blocco di riscaldamento della macchina qPCR e chiudere il coperchio. </li><li> Aprire il software di gestione qPCR. Fare clic sulla scheda &quot;protocollo&quot;, fai clic su &quot;Crea nuovo&quot;, aggiungere le seguenti condizioni di amplificazione: 3 min 95 ° C, (10 sec 95 ° C, 30 sec a 60 ° C) x 40 cicli. Impostare il volume del campione di 20 microlitri, fare clic su &quot;OK&quot; e salvare il protocollo. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Plate&quot;. In &quot;Modifica selezionati&quot; click &quot;selezionare fluoroforo&quot;, aggiungere il colorante rapporto per la sonda del caso, ad esempio, fluoresceina. Fai clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Evidenziare pozzetti contenenti gli standard, selezionare &quot;standard&quot; dal menu &quot;tipo campione&quot;. Fai clic su &quot;replicare serie&quot; per cambiare &quot;replicare dimensioni&quot; a 3, su &quot;Apply&quot;. Fai clic su &quot;serie di diluizioni&quot; per aggiungere concentrazione iniziale calcolata per lo standard 1, indicare il fattore di diluizione (10), selezionare &quot;diminuendo&quot; o &quot;crescente&quot; a seconda dell&#39;ordine è stata aggiunta la curva standardalla piastra. Fai clic su &quot;Applica&quot;. </li><li> Evidenziare la posizione contenenti i campioni sconosciuti, selezionare &quot;sconosciuto&quot; dal &quot;tipo campione&quot; menu a discesa. Fai clic su &quot;replicare serie&quot;, e cambiare &quot;replicare dimensioni&quot; a 3. Fare clic su &quot;Applica&quot;. Modifica nomi dei campioni in &quot;nome del campione&quot;. Ripetere la procedura per controlli Template pozzi (NTC). </li><li> Fai clic su &quot;OK&quot; nella finestra editor di piastra e salvare il file. Fai clic su &quot;Start Esegui&quot;. </li><li> Al termine della corsa, si aprirà la finestra di analisi dei dati. Fare clic sulla scheda &quot;quantificazione&quot; per visualizzare la curva standard, descrittori standard di curva (tabella 8) e le trame di amplificazione. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Dati quantificazione&quot; per i valori Cp e corrispondente di partenza quantità di gene (SQ) di campioni sconosciuti. tavolo Esporta in un foglio di calcolo, se necessario. </li><li> abbondanze gene Moltiplicare da campioni sconosciuti per il fattore di diluizione, la quantità di sedimenti estrata da e volume totale di acidi nucleici sono stati eluiti in ottenere copie del gene per grammo di sedimento peso umido. Nota: Eluire il DNA da 0,5 g di sedimento in 50 ml, diluire 1/10, aggiungere 1 ml come modello per una reazione di q-PCR; calcolare copie del gene g -1 sedimenti moltiplicando: copie del gene ml di DNA x diluizione del volume fattore x eluizione x 2. </li></ol></li></ol>

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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geochip:+a+comprehensive+microarray+for+investigating+biogeochemical+ecological+and+environmental+processes.">Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes.</a> ISME J. 1, 67-77 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La combinazione di DNA di estrazione / RNA con qPCR fornisce un metodo rapido, preciso, relativamente conveniente per la quantificazione sensibile del gene e la trascrizione abbondanze da una serie di campioni ambientali, come ad esempio sedimenti costieri. L&#39;estrazione degli acidi nucleici iniziale è il passo fondamentale per garantire un quadro rappresentativo della comunità microbica presente si ottiene 22. Un certo numero di limitazioni devono essere considerati per il protocollo di estrazione: a) la realizzazione di lisi cellulare totale, b) co-estrazione di composti inibitori (ad esempio, acidi umici o polyphenolics), c) DNA contaminante nella frazione RNA, d) rapida degradazione degli acidi nucleici estratti se conservato. Precauzioni devono essere prese al fine di aggirare queste limitazioni. Ad esempio, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che l&#39;estrazione degli acidi nucleici è ottimizzato per il tipo di campione (ad esempio, sedimenti, suoli, acque di scarico, ecc). Miglioramenti significativi di resa di acido nucleico e la qualità sia per DNA e RNA possono essere realizzati effettuando esperimenti preliminari 23. Per ridurre al minimo l&#39;effetto di composti inibitori su applicazioni basate sulla PCR 24, testare una serie di diluizioni del DNA estratto e RNA. Per aggirare la rapida degradazione del DNA / RNA estratto da più cicli di gelo-disgelo ed evitare la possibile perdita di informazioni genetiche, memorizzare più piccole aliquote di volume a -80 ° C. Quando accuratamente progettato, qPCR è un metodo robusto, altamente riproducibile e sensibile. In particolare, i metodi per l&#39;amplificazione e la costruzione curva standard descritte in questo protocollo può essere adattato per qualsiasi bersaglio gene di interesse, compresi gli altri marcatori filogenetici (vale a dire, archeali 16S rRNA, 18S rRNA fungine) o geni coinvolti in funzioni importanti per l&#39;ambiente. Limitazioni nell&#39;uso di qPCR sono: a) la generazione di riproducibile alta qualità sCurva tandard per la quantificazione assoluta, b) la scelta di primer / sonde e ottimizzazione delle condizioni di saggio q-PCR, c) l&#39;uso di bassa qualità / acidi nucleici tranciate, d) la scelta della diluizione di lavoro di DNA / RNA per evitare l&#39;inibizione . Inoltre, si deve considerare che la tecnica qPCR fornisce abbondanze gene / trascrizione che non può equiparare alla cella conta: questo è particolarmente vero quando i geni 16S e 18S rRNA sono mirati, come i microrganismi hanno diversi numero di copie del gene ribosomiale nel loro genoma 25. curve standard di qualità poveri si tradurrà in quantificazione imprecisa del gene di interesse. E &#39;buona norma conservare uno stock di elevati standard di concentramento in piccole aliquote da cui curve standard freschi possono essere fatte. Non conservare le curve standard, sempre fare diluizioni fresche da uno stock di la più alta concentrazione di volta in volta. Per precisa quantificazione dei campioni ambientali assicurare la gamma di concentrazioni della stanCurva Dard abbraccia i valori Cp attesi dei campioni sconosciuti. Quando quantificazione trascrizioni, costruire la curva standard da RNA non DNA a doppio filamento. Quando possibile, la quantificazione dei campioni da confrontare direttamente dovrebbe essere completata entro un singolo test per evitare variabilità inter-saggio 20. Questo potrebbe non essere sempre possibile. Pertanto, per confrontare abbondanze di geni che si generano tra test è consigliabile avere un sotto-insieme casuale di campioni replicati tra i saggi. Un&#39;ampia selezione di primer e sonda set sono attualmente disponibili per il targeting qPCR taxa microbica e gruppi funzionali è necessario 15. Una particolare attenzione nella scelta di questi al fine di garantire sia la copertura massima e specificità per il gruppo target. Se l&#39;efficienza di reazione di un dosaggio qPCR non è soddisfacente, la risoluzione dei problemi inizia con test differenti condizioni di ciclo termico (come tempo di ricottura e / o temperatura) e / o condizioni di reazione, ad esempio, variando le concentrazioni primer sonda. OSNO le condizioni di analisi e di reazione q-PCR sono ottimizzati, effettuare sempre un test iniziale di una serie di diluizioni di DNA / cDNA per determinare la concentrazione modello appropriato. Selezionare l&#39;intervallo di diluizione conseguente numero di copie più alto come la diluizione modello ottimale per ulteriori analisi. Attualmente, le tecnologie di sequenziamento di prossima generazione capannone in modo efficiente luce sulla struttura delle comunità microbiche e funzioni in una pletora di ambienti 26,27,28. Tuttavia, questi insiemi di dati sono spesso basate su end-point PCR librerie ampliconi e quindi forniscono solo valutazioni semi-quantitative della abbondanza dei taxa particolare. Quindi, la capacità di tempo reale PCR basato a bersaglio specifici marcatori tassonomici (da alto dominio fino al livello di deformazione) permette la validazione efficace dei risultati ottenuti dal sequenziamento di prossima generazione. Inoltre, qPCR è stato utilizzato con successo in combinazione con altri metodi molecolari ecologia microbica quali ISO stabiletope sondare (SIP) o microarray filogenetici / funzionali. In combinazione con l&#39;ex strumento, qPCR può essere utilizzato per quantificare la comunità metabolicamente attiva 29,30. In combinazione con l&#39;analisi di microarray, qPCR fornisce chiave di interpretazione quantitativa dei marcatori-based e funzionale del gene filogenetici indagini ambienti 31,32. Pertanto, utilizzato da solo o in combinazione con altri (spesso basate sui processi) valutazioni della funzione degli ecosistemi, la PCR quantitativa è uno strumento essenziale per ecologisti microbici nell&#39;esplorazione del legame sfuggente tra le comunità microbiche e le funzioni dell&#39;ecosistema.

I microrganismi sono la pietra angolare della funzione biosfera ecosistema di guida. La maggior parte dei microrganismi rimangono uncultured 1. Pertanto approcci basati molecolari sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione della diversità e della funzione dei microrganismi nell&#39;ambiente. Al centro di questi approcci è l&#39;estrazione di acidi nucleici da campioni ambientali e la successiva amplificazione di geni bersaglio mediante Polymerase Chain Reaction (PCR). Il primo passo di estrazione di DNA / RNA propone di lisare le pareti cellulari della comunità microbica presente, rimuovere molecole nucleico-acido non indesiderate (sostanze esempio, organici e inorganici) e mantenere DNA / RNA in soluzione per ulteriori analisi valle. Tra le diverse opzioni disponibili in letteratura 2,3,4,5, tra cui una gamma di kit di estrazione commerciale, il metodo Griffiths 6 è largamente impiegato 7,8,9. E &#39;conveniente e particularly ben adatto a sedimenti in quanto utilizza una fase di stallonatura battere per lisare le cellule e incorpora misure per minimizzare la co-estrazione di inibitori della PCR, come gli acidi umici, mentre recuperando contemporaneamente DNA e RNA. La seconda fase utilizza la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare geni bersaglio, come il marcatore tassonomica 16S rRNA, dagli acidi nucleici estratti. Questo approccio ha e continua a facilitare l&#39;esplorazione del non caratterizzato microbica scatola nera 10,11. Tuttavia, i metodi end-point PCR basato soffrono di vari limitazioni che possono influenzare la caratterizzazione delle comunità microbiche 12. Per quantificare con precisione abbondanze gene / trascrizione, real-time PCR, noto anche come la PCR quantitativa (qPCR) deve essere utilizzato. qPCR sfrutta sistemi di colorante reporter fluorescenti che traccia accumulo amplicone dopo ogni ciclo della PCR. Ciò è significativo in quanto significa che la quantificazione può verificarsi durante la fase esponenziale precoce invecerispetto al punto finale, la fase della reazione PCR, quando la resa amplicone è ancora direttamente proporzionale all&#39;abbondanza iniziale del gene bersaglio. Due sistemi giornalista sono comunemente utilizzati: un intercalando macchia acido nucleico 13 e il 5 attività di &#39;3&#39; esonucleasi della DNA polimerasi 14. Dal momento che il precedente sistema giornalista si lega indistintamente a tutto il DNA a doppia elica, può portare ad una sovrastima della sequenza di destinazione se si verificano ampliconi non specifici indesiderati o dimeri di primer di prodotti. Per aggirare questo, può essere richiesto vasta ottimizzazione di amplificazione. In quest&#39;ultimo sistema, modello di amplificazione viene monitorato utilizzando una combinazione di attività 5 &#39;nucleasi di Taq polimerasi che fende un fluoroforo da una sonda interna. Questa caratteristica aumenta la specificità del test dovuta all&#39;utilizzo di una sonda fluorogenica che si lega solo al complementari SEQUENC specifico bersaglioe tra la coppia di primer. Con entrambi chimiche quantificazione si ottiene determinando il valico (Cp) se l&#39;accumulo di ampliconi PCR, come misurato da un aumento della fluorescenza, è significativamente superiore fluorescenza di fondo. qPCR è stato ampiamente utilizzato in ecologia microbica per determinare le abbondanze di geni in diversi ambienti 15. Inoltre, la trascrizione inversa di RNA a cDNA è combinato con qPCR e RT-qPCR per quantificare l&#39;espressione genica. Quindi, qPCR e RT-qPCR rappresentano veloci, metodi efficaci per la quantificazione del numero di geni e / o di trascrizione all&#39;interno di campioni ambientali. I microrganismi in sedimenti costieri auto vari processi ecosistemici, compresa la mineralizzazione della sostanza organica, la degradazione degli inquinanti e il cicli biogeochimici dei macronutrienti, come 16,17,18 azoto. La comprensione esaustiva di queste trasformazioni richiede un accoun completat dei contribuenti popolazioni microbiche, compresi i dati quantitativi sulle gene e la trascrizione abbondanze. Qui introduciamo una serie di accuratamente testati protocolli, semplificate e standardizzate per la quantificazione dei batteri di geni e la trascrizione abbondanze 16S rRNA nei sedimenti costieri. Il protocollo delinea la raccolta dei campioni, DNA simultanea e l&#39;estrazione di RNA, la preparazione RNA privi di DNA, il controllo della qualità degli acidi nucleici estratti, generazione di 16S rRNA-DNA e gli standard -RNA e la quantificazione dei campioni ambientali. I dati quantitativi derivati ​​dai metodi qui descritti sono necessari per far luce sulle comunità microbiche di guida ecosistemi costieri.

<table><tbody><tr><td>Diethylpyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Toxic, open under chemical hood</td></tr><tr><td>cetrimonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td>Irritant, open under chemical hood</td></tr><tr><td>potassium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>Equilibrate at pH 8 before using</td></tr><tr><td>Chloroform : Isoamylalcohol</td><td>Sigma</td><td>25666</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>VWR</td><td>1.06404.0500</td><td></td></tr><tr><td>polyethylenglycol 6000&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>528877-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Molecular Grade</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix E tubes</td><td>MP Biomedical</td><td>116914050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNAse&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Sigma</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse free 0.2&amp;nbsp;ml PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>SureCleanPlus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>pGEM Easy T Vector</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JM109 competent cells</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Sigma</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>59349</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Bioline</td><td>BIO-37035</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioline</td><td>BIO-37036</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>20768.235</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT DNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q-33120</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT RNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript kit</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-84002</td><td></td></tr><tr><td>qPCR machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous dna-rna extraction from coastal sediments and quantification of 16s rrna genes and transcripts by real-time pcr

Tempo reale Polymerase Chain Reaction noto anche come la PCR quantitativa (q-PCR) è uno strumento ampiamente utilizzato in ecologia microbica per quantificare abbondanze gene di gruppi tassonomici e funzionali in campioni ambientali. Usato in combinazione con una reazione di trascrittasi inversa (RT-q-PCR), può anche essere impiegato per quantificare trascritti genici. q-PCR sfrutta chimiche rilevazione fluorescente altamente sensibili che consentono la quantificazione degli ampliconi PCR durante la fase esponenziale della reazione. Pertanto, i pregiudizi associati &#39;end-point&#39; PCR identificati nella fase di plateau della reazione PCR sono evitati. Un protocollo per quantificare batteriche geni 16S rRNA e trascrizioni da sedimenti costieri tramite PCR in tempo reale è fornito. Innanzitutto, un metodo per la co-estrazione di DNA e RNA da sedimenti costieri, tra i passaggi aggiuntivi necessari per la preparazione di RNA privo di DNA, è delineato. In secondo luogo, una guida passo-passo per la quantificazione dei geni 16S rRNA e TRanscripts dagli acidi nucleici estratti tramite q-PCR e RT-q-PCR è delineato. Ciò include informazioni per la costruzione di curve di DNA standard e RNA. Considerazioni chiave per l&#39;uso di saggi di RT-q-PCR in ecologia microbica sono inclusi.

L&#39;estrazione di DNA buona qualità e RNA da sedimenti è il primo passo per la quantificazione dei geni e la trascrizione abbondanze. Un successo rese di estrazione chiare DNA e RNA fasce come indicato in figura 1 per il campione AC, dove taglienti bande 23S e 16S rRNA sono visibili oltre al alto peso molecolare banda DNA genomico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. DNA / RNA estrazione. I risultati tipici di estrazione di DNA / RNA da triplice copia (ABC) 0,5 g sedimenti costieri. 5 ml di DNA / RNA è stato eseguito su un agarosio 1,4% a 85 V per 40 min. Un marcatore molecolare nell&#39;intervallo 10,037-200 bp è stato utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Per preparare RNA, una digestione del DNA co-estratta è obbligatoria. Questo deve essere seguito da 16S rRNA end-point PCR dell&#39;RNA per garantire che il DNA è stato rimosso con successo. Se il DNA è stato completamente rimosso solo si osserva una banda nel controllo positivo. È importante utilizzare sia pulito e una diluizione 1:10 di RNA per garantire inibitori non impediscano la formazione di un prodotto di PCR. RNA può ora subire la reazione della trascrittasi inversa per convertirlo in cDNA. Questa operazione può essere eseguita sia con primer gene-specifici o esameri casuali. Tipicamente, la reazione viene effettuata in una macchina PCR, per garantire profilo ottimale della temperatura. Questo cDNA è utilizzato come modello nella successiva reazione qPCR. DNA e RNA è quantificato per determinare la concentrazione modello utilizzato in ogni reazione. Un protocollo reazione qPCR è delineato rivolge 16S rRNA DNA. Per 16S rRNA trascrizioni sostituiscono il cu serieRVE e modello con cDNA. Come campioni incogniti vengono quantificati contro la curva standard, è indispensabile per garantire che la curva standard è di buona qualità. La Figura 2 mostra la preparazione di (A), curve standard e diluizioni di DNA ambientale, (B), l&#39;amplificazione della curva standard e campioni ambientali (C) conversione di curva standard di una regressione lineare e calcolo del numero di copie di geni. Quando una serie di diluizione di 10 volte è correttamente preparato e amplificato la differenza 3.3 ciclo tra ogni diluizione standard è visto (ci vogliono 3,3 cicli per un aumento di dieci volte in modello a efficienza di amplificazione 100%) (Figura 2BI). Le curve standard descrittori, tra cui i valori di R 2 di 0.99 e l&#39;efficienza della PCR all&#39;interno della gamma da 90 a 110% (Figura 2C) sono desiderati. È importante segnalare valori Cp dal alcun controllo template (NTC) se presente. In questo caso un cutoff Cp per gli standard ed i campioni 3,3 cicli (&lt;em&gt; cioè, un log volte) superiore al valore Cp del NTC è imposto 20 (Figura 2Cii). Modello Unknown estratto dal DNA sedimento è stato quantificato da pulito, 10 -1, 10 -2 e -3 10 diluizioni (B). Il campione puro non amplificare, i valori Cp di 10 -1 a 10 -3 diluizioni erano 24.12, 26.02 e 28.40 rispettivamente. La NTC Cp era 30,5, è stato imposto un taglio del NCT del 27,2. Conversione abbondanze gene per g -1 bagnato sedimenti peso portato a 2,5 x 10 7 e 7.1 x 10 7 per 10 -1 e -2 10, rispettivamente, per la gamma di diluizione. 10 -3 diluizione Cp era al di sotto del valore soglia NTC, e pertanto non è stato utilizzato. In questo caso il 10 -2 è stato selezionato come la diluizione modello ottimale. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. 16S rRNA gene QPCR amplificazione del DNA standard e ambientale estratto da sedimenti costieri. Preparazione di (A) i) curva standard DNA e ii) diluizioni di DNA ambientale per qPCR amplificazione, (B) qPCR amplificazione di i) curva standard DNA e ii) campioni ambientali, Cp per ogni campione sono mostrati. (C) i) di regressione lineare della curva standard con descrittori curva standard; ii) il calcolo delle abbondanze gene da campioni ambientali. NTC:. Controllo modello negativo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> CTAB </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 x3H 2 O </td><td> 2.58 g </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2,05 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> fino a 100 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Preparazione di tampone CTAB-fosfato. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> PEG 6000 </td><td> 30 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 9.35 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> fino a 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nota: aggiungere PEG 6000 lentamente sotto un moderato riscaldamento e agitazione di 50 ml di dH 2 O. </td></tr></tbody></table>Tabella 2. Preparazione della soluzione precipitazioni PEG-NaCl. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> RNA non diluito / 01:10 RNA diluito </td><td> 1,0 ml </td></tr><tr><td> 10x PCR Buffer </td><td> 5.0 ml </td></tr><tr><td> dNTP 10 mM </td><td> 1,0 ml </td></tr><tr><td> 63F primer forward </td><td> 1,0 ml </td></tr><tr><td> CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC </td><td></td></tr><tr><td> 518R primer reverse </td><td> 1,0 ml </td></tr><tr><td> ATT ACC GCG GCT GCT GG </td><td></td></tr><tr><td> Taq polimerasi </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td> DH RNasi-free 2 O </td><td> 40,6 ml </td></tr></tbody></table>Tabella 3. qualità RNA Master Mix di controllo PCR senza DNA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> RNA </td><td> 0,5-5 mg </td></tr><tr><td> dNTP 10 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Reverse Primer 10 micron / a caso hexamers 50 micron </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC-H 2 O </td><td> Fino a 13 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 4. cDNA mix reazione di sintesi A. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Buffer 5x </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> digitale terrestre </td><td> 1 ml </td><html></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Trascrittasi inversa </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 5. cDNA mix reazione di sintesi B. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bersaglio </td><td> nome Primer </td><td> Sequenza </td><td> Ricottura T (° C) </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td rowspan="3"> batteri 16S rRNA </td><td> Bact1369F </td><td> CGG TGA ATA CGT TCY CGG </td><td rowspan="3"> 56 </td><td rowspan="3"> Suzuki et al. 2000 19 </td></tr><tr><td> Prok1492R </td><td> GGW TAC CTT GTT ACG ACT T </td></tr><tr><td> TM1389F (sonda) </td><td> CTT GTA CAC ACC GCC CGT C </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Tabella 6. Primer e sonde per l&#39;analisi 16S rRNA q-PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> 2x Master Mix </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> Primer Forward (10 micron) </td><td> 0,8 ml </td></tr><tr><td> primer reverse (10 micron) </td><td> 0,8 ml </td></tr><tr><td> Probe (10 micron) </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td> acqua </td><td> 7,0 ml </td></tr><tr><td> Volume finale </td><td> 19 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 7. tempo reale miscela di reazione PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> descrittore </td><td> Importanza </td></tr><tr><td> Coefficiente di correlazione (R 2) </td><td> Una misura della linearità della curva standard. Idealmente dovrebbe essere R 2 = 1. Valore di R 2 = 0,98-0,99 sono accettabili. </td></tr><tr><td> Slope (α) </td><td> Una misura dell&#39;efficienza di reazione. Idealmente, esso dovrebbe essere equivalente a -3,32. Valore nell&#39;intervallo compreso tra -3,58 e -3,1. </td></tr><tr><td> Efficienza (= 10 (-1 / pendenza) -1) </td><td> Se è al 100%, i modelli raddoppia dopo ogni ciclo termico durante l&#39;amplificazione esponenziale. Una buona gamma efficienza è tra il 90 e il 110%. </td></tr><tr><td> Y Intercept (β) </td><td> Il limite teorico di rilevazione della reazione. Anche se non utilizzato per quantificare la sensibilità di reazione, è importante quando si confrontano diverse curve standard dello stesso bersaglio. </td></tr></tbody></table> Tabella 8. QPCdescrittori di reazione r.

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Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

simultaneous-dna-rna-extraction-from-coastal-sediments-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

17.5K Views.  National University of Ireland Galway. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction. 

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Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Valutazione della contaminazione da DNA a RNA campioni basati sul DNA Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Ricerca

Genetica

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Ambiente

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biologia

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

Visualizzazione delle dinamiche microbiche del ciclo del metano nelle zone umide costiere

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

L&#39;esaurimento delle RNA ribosomiale per metagenomiche Gut Mosquito RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Estrazione economica del DNA di diatomee utilizzando un kit modificato

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

Autore in primo piano: Test delle diatomee per l'esame forense dell'annegamento 

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Valutazione della contaminazione da DNA a RNA campioni basati sul DNA Ribosomal

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

Visualizzazione delle dinamiche microbiche del ciclo del metano nelle zone umide costiere

L'esaurimento delle RNA ribosomiale per metagenomiche Gut Mosquito RNA-seq

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti

Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti