Diese Publikation wurde von der Forschung mit der finanziellen Unterstützung des Natural Environment Research Council (NERC) unter dem Förderkennzeichen NERC NE / JO11959 / 1 und Science Foundation Ireland &amp; Marie-Curie-Maßnahme COFUND unter Grantnummer 11 / SIRG / B2159awarded zu CJS geleitet ausging und die östliche Academic Research Consortium (Eastern ARC).

1. DNA &amp; RNA Extraktion von Marine Coastal Sediments <ol><li> Herstellung von Ribonuklease (RNase) -freie Material und Arbeitsbereich <ol><li> Bereiten Sie RNAse-freiem destilliertem Wasser (dH 2 O) , indem sie mit 0,1% Diethylpyrocarbonat Behandlung (DEPC) und Inkubation bei 37 ° CO / N. Entfernung von restlichem DEPC durch Autoklavieren dH 2 O bei 121 ° C für 15 min. Verwenden Sie DEPC behandelt dH 2 O , um alle Lösungen zu machen. </li><li> Backen Sie alle Glaswaren bei 180 ° CO / N. Entfernen Sie die Plastikdeckel und Felgen, genießen sie in einer Lösung von 2 M NaOH O / N, und spülen Sie sie mit DEPC behandelt dH 2 O vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie eine CTAB-Phosphat - Pufferlösung gemäß Tabelle 1. </li><li> Bereiten Sie die PEG-NaCl Fällungslösung gemäß Tabelle 2. </li><li> Reinigen Sie alle Arbeitsflächen (dh Bank, Mikro, Dunstabzugshaube) und Mikropipetten mit RNAse-Dekontaminationslösung vor dem Start. Tragen Sie Handschuhe während des gesamten Verfahrens. </li&gt; <li> Verwenden Sie RNAse-freie Kunststoffgeschirr zusammen mit Mikrofilterspitzen Probe eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li></ol></li><li> Umweltprobensammlung und -speicherung <ol><li> Sammeln Küsten Sediment bei Ebbe ein steriles 50 ml-Falcon-Röhrchen aus den oberen 2,5 cm verwendet wird. Sammeln Sie ca. 15-20 g Sedimenten. Schließen Sie vorsichtig den Deckel nach der Probensammlung. Transport sofort in das Labor in einem Kühler bei 4 ° C zur sofortigen Verarbeitung. </li><li> Homogenisieren der Probe mit einem sterilen Spatel und Aliquote von 0,5 g Naßgewicht Sediments in eine 2 ml bead schlagendes Mischrohr. Aliquotieren zusätzliche Replikate, flash-freeze von in flüssigem Stickstoff platzieren. Shop Aliquots bei -80 ° C. Achtung: Schutzhandschuhe und Schutzbrille, wenn Umgang mit flüssigem Stickstoff. Hinweis: Wenn das Feld Website ist nicht in der Nähe zu einem Labor, aliquote 0,5 g Sediment in 2 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen auf der Wiese. Blitz gefrieren die Rohre von ihnen sofort in li setzenquid Stickstoff und Transport ins Labor. Proben bei -80 ° C bis zur Verarbeitung. </li></ol></li><li> Co-Extraktion von DNA und RNA aus sediment Hinweis: Das folgende Protokoll ist eine modifizierte Version des Verfahrens Griffiths 6. <ol><li> Hinzufügen 500 ul CTAB-Phosphatpuffer und 500 &amp; mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) auf die 2 ml sicken Lysieren Röhrchen mit 0,5 g des Sediments und invertieren die Röhre 5-10 mal die Probe zu homogenisieren. Achtung: Führen Sie diesen Schritt in einer Abzugshaube eine geeignete Schutzausrüstung tragen (dh Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille) zu allen Zeiten. </li><li> Vortex bei voller Geschwindigkeit für 2,5 min. Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> In einer Abzugshaube extrahieren Sie die obere wässrige Schicht und Transfer in ein neues 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Proben auf Eis, 500 &amp; mgr; l eiskaltem Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1). </li><li> Invert mehrmals, bis eine Emulsion Visib istle. Zentrifuge für 10 min bei 16000 × g bei 4 ° C. </li><li> In einer Dunstabzugshaube die obere wässrige Schicht zu extrahieren und sie in einem neuen 1,5 ml sterilen Röhrchen platzieren. Man fällt die Nukleinsäuren durch Zugabe von zwei Volumen 30% PEG- NaCl-Lösung und gut mischen. </li><li> Inkubieren auf Eis für 2 Stunden oder lassen Sie Proben bei 4 ° CO / N. </li><li> Am Ende der Inkubation Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Hinweis: Ein Pellet am Boden des Röhrchens sichtbar sein können. </li><li> Den Überstand vorsichtig entfernen mit einer Mikropipette, stellen Sie sicher, nicht das Pellet zu stören. Etwa 10 ul PEG-Lösung in dem Rohr und 1 ml eiskaltem 70% Ethanol. </li><li> Zentrifuge für 20 min bei 16000 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie langsam Ethanol mit einer Mikropipette zu berühren nicht das Pellet zu kümmern. </li><li> Zentrifuge für 5 Sekunden und entfernen restliche Ethanol mit einer Mikropipette. Lassen Sie das Pellet für ca. 5 min an der Luft trocknen. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 50 &amp; mgr; l DEPC-behandeltemH 2 O. Untersuchen der Qualität und Ausbeute der DNA / RNA durch Agarose - Gelelektrophorese laufen 5 ul auf einem 1% Agarose - Gel 19. Teilen Sie die Nukleinsäuren in zwei Aliquots, 15 &amp; mgr; l für DNA und 30 &amp; mgr; l für RNA. </li><li> Lagern Sie die DNA bei -80 ° C bis benötigt. Isolieren RNA, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von RNA und Qualitätsprüfung von DNA-freie RNA <ol><li> Die Verdauung von DNA <ol><li> Hinzufügen 3 ul DNAse I Puffer und 1,5 ul DNAse I bis 30 &amp; mgr; l Volumen von Nukleinsäuren, für 30 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Mischen Sie die DNAse Inaktivierung Reagenz durch Vortexen für 30 Sekunden. Hinzufügen, 4,8 &amp; mgr; l der Lösung zu der Probe. bei RT inkubieren 5 min, den Boden der Röhren gelegentlich tippen Sie auf die Lösung zu mischen. </li><li> Zentrifuge bei 10.000 g für 90 s bei RT, den Überstand (RNA) in ein neues Röhrchen, dabei nicht Niederschlag zu übertragen, die Folgereaktionen hemmen können. </li&gt; </ol></li><li> RNA Qualitätsprüfung <ol><li> Hinzufügen , 2 ul RNA und 18 ul sterilem RNAse-freie dH 2 O bis 1:10 verdünnen. <ol><li> In getrennten PCR-Reaktionen, fügen 1 ul unverdünnt oder 1:10 Verdünnung von RNA in ein steriles 0,5 ml PCR-Röhrchen. In PCR - Reaktionskomponenten des 16S - rRNA - Gen gemäß Tabelle 3 zu verstärken. Fügen Sie eine &quot;positive&quot; (z. B. DNA , die aus einer reinen Bakterienkultur gewonnen wird ), eine &quot;PCR - Inhibitor&quot; Kontrolle (dh 1 ul positive Reinkultur DNA und 1 ul ordentlich extrahierter RNA) und eine &quot;negative&quot; Kontrolle von sterilen RNAse-frei dH 2 O. </li></ol></li><li> Stellen Sie den Thermocycler mit den folgenden Amplifizierungsparameter: 95 ° C 5 min (95 ° C 30 Sekunden, 57 ° C 30 Sekunden, 72 ° C 1 min) x 35 Zyklen, 72 ° C 10 min. </li><li> Laufen 10% des PCR-Produkts auf einem 1% igen Agarosegel bei 85 V für 40 min. Wiederholen Sie die DNAse I Behandlung, wenn ein PCR-Produkt in der Umwelt RN gebildet wirdA-Proben. </li></ol></li></ol> 3. Erzeugung von First Strand cDNA aus RNA <ol><li> Fügen Sie die Reagenzien gemäß Tabelle 4 zu einem RNAse / DNAse frei 0,2 ml PCR - Röhrchen. </li><li> Inkubieren der Probe bei 65 ° C 5 min. Auf Eis für mindestens 1 min und dann inkubiert bei 25 ° C für 10 min. </li><li> Um das gleiche Rohr fügen Sie die aufgeführten Reagenzien , die in Tabelle 5. </li><li> Inkubieren der Probe bei 55 ° C für 50 min. Inaktivieren der Reaktion bei 72 ° C für 10 min. </li><li> Store cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Quantitative PCR <ol><li> Erzeugung von DNA-Standards für qPCR <ol><li> Amplify bakteriellen 16S - rRNA - Sequenz 20 (oder irgendeine andere Sequenz von Interesse) aus genomischer DNA aus Reinkultur extrahiert mit q-PCR - Primer (1369F &amp; 1492r 21). </li><li> Man reinige das PCR-Produkt einen kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Klonen Sie das gereinigte PCRProdukt in einen 3&#39;-T Überhang Vektorsystem Klonieren gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wandeln Sie den Vektor der PCR Einfügen in Escherichia coli JM109 kompetente Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers enthält. </li><li> Platte 50 ul Transformation auf Ampicillin (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) und IPTG (0,5 mM) Luria Bertani-Agarplatten (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / l, NaCl 10 g / l, Agar 15 g / L). Inkubieren O / N bei 37 ° C. </li><li> Wählen Sie eine einzelne positive weißen Trans von der Platte. Impfen die positive Trans in 50 ml LB-Brühe, die 100 ug / ml Ampicillin und Inkubieren O / N bei 37 ° C bei 250 rpm schütteln. </li><li> Vom O / N-Kultur, zu isolieren und zu reinigen, die das Plasmid Anweisungen Kommerzielle Kits nach Hersteller. </li><li> Linearisieren des Plasmids ein geeignetes Restriktionsenzym verwendet , das einmal zum Schneiden des Plasmids fähig ist (beispielsweise EcoRI). </li><li<html> &gt; Die Reinheit des Plasmid - Analyse durch das Absorptionsverhältnis A 260 / A 280 19 zu messen. Wenn das Verhältnis unter 1,8 ist, re-extrahiert die Plasmids mit Phenol-Chloroform 19. Hinweis: Reine DNA ein 1,8-Verhältnis aufweist. </li><li> Bestimmung der Konzentration von Plasmid - DNA durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers 19. Hinweis: Alternativ kann die Genauigkeit der Quantifizierung durch Verwendung eines fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff in Verbindung mit einem Fluorometer verwendet, verbessert werden. </li><li> Sequenz das Plasmid legen Sie die Größe des Ziels in Basen zu bestätigen. Berechnen der Menge (dh percentage) Insert - DNA in dem Plasmid (beispielsweise in einem 3000 bp Vektor, ein 123 bp DNA - Fragment ist 3,9% der Gesamt - DNA) und multipliziert es mit der Konzentration in 4.1.10 erhalten wird , um zu bestimmen , der DNA Konzentration des Targets (insert). </li><li> Verwenden Sie die folgende Gleichung die Kopien der Ziel pro ul zu berechnen: Last / 54067 / 54067eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Berechnen des Zielmolekulargewicht (TMW), indem die Anzahl der Basenpaare der Ziel-DNA durch die mittleren Molekulargewicht von Doppelstrang-DNA Multiplizieren (dsDNA, 660 Daltons pro Basenpaar). </li><li> Verdünne die Ziel - DNA in einem Bereich von 10. Oktober - 2. Oktober Kopien unter Verwendung von 2 &amp; mgr; l DNA und 18 ul sterilem dH 2 O. Mischen Sie jede Verdünnung gut und Spin-down kurz bevor die nächste Verdünnung zu machen. </li></ol></li><li> Die Erzeugung von RNA-Standardkurve für qPCR <ol><li> Von dem Schritt 4.1.5 Bildschirm eine Reihe von weißen Kolonien (etwa 5) durch Kolonie - PCR - 19 das Ziel Reverse - Primer (dh R1492) und die Vorwärts Vektorplasmid Primer M13F verwenden. Anmerkung: Diese Kombination von Primern amplifiziert werden stromaufwärts in der richtigen Sinn-Orientierung klonierten Inserts mit einem T7 Promotorstelle. </li><li> Man reinige das PCR-Produkt eines kommerziellen Kits folgenden Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Quantifizieren des gereinigten PCR-produkt bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. </li><li> Mit 200 ng des PCR - Produkts in einem Endvolumen von 20 ul mit 7,5 mM jedes Ribonukleotid, 1 T7 - Reaktionspuffer und 1 T7 - Polymerase - Enzym für die in vitro - Transkriptionsreaktion. </li><li> Inkubieren der Reaktion für 4 h bei 37 ° C. 1 Einheit RNase-freie DNase I der Reaktion, Inkubation: 15 min bei 37 ° C DNA-Matrize zu entfernen. </li><li> Wiederherstellen der in vitro transkribierten RNA durch Ethanolfällung und 19 RNA - Ausbeuten unter Verwendung eines Fluorimeters oder durch Absorption bei 260 nm quantifiziert. </li><li> Berechnen Transkript Zahl pro ul RNA. Fügen Sie die Anzahl von Basenpaaren in der Ziel - RNA (beispielsweise 123 Basen) , die der Länge des T7 - Promotors (153 Basen) und multiplizieren mit dem mittleren Molekulargewicht von RNA, 340 Daltons pro Basis. </li><li> Hinzufügen 500 ng quantifizierter Ziel-RNA mit einer reversen Transkriptase (RT) Reaktion wie in Abschnitt beschrieben 3. Abwechselnd verdünnen cDNA wie in 4.1.13 zur Verwendung umrissenenwie die Standardkurve. </li></ol></li><li> Real-Time PCR <ol><li> Thaw Umwelt-DNA / cDNA-Proben, Standards und qPCR Reagenzien auf Eis. Schützen Sie die fluorogene Sonde aus Licht. </li><li> Verdünnen Sie die Standards für die Standardkurve wie in 4.1.14 beschrieben. Machen 01.10 Verdünnungen der Umwelt - DNA / cDNA von ordentlich bis 10 -3 durch Zugabe von 2 ul Probe zu 18 ul sterilem dH 2 O. </li><li> Führe einen Mastermix Reaktion für die Gesamtzahl der Reaktionen plus 10% gemäß Tabelle 6 (Primer und Sonde) und Tabelle 7 (Reaktionsmischung). Gut mischen und kurz zentrifugieren. </li><li> In 19 ul Master-Mix und 1 ul-Vorlage (Standard, Umweltprobe oder Wasser für die Negativkontrolle) zu jeder Vertiefung in einer 96-Well optischen qPCR Platte. Führen Sie jede Reaktion (Standards, Umweltproben und negative Kontrollen) in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem q-PCR optische Abdeckung. Zentrifugieren Sie die Platte kurz. Laden Sie dasPlatte in den Heizblock der qPCR-Maschine und den Deckel schließen. </li><li> Öffnen Sie die qPCR-Manager-Software. Klicken Sie auf das &quot;Protokoll Reiter&quot;, klicken Sie auf &quot;Neu erstellen&quot;, fügen Sie die folgenden Amplifikationsbedingungen: 3 min 95 ° C, (10 sec 95 ° C, 30 sec 60 ° C) x 40 Zyklen. Stellen Probenvolumen auf 20 ul, klicken Sie auf &quot;OK&quot; und das Protokoll zu speichern. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Platte&quot; aus. Unter den Bericht Farbstoff für geeignete Sonde &quot;bearbeiten ausgewählt&quot; klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Fluorophor&quot;, hinzufügen, zum Beispiel Fluorescein. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Highlight Vertiefungen, die die Normen enthält, wählen Sie &quot;Standard&quot; aus dem &quot;Sample-Typ&quot; Menü. Klicken Sie auf &quot;replizieren Serie&quot; zu ändern &quot;replizieren Größe&quot; bis 3, klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. Klicken Sie auf &quot;Verdünnungsreihe&quot; zu berechneten Ausgangskonzentration für Standard 1, geben Sie den Verdünnungsfaktor (10), wählen Sie &quot;abnehmend&quot; oder &quot;erhöhen&quot; add auf der Bestellung wurde die Standardkurve in Abhängigkeit hinzugefügtauf der Platte. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. </li><li> Markieren Sie auch Positionen, um die unbekannten Proben enthält, wählen Sie &quot;unbekannt&quot; aus dem &quot;Sample-Typ&quot; Drop-Down-Menü. Klicken Sie auf &quot;replizieren Serie&quot;, und ändern &quot;replizieren Größe&quot; auf 3. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. Bearbeiten Beispielnamen unter &quot;Beispielnamen&quot;. Wiederholen Sie die Prozedur für No Template-Kontrollen (NTC) Brunnen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot; auf dem Editorfenster Platte und Datei speichern. Klicken Sie auf &quot;Start run&quot;. </li><li> Nach Abschluss des Laufs wird die Datenanalysefenster öffnen. Klicken Sie auf die &quot;Quantifizierung Registerkarte&quot; die Standardkurve zu zeigen, Standardkurve Deskriptoren (Tabelle 8) und Verstärkung Plots. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Quantifizierung Daten&quot; für Cp-Werte und entsprechende Ausgangsmenge von Gen (SQ) von unbekannten Proben. Export-Tabelle Tabellenkalkulations-Software, falls erforderlich. </li><li> Multiplizieren Gen Abundanz von unbekannten Proben mit dem Verdünnungsfaktor, die Menge an Sediment extracted aus und die gesamten Nukleinsäuren wurden eluierte in Genkopien pro Gramm Frischgewicht Sediment zu erhalten. Hinweis: Eluieren der DNA von 0,5 g Sediment in 50 &amp; mgr; l, verdünnt 1/10, fügen 1 ul als Vorlage zu einer q-PCR-Reaktion; Genkopien g -1 Sediment berechnen durch Multiplikation: Genkopien ul DNA x Verdünnungsfaktor x Elutionsvolumen x 2. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Kombination von DNA / RNA-Extraktion mit qPCR stellt eine schnelle, genaue, relativ kostengünstiges Verfahren für die empfindliche Quantifizierung des Gens und transcript Abundanzen aus einer Reihe von Umweltproben, wie Küsten Sedimenten. Die anfängliche Extraktion von Nukleinsäuren ist der kritische Schritt eine repräsentative Ansicht der mikrobiellen Gemeinschaft vorhanden , um sicherzustellen , 22 erreicht. Eine Anzahl von Beschränkungen müssen für das Extraktionsprotokoll berücksichtigt werden: a) die Leistung der gesamten Zell - Lyse, b) Co-Extraktion von inhibitorischen Verbindungen (beispielsweise Huminsäuren oder Polyphenole), c) kontaminierende DNA in der RNA - Fraktion, d) einen schnellen Abbau der extrahierten Nukleinsäuren, wenn gespeichert. Es müssen Vorkehrungen, um diese Einschränkungen zu umgehen genommen werden. Zum Beispiel weist insbesondere darauf geachtet werden , dass die Extraktion von Nukleinsäuren , die für den Probentyp optimiert ist (beispielsweise, Sedimente, Boden, Abwasser usw.). Signifikante Verbesserungen in der Nukleinsäure-Ausbeute und Qualität sowohl für DNA und RNA kann durch Durchführung von Vorversuchen 23 erreicht werden. Um die Wirkung der inhibitorischen Verbindungen auf PCR-basierte Anwendungen 24, testen eine Reihe von Verdünnungen aus der extrahierten DNA und RNA minimieren. Um den schnellen Abbau der extrahierten DNA / RNA aus mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen zu umgehen und einen möglichen Verlust der genetischen Information, speichern mehrere kleine Volumen Aliquots bei -80 ° C zu vermeiden. Wenn sorgfältig entworfen, qPCR ist eine robuste, hoch reproduzierbare und empfindliche Methode. Bemerkenswerterweise Konstruktion die Verfahren zur Amplifikation und Standardkurve in diesem Protokoll umrissenen kann für jedes Gen Ziel von Interesse angepasst werden, einschließlich anderer phylogenetische Marker (dh archaeal 16S rRNA, Pilz 18S rRNA) oder in wichtigen Funktionen in der Umgebung beteiligten Gene. Bekannte Einschränkungen bei der Verwendung von qPCR sind: a) die Erzeugung reproduzierbarer hoher Qualität standard Kurve für die absolute Quantifizierung, b) die Wahl der Primer / Sonden und Optimierung von q-PCR-Assay-Bedingungen, c) die Verwendung von geringer Qualität / geschert Nukleinsäuren, d) die Wahl der Arbeitsverdünnung von DNA / RNA-Hemmung zu vermeiden . Darüber hinaus ist es in Betracht gezogen werden muss, dass qPCR Technik Gen / transcript Abundanzen liefert, die nicht Zählwerte können gleichzusetzen Zelle: dies ist insbesondere der Fall, wenn 16S und 18S rRNA-Genen gerichtet sind, als Mikroorganismen unterschiedlicher Kopienzahl des ribosomalen Gen in ihrem Genom haben, 25. Schlechte Qualität Standardkurven werden in ungenauen Quantifizierung des Gens von Interesse führen. Es ist gute Praxis, eine Aktie mit einer hohen Konzentration Standards in kleinen Portionen zu speichern, aus dem frischen Standardkurven vorgenommen werden können. Machen Sie keine Standardkurven speichern, immer frische Verdünnungen von einem Lager der höchsten Konzentration jedes Mal. Für eine genaue Quantifizierung von Umweltproben den Bereich der Konzentrationen des stan gewährleistendard Kurve erstreckt sich über die erwarteten Cp-Werte der unbekannten Proben. Wenn Transkripte zu quantifizieren, konstruieren die Standardkurve von RNA nicht DNA verdoppeln. Wenn möglich, Quantifizierung von Proben direkt sollten verglichen werden , in einem einzigen Assay abgeschlossen sein Inter-Assay - Variation 20 zu vermeiden. Dies mag nicht immer möglich sein. Daher Gen Häufigkeiten zwischen Assays erzeugt zu vergleichen, ist es ratsam, eine zufällige Teilmenge von Proben zwischen Assays repliziert haben. Eine große Auswahl an Primer und Sondensätze sind derzeit für qPCR mikrobiellen Taxa und funktionelle Gruppen 15. Die sorgfältige Abwägung erforderlich Targeting wird , wenn diese Auswahl sowohl eine maximale Abdeckung und Spezifität für die Zielgruppe zu gewährleisten. Wenn die Reaktionseffizienz eines qPCR Assay nicht zufriedenstellend ist, beginnt Fehlersuche mit unterschiedlichen thermischen Zyklusbedingungen zu testen (wie Glühzeit und / oder Temperatur) und / oder Reaktionsbedingungen, beispielsweise Primer-Sondenkonzentrationen variiert. Once die q-PCR-Assays und die Reaktionsbedingungen optimiert werden, immer einen ersten Test einer Reihe von DNA / cDNA-Verdünnungen führen die entsprechende Vorlage Konzentration zu bestimmen. Wählen Sie den Verdünnungsbereich, was zu der höchsten Kopienzahl als die optimale Vorlage Verdünnung für weitere Tests. Derzeit Schuppen der nächsten Generation Sequenzierungstechnologien effizient Licht auf die mikrobielle Gemeinschaft Struktur und Funktionen in einer Vielzahl von Umgebungen 26,27,28. Allerdings sind diese Datensätze oft basierend auf Endpunkt PCR Amplikon Bibliotheken und bieten daher nur semi-quantitative Einschätzungen der Fülle einzelner Taxa. Daher ermöglicht es die Fähigkeit, Echtzeit-PCR-basierte Technik spezifische taxonomische Marker auf Ziel (von höheren Domäne bis auf Stammebene) für eine effiziente Validierung der von der nächsten Generation Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse. Außerdem wurde qPCR erfolgreich in Kombination mit anderen mikrobiellen Ökologie molekularen Methoden wie stabile iso verwendetTope Sondierung (SIP) oder phylogenetischen / functional Microarrays. In Kombination mit dem ehemaligen Tool können qPCR verwendet werden , die metabolisch aktive Community 29,30 zu quantifizieren. Wenn sie mit Microarray - Analyse kombiniert wird , liefert qPCR Schlüssel quantitative Interpretation der phylogenetischen Marker-basierte und funktionale Gen Befragungen von Umgebungen 31,32. Deshalb, ob allein oder in Kombination mit anderen (oft prozessbasierten) Beurteilungen der Ökosystem-Funktion verwendet, quantitative PCR ist ein wichtiges Instrument für mikrobiellen Ökologen in der Erforschung des flüchtigen Verbindung zwischen mikrobiellen Lebensgemeinschaften und Ökosystemfunktionen.

Mikroorganismen sind der Eckstein des Ökosystems Funktion Biosphäre Fahren. Die Mehrzahl der Mikroorganismen bleiben unkultivierten 1. Daher Molekular basierte Ansätze sind von grundlegender Bedeutung unser Verständnis der Vielfalt und Funktion von Mikroorganismen in der Umwelt zu fördern. Im Mittelpunkt dieser Ansätze ist die Extraktion von Nukleinsäuren aus Umweltproben und die nachfolgende Amplifikation von Zielgenen, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wird. Der erste Schritt der DNA / RNA - Extraktion zielt darauf ab , die Zellwände der mikrobiellen Gemeinschaft vorhanden, entfernen Sie unerwünschte nicht - Nukleinsäure-Moleküle (zB organische und anorganische Substanzen) einsetzen und DNA / RNA in Lösung für Downstream - Analyse zu lysieren. Unter den verschiedenen Optionen , die in der Literatur 2,3,4,5, einschließlich einer Reihe von kommerziellen Extraktion Kits wird die Griffiths Methode 6 7,8,9 weithin eingesetzt. Es ist kostengünstig und particularly gut Sedimenten geeignet, da es eine sicken Mahlschritt verwendet Zellen zu lysieren und enthält Schritte, um die Co-Extraktion von PCR-Inhibitoren, wie beispielsweise Huminsäuren, zu minimieren, während die DNA und RNA gleichzeitig gewonnen wird. Der zweite Schritt verwendet die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zielgene, wie beispielsweise die 16S-rRNA taxonomische Marker zu amplifizieren, aus den extrahierten Nucleinsäuren. Dieser Ansatz hat und weiterhin die Erforschung des uncharacterized mikrobiellen Black Box 10,11 zu erleichtern. Allerdings Endpunkt PCR-basierten Methoden leiden unter verschiedenen Einschränkungen , die verzerren können die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften 12. Um genau Gen / Transkript Abundanz, real-time PCR, auch bekannt als quantitative PCR (qPCR) Quantifizierung verwendet werden. qPCR nutzt fluoreszierenden Reporterfarbstoff-Systeme, die Amplicon Akkumulation nach jedem Zyklus der PCR verfolgen. Dies ist signifikant, da es bedeutet, dass die Quantifizierung während des frühen exponentiellen Phase auftreten kann, eherals der Endpunkt, Phase der PCR-Reaktion, wenn das Amplicon Ausbeute auf den Anfangsfluss des Zielgens noch direkt proportional ist. Zwei Reportersysteme werden üblicherweise verwendet: eine interkalierende Nukleinsäure Fleck 13 und der 5 &#39;3&#39; Exonuklease - Aktivität der DNA - Polymerase 14. Da der ehemalige Reportersystem unterschiedslos auf alle doppelsträngige DNA bindet, kann es zu einer Überschätzung der Zielsequenz führen, wenn unerwünschte unspezifische Amplifikate oder Primerdimeren von Produkten auftreten. Um dies umfangreiche Optimierung der Amplifikation zu umgehen, kann erforderlich sein. Im letzteren System wird template - Amplifikation unter Verwendung einer Kombination aus einer 5&#39; - Nukleaseaktivität der Taq - Polymerase, spaltet ein Fluorophor von einer internen Sonde verfolgt. Dieses Merkmal erhöht die Spezifität des Assays durch die Verwendung einer fluorogenen Sonde, die nur mit dem komplementären zielspezifischen Sequenc bindete zwischen dem Primerpaar. Mit beiden Chemien ist Quantifizierung durch Bestimmung der Übergangsstelle (Cp), wobei die Akkumulation des PCR-Amplikons erreicht, wie durch eine Zunahme der Fluoreszenz gemessen wird, deutlich über Fluoreszenzhintergrund ist. qPCR wurde in der mikrobiellen Ökologie , um zu bestimmen Gen Abundanzen in verschiedenen Umgebungen 15 ausgiebig genutzt. Außerdem reverse Transkription von RNA in cDNA mit qPCR und RT-qPCR kombiniert Genexpression zu quantifizieren. Daher qPCR und RT-qPCR stellen schnelle, wirksame Methoden zur Quantifizierung von Gen und / oder Transkript Zahlen innerhalb Umweltproben. Mikroorganismen , die in Küstensedimenten fahren verschiedene Ökosystemprozesse, einschließlich der Mineralisierung der organischen Substanz, die den Abbau von Schadstoffen und der biogeochemischen Kreisläufe von macronutrients wie Stickstoff 16,17,18. Der Anspruch auf Vollständigkeit Verständnis dieser Transformationen erfordert ein umfassendes account der beitragenden mikrobiellen Populationen, einschließlich quantitative Daten über Gen und Transkript Abundanzen. Hier stellen wir eine Reihe von Herz und Nieren geprüft, optimierte und standardisierte Protokolle für die Quantifizierung von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und Transkript Abundanzen in Küstensedimenten. Das Protokoll beschreibt die Probenentnahme gleichzeitige DNA- und RNA-Extraktion, DNA-frei-RNA-Präparation, die Qualitätsprüfung der extrahierten Nukleinsäuren, die Erzeugung von 16S rRNA-DNA und -RNA Standards und Quantifizierung von Umweltproben. Quantitative Daten aus den Verfahren abgeleitet werden hier beschrieben benötigt Licht auf mikrobielle Gemeinschaften zu vergießen treibende Küstenökosysteme.

<table><tbody><tr><td>Diethylpyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Toxic, open under chemical hood</td></tr><tr><td>cetrimonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td>Irritant, open under chemical hood</td></tr><tr><td>potassium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>Equilibrate at pH 8 before using</td></tr><tr><td>Chloroform : Isoamylalcohol</td><td>Sigma</td><td>25666</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>VWR</td><td>1.06404.0500</td><td></td></tr><tr><td>polyethylenglycol 6000&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>528877-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Molecular Grade</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix E tubes</td><td>MP Biomedical</td><td>116914050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNAse&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Sigma</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse free 0.2&amp;nbsp;ml PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>SureCleanPlus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>pGEM Easy T Vector</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JM109 competent cells</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Sigma</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>59349</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Bioline</td><td>BIO-37035</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioline</td><td>BIO-37036</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>20768.235</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT DNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q-33120</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT RNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript kit</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-84002</td><td></td></tr><tr><td>qPCR machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous dna-rna extraction from coastal sediments and quantification of 16s rrna genes and transcripts by real-time pcr

Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion als auch quantitative PCR (q-PCR) bekannt, ist ein weit verbreitetes Werkzeug in mikrobiellen Ökologie Gen Abundanzen taxonomischen und funktionellen Gruppen in Umweltproben zu quantifizieren. Eingesetzt in Kombination mit einem Reverse-Transkriptase-Reaktion (RT-q-PCR), kann es auch Gentranskripte zu quantifizieren eingesetzt werden. q-PCR nutzt hochempfindliche Fluoreszenzdetektion Chemien, die während der exponentiellen Phase der Reaktion Quantifizierung von PCR-Amplicons ermöglichen. Daher werden die Verzerrungen im Zusammenhang mit &quot;end-point &#39;PCR nachgewiesen in der Plateauphase der PCR-Reaktion vermieden. Ein Protokoll, um bakterielle 16S-rRNA-Gene und Transkripte von Küstensedimenten über Echtzeit-PCR-Quantifizierung vorgesehen ist. Zuerst wird ein Verfahren für die Co-Extraktion von DNA und RNA aus Küstensedimenten, einschließlich der zusätzlichen Schritte zur Herstellung von DNA-freien RNA erforderlich ist, wird beschrieben. Zweitens ist ein Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und transcripts aus den extrahierten Nukleinsäuren über q-PCR und RT-PCR-q skizziert. Dazu gehören Details für den Aufbau von DNA- und RNA-Standardkurven. Wichtige Überlegungen für die Verwendung von RT-q-PCR-Assays in der mikrobiellen Ökologie sind enthalten.

Die Extraktion von guter Qualität DNA und RNA aus Sedimenten ist der erste Schritt in Abundanz-Gen und Transkript zu quantifizieren. Eine erfolgreiche Extraktionsausbeuten klare DNA und RNA - Banden wie in Abbildung 1 für Probe AC angegeben, wobei scharfe 23S und 16S rRNA - Banden zusätzlich zu der hochmolekularen Bande genomischer DNA sichtbar sind. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" width="400" /> Abbildung 1. DNA / RNA - Extraktion. Typische Ergebnisse von DNA / RNA - Extraktion aus dreifacher Ausfertigung (ABC) 0,5 g Küstensedimenten. 5 ul der DNA / RNA für 40 min bei 85 V auf einem 1,4% Agarose ausgeführt. Ein molekularer Marker in der 10,037-200 bp Bereich verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; RNA herzustellen, eine Verdauung der Co-extrahierte DNA ist obligatorisch. Dies muss von 16S rRNA-Endpunkt-PCR der RNA gefolgt werden, um sicherzustellen, daß die DNA erfolgreich entfernt wurde. Wenn die DNA vollständig nur eine Bande in der positiven Kontrolle entfernt wurde beobachtet. Es ist wichtig, sowohl unverdünnt und eine 1:10 Verdünnung von RNA-Inhibitoren zu verwenden, um sicherzustellen, sind nicht die Bildung eines PCR-Produkts zu verhindern. RNA kann durchlaufen nun die Reverse Transkriptase-Reaktion sie in cDNA zu konvertieren. Dies kann entweder mit genspezifischen Primern oder Random Hexameren durchgeführt werden. Typischerweise wird die Reaktion in einer PCR-Maschine durchgeführt wird, eine optimale Temperaturprofil sicherzustellen. Diese cDNA wird als Matrize in der nachfolgenden qPCR Reaktion verwendet. DNA und RNA quantifiziert die Templatekonzentration in jeder Reaktion verwendet, um zu bestimmen. Ein qPCR Reaktionsprotokoll skizzierte Targeting-16S-rRNA-DNA. Für 16S-rRNA-Transkripte ersetzen die Standard-cuRVE und Vorlage mit cDNA. Als unbekannte Proben gegen die Standardkurve quantifiziert werden, ist es zwingend notwendig , dass die Standardkurve ist von guter Qualität zu gewährleisten. Abbildung 2 zeigt die Herstellung von (A), Standardkurven und Umwelt - DNA - Verdünnungen, (B), Verstärkung der Standardkurve und Umweltproben (C) Umwandlung von Standardkurve zu einer linearen Regression und die Berechnung der Genkopie Zahlen. Wenn eine 10-fache Verdünnungsbereich richtig vorbereitet ist , und verstärkt einen Zyklus 3,3 Differenz zwischen jedem Standardverdünnungs gesehen (es dauert 3,3 Zyklen für eine zehnfache Erhöhung der Vorlage auf 100% Amplifikationseffizienz) (Abbildung 2Bi). Standardkurven Deskriptoren, einschließlich der R &amp; sub2 ; -Werte von 0,99 und PCR - Effizienzen im Bereich von 90 bis 110% (2C) sind erwünscht. Es ist wichtig, Cp-Werte aus der Leerwert-Kontrolle (NTC), falls vorhanden zu melden. Wenn dies der Fall ist eine Cp Cutoff für Standards und unbekannten Proben 3,3 Zyklen (&lt;em&gt; dh eine log - fach) höher ist als der Cp - Wert des NTC auferlegt wird , 20 (2Cii). Unbekannte Vorlage aus Sediment DNA extrahiert wurde aus ordentlich quantifiziert, 10 -1, 10 -2 und 10 -3 Verdünnungen (B). Die saubere Probe hatte verstärken nicht, die Cp - Werte von 10 -1 bis 10 -3 Verdünnungen waren 24.12, 26.02 und 28.40 sind. Der NTC-Cp betrug 30,5, ein NCT Cutoff von 27,2 auferlegt wurde. Konvertieren von Gen Abundanzen zu g -1 Nassgewicht Sediment resultierte in 2,5 x 10 7 und 7,1 x 10 7 für 10 -1 und 10 -2 jeweils für den Verdünnungsbereich. 10 -3 Verdünnungs Cp lag unterhalb der NTC cutoff und wurde deshalb nicht verwendet. In diesem Fall wurde die 10 -2 als die optimale Schablone Verdünnung ausgewählt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2. 16S rRNA - Gen qPCR Verstärkung von Standards und Umwelt - DNA von Küstensedimenten extrahiert. Herstellung von (A) i) DNA - Standardkurve und ii) Umgebungs DNA - Verdünnungen für qPCR Verstärkung, (B) qPCR Amplifizierung von i) DNA - Standardkurve und ii) Umweltproben, Cp für jede Probe gezeigt. (C) i) Die lineare Regression der Standardkurve mit Standardkurve Deskriptoren, ii) Berechnung von Gen Abundanz aus Umweltproben. NTC:. Negative-Kontrolle <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> CTAB </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 x3H 2 O </td><td> 2,58 g </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2,05 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> bis zu 100 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Herstellung von CTAB-Phosphatpuffer. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> PEG 6000 </td><td> 30 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 9,35 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> bis zu 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Hinweis: fügen PEG 6000 langsam unter mäßigem Erhitzen und Rühren von 50 ml dH 2 O. </td></tr></tbody></table>Tabelle 2. Herstellung von PEG-NaCl Fällungslösung. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> Das unverwässerte RNA / 1:10 RNA </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> 10x PCR-Puffer </td><td> 5,0 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTPs </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> 63F Vorwärtsprimer </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC </td><td></td></tr><tr><td> 518R Reverse-Primer </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> ATT ACC GCG GCT GCT GG </td><td></td></tr><tr><td> Taq-Polymerase </td><td> 0,4 ul </td></tr><tr><td> RNAse-frei dH 2 O </td><td> 40,6 ul </td></tr></tbody></table>Tabelle 3. DNA-freie RNA Qualitätsprüfung PCR Master - Mix. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> RNA </td><td> 0,5-5 &amp; mgr; g </td></tr><tr><td> 10 mM dNTPs </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Reverse-Primer 10 uM / Zufallshexameren 50 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC-H 2 O </td><td> Bis zu 13 &amp; mgr; l </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. cDNA - Synthese - Reaktionsmischung A. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> Buffer 5x </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 ul </td><html></tr><tr><td> RNAse Inhibitor </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Umgekehrte Transkriptase </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 5. cDNA - Synthese - Reaktionsmischung B. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ziel </td><td> Primer Name </td><td> Sequenz </td><td> Annealing T (° C) </td><td> Referenz </td></tr><tr><td rowspan="3"> 16S-rRNA-Bakterien </td><td> Bact1369F </td><td> CGG TGA ATA CGT TKE CGG </td><td rowspan="3"> 56 </td><td rowspan="3"> Suzuki et al. , 2000 19 </td></tr><tr><td> Prok1492R </td><td> GGW TAC CTT GTT ACG ACT T </td></tr><tr><td> TM1389F (Sonde) </td><td> CTT GTA CAC ACC GCC CGT C </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Tabelle 6. Primer und Sonden für die 16S - rRNA - q-PCR - Assays. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> 2x Master Mix </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Forward-Primer (10 uM) </td><td> 0,8 ul </td></tr><tr><td> Reverse-Primer (10 uM) </td><td> 0,8 ul </td></tr><tr><td> Probe (10 &amp; mgr; M) </td><td> 0,4 ul </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 7,0 ul </td></tr><tr><td> Das endgültige Volumen </td><td> 19 &amp; mgr; l </td></tr></tbody></table> Tabelle 7. Echtzeit - PCR - Reaktionsmischung. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Descriptor </td><td> Bedeutung </td></tr><tr><td> Korrelationskoeffizient (R 2) </td><td> Ein Maß für die Linearität der Standardkurve. Im Idealfall sollte es R 2 = 1 sein. Wert von R 2 = 0,98 bis 0,99 sind akzeptabel. </td></tr><tr><td> Slope (α) </td><td> Ein Maß für die Reaktionseffizienz. Im Idealfall sollte es entspricht -3,32 sein. Wert im Bereich zwischen -3,58 und -3,1. </td></tr><tr><td> Effizienz (= 10 (-1 / Steigung) -1) </td><td> Wenn es 100% ist, verdoppelt sich die Vorlagen nach jeder thermischen Zyklus während des exponentiellen Verstärkung. Ein guter Wirkungsgrad Bereich liegt zwischen 90 und 110%. </td></tr><tr><td> Y Intercept (β) </td><td> Die theoretische Grenze der Detektion der Reaktion. Obwohl es nicht zu quantifizieren Reaktionsempfindlichkeit verwendet wird, ist es wichtig, wenn verschiedene Standardkurven des gleichen Ziels verglichen werden. </td></tr></tbody></table> Tabelle 8. qPCR Reaktion Deskriptoren.

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Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

simultaneous-dna-rna-extraction-from-coastal-sediments-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

17.5K Aufrufe.  National University of Ireland Galway. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction. 

Serie: Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Forschung

Genetik

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Umwelt

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biologie

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

Wir danken den C-REAL-Mitgliedern für ihre Unterstützung bei der Feldbeobachtung und bei Laboranalysen.Visualisierung der mikrobiellen Dynamik des Methankreislaufs in Küstenfeuchtgebieten

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Wirtschaftliche Extraktion von Kieselalgen-DNA mit einem modifizierten Kit

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

Autor im Rampenlicht: Kieselalgen-Tests für forensische Ertrinkungsuntersuchungen 

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

Wir danken den C-REAL-Mitgliedern für ihre Unterstützung bei der Feldbeobachtung und bei Laboranalysen.Visualisierung der mikrobiellen Dynamik des Methankreislaufs in Küstenfeuchtgebieten

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben

Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben