עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1SC2GM092789-01A1, והטרשת הנפוצה הייתה תלמיד מחקר של תוכניות NMSU הווארד יוז רפואי מכון מחקר לתואר ראשונות. הסרטון ביים והפיק על ידי איימי Lanasa ומתואם על ידי ד&quot;ר פיליפ לואיס עם מדיה מכון קריאייטיב ב NMSU.

נוהל 1. חקר גידול יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח אחורי יתוש האנופלס gambiae G3 בinsectary ב27.5 מעלות צלזיוס עם לחות 80% ומחזור שעות 12:12 אור / חושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את הזחלים במזון חתולי קרקע עם שמרי בירה ביחס 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את היתושים בוגרים בדם עכברים ביום 3 לאחר הופעתה לייצור ביצים. </li></ol> 2. Dissection גוט יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי נתיחת חיטוי (שקופיות ומלקחיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 50 יתושים באמצעות aspirator ומניח אותם על מיטת זרימה 2 CO (Flypad האולטימטיבי). שטוף דגימת יתושים ברצף בשלוש צלחות פטרי המכילים 70% אתנול לניקוי משטח גוף היתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדגימה בשקופית זכוכית תחת stereomicroscopy. הסר את המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 50 אומץ לתנאים לבידוד דנ&quot;א metagenomic. אסוף 50 אומץ לתנאים לבידוד RNA metagenomic. </li></ol&gt; 3. בידוד דנ&quot;א Metagenomic הערה: ה-DNA Metagenomic מבודדת באמצעות Meta-G-DNA נום בידוד הקיט (יוטכנולוגיות Epicentre) עם השינוי המתואר להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50 קרבים נגד יתושים ב300 TE μl. הומוגני לדקות 1 באמצעות Bio-Gen PRO200 homogenizer (PRO המדעית Inc, ארה&quot;ב) בשעת 2000 סל&quot;ד מהירות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של פתרון Lysozyme המוכן lyse וμl 1 מתוך RNase להשעית התא. מיקס ידי vortexing ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של פתרון Meta-תמוגה (2X) וμl 1 מתוך proteinase K לצינור. מערבב על ידי vortexing. בקצרה דופק סרכזת הצינור כדי להבטיח שכל הפתרון הוא בתחתית של תחתית, ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מצנן לטמפרטורת חדר, ואז מקום על קרח במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350 μl של מגיב משקעי חלבון MPC לצינור והתמהיל ידי vortexing נמרץ למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה לאהוא הפסולת ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב12000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור נקי 2-מ&quot;ל, וזורק את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 570 μl של isopropanol לsupernatant. מערבב על ידי היפוך כמה פעמי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת דנ&quot;א ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב12000 XG ב 4 ° C. הסר את isopropanol בלי להינתק DNA הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של אתנול 75% כדי לשטוף את הגלולה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב12000 XG ב 4 ° C. הסר אתנול מבלי להפריע גלולת דנ&quot;א. מזגן מייבש את הגלולה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. הערה: אל על יבש DNA הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DNA גלול ב 50 μl של מאגר TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את גודלו של ה-DNA המבודד בהשוואה ל-DNA בקרת Fosmid (40 ק&quot;ג; 100 ng / μl) המסופק בערכה, באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה על 1% agarose ג&#39;ל. </li></ol> 4. בידוד RNA סה&quot;כ שימו לב: יש לנקות את שטח העבודהעם RNaseZap כדי למזער את זיהום RNase. רנ&quot;א Metagenomic היה מבודד מדגימות מעי יתושים באמצעות מגיב בידוד TriPure (רוש) עם שינויים קלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 50 קרבים נגד יתושים בצינור 2-מ&quot;ל עם מגיב הבידוד TriPure μl 500. הומוגני ל1 דקות במהירות 2000 סל&quot;ד על קרח באמצעות homogenizer. תן לו לשבת בRT למשך 5 דקות כדי לאפשר ניתוק של קומפלקסי nucleoprotein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כלורופורם 100 μl ומערבולת עבור 12 שניות, ותן לו לשבת בRT עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב -10,000 למשך 10 דקות. זהירות להוציא את הצינורית ללא שלבים מופרדים מטרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שלב מימי לצינור חדש, להוסיף 250 isopropanol μl, מערבב היטב, ולשים ב -20 ° C למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 12000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי רנ&quot;א משקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מבלי להינתק גלולה. שטוף את הכדור עם אתנול 75% 750 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant מבלי להפריע הגלולה.IR ייבוש הצינור עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend RNA עם מים חינם nuclease μl 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את רנ&quot;א הסך הכל עם DNase על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לנטרל את DNase ידי הדגרה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. רנ&quot;א הנחפז ואתנול וResuspend RNA במים חופשיים nuclease μl 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות של RNA כלל באמצעות NanoDrop. </li></ol> 5. דלדול רנ&quot;א ריבוזומלי הערה: הפרוטוקול פותח על בסיס שיטות שתוארה קודם לכן 12,13,15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברת PCR של שברי RNA ריבוזומלי גנים צעד זה יוצר ברכות מדגם ספציפיות rRNA, אשר ישמש כתבניות לשעתוק במבחנה כדי לייצר חלליות אנטי תחושת ריבוזומלי RNA (arRNA) כי הם מחמיאים לrRNA במדגם RNA המוחלט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנן ולסנתז סטי פריימר לrRNA בר PCR (1 טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PCR ב 50תגובת μl באמצעות DNA פולימראז תקי (Qiagen) בתבנית 50 ng-DNA, 1 x-PCR חיץ, Mg 1.5mm 2 Cl, 0.2 פריימרים מיקרומטר עם 35 מחזורים של denaturing ב 94 ° C עבור 10 שניות, 15 שניות בחישול 40 ° C עבור amplicon חיידקים 23s, ו50 ° C לamplicons האחרים, והארכה ב 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 (רחבה סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו במוצרי PCR ב% agarose ג&#39;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR QIAquick עם elution במאגר elution 50 μl. לכמת את הריכוז באמצעות NanoDrop. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתוק במבחנה של בדיקות rRNA אנטי תחושת ביוטין שכותרת-(arRNA). הערה: בשלב זה, בדיקות ספציפיות לדוגמה מתוך amplicons rRNA השונה מסונתזות באמצעות MEGAscript T7 הערכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת μl 20 עבור כל amplicon rRNA מדגם מסוים על ידי ערבוב את המרכיבים הבאים (טבלה 2). דגירת הלילה בשעת 37 ° C. <strong&gt; הערה: בדרך כלל תשואות התגובה&gt; 50 RNA מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 DNase אני μl (כלול בערכה) לתגובה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להסיר את תבנית ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אתנול 100 μl 100% לתגובה, בצנטריפוגה XG 12000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי לזרז מסונתז arRNA. בטל supernatant ולשטוף את הגלולה עם אתנול 75% 750 μl. בדיקות resuspend RNA במים חופשיים nuclease μl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ריכוז RNA באמצעות NanoDrop. בדיקות בחנויות ב-80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> rRNA חיסור עם arRNA biotinylated. הערה: בשלב זה מעסיק arRNA biotinylated להכליא לrRNA במדגם RNA המוחלט. כלאי rRNA-arRNA נתפסו על ידי חרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. ההליך מבוסס על הפרוטוקול מתואר בהתייחסות 13 עם שינויים קלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1 N NaOH, chlor נתרן 20XIDE-ציטרט (SSC) ו-X SSC 1 עם פוראמיד 20%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי 1 RNA מיקרוגרם כלל עם 16S חיידקים ובדיקות 23s (0.75 מיקרוגרם כל אחד), 18S יתושים ובדיקות -28 (0.75 מיקרוגרם כל אחד), מעכב 1 μl RNase, 2.5 μl 20X SSC חיץ, 10 פוראמיד 100% μl בצינור PCR 200 μl , מי nuclease ללא תוספת ל 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצינור בתגובת Cycler ולדגור תרמית על 70 המעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפתוח מבנה משני וכבשו עד 25 מעלות צלזיוס באמצעות 5 ° C מרווחים לכל 1 דקות C ° לאפשר ההכלאה של בדיקות rRNA וarRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת rRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 300 חרוזים מצופים streptavidin μl לתוך צינור מ&quot;ל 1.7. הנח את השפופרת על מדף הפרדה מגנטית, כדי לשתק את החרוזים. הסרת supernatant. Resuspend את החרוזים ב300 μl של 0.1N NaOH ומייליםx כן. הנח את הצינור בחזרה למדף המגנטי ופיפטה את supernatant. Resuspend את החרוזים ב300 μl של 1X SSC, מערבב היטב, לשתק את החרוזים ופיפטה את supernatant. חזור על לשטוף עם 300 μl זמן 1X SSC אחד יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 3 aliquots של חרוזים, 100 μl כל אחד, בצינורות 1.7 מ&quot;ל. הנח את הצינור על המתלה המגנטית, ולהסיר את supernatant ידי pipetting. הערה: aliquots של חרוזים משמשים ל3 סיבובים של לכידת כלאי biotinylated rRNA-arRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 1X SSC μl עם פוראמיד 20% לתגובת ההכלאה 50 μl. להעביר את התגובה לתוך צינור aliquot החרוז הראשון, ומערבב היטב. לדגור על RT למשך 10 דקות על מנת לאפשר למכוניות ההיברידיות biotinylated חללית-rRNA שנכבשו בידי חרוזי streptavidin. פליק הצינור כל 2 דקות כדי לערבב במהלך הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצינור על המתלה המגנטית, כדי לשתק את החרוזים, להעביר את supernatant לaliq 2uot של חרוזים, מערבב היטב והדגירה כאמורה לעיל. לנהל לכידה השלישית על ידי העברת supernatant לתוך הצינור השלישי של חרוזים. לערבב ודגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant הלא rRNA לתוך צינור חדש וטיהור התנהלות באמצעות ערכת MinElute RNeasy להסיר פוראמיד בעקבות ההוראות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את יעילות דלדול rRNA באמצעות ערכת Agilent RNA 6000 פיקו שבב על Bioanalyzer (איור 4). </li></ol></li></ol></li></ol> הערה: דוגמאות rRNA המדולדלות RNA כפופות לmRNA הגברה במידת הצורך 8.

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance.">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181 (2012).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system.">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li><li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota.">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447 (2011).</li><li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome.">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527 (2008).</li><li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities.">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042 (2008).</li><li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome.">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li><li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+day/night+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre.">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li><li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities.">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li><li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+mRNA+from+soil.">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics.">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method.">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li><li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics.">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767 (2011).</li><li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA.">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li><li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+(L.)+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut.">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li><li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts.">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li><li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses:+past+and+future+trends.">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li><li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies.">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401 (2009).</li><li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity.">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

קהילת חיידקים מורכבת מתגוררת במערכת האקולוגית בטן יתוש 14,16,17. Metatranscriptomic רצף (RNA-seq) יכול לחשוף מידע פונקציונלי תלוי בהקשר של חקירה כל חיידקי transcriptome 4,18. מבחינה טכנית, העשרת Oligo-ד (ט) בתיווך של mRNA פרוקריוטי אינה ישימה בשל העדר (A) זנבות של השליחים פולי היציבים. ל?...

טכנולוגיית הדור הבא של רצף התקדמה מחקר metagenomics מאוד על ידי המאפשר להעריך את ההרכב הטקסונומי והפונקציונלי גנטיים של מכלול של חיידקים. RNA-רצף (RNA-Seq) 1 יכול לעקוף שיטות תרבות מבוססת לחקור metatranscriptomes מיקרוביאלי ב2-5 הקשרים שונים. מכשול עיקרי לחיידקי RNA-seq הוא הקושי בהעשרה-mRNA, כמין mRNA פרוקריוטים אינו polyadenylated ביציבות. לכן, העשרת Oligo ד (ט) בתיווך שליח אינה ישימה. הסרת rRNA שפע היא גישה חלופית להעשרה-mRNA. ערכות מסחריות rRNA דלדול, כגון ערכת Microexpress קטריאלי mRNA העשרה (Ambion), RiboMinus transcriptome בידוד קיט (חיידקים) (חי טכנולוגיות), ורק mRNA-ערכה פרוקריוטים mRNA בידוד (Epicentre) שמעדיפים מדרדרת rRNA עם exonuclease, היו בשימוש להסרת rRNA 6-8. עם זאת, בדיקות ללכוד בMicroexpressאו RiboMinus טוב להסרת rRNA הידוע מחיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים טיפוסיים (ראה מפרטים של יצרנים), אבל פחות מתאים עם rRNA מחיידקים לא ידועים. כתוצאה מכך, ההסרה עשויה להיות פחות יעילה עבור 8-10 דגימות metagenomic. חוץ מזה, נאמנות שפע mRNA הייתה מוטלת בספק, כאשר טיפול exonuclease יושם 11. בסך הכל, דלדול rRNA חיסור מבוסס היה פחות מוטה ויעיל יותר בהעשרת mRNA בהגדרות metagenomic 10-13. בטן היתוש להכיל חיידקי קהילה דינמית 14. אנו מעוניינים באפיון הפונקציה של microbiome בטן היתוש באמצעות RNA-Seq. במדגם RNA המבודד מאומץ היתושים, שני RNA היתושים וחיידקים הם הווה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הותאם לשימוש בדיקות rRNA ספציפיות קהילתיות יעילות כדי לרוקן rRNA יתושים וחיידקים על ידי הכלאת חיסור. MRNA כתוצאהדגימות מועשרות מתאימות לRNA-Seq. העבודה הכוללת מתוארת באיור 1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Meta-G-Nome 				DNA isolation kit</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>MGN0910</td>
 <td>Metagenomic 				DNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TriPure </td>
 <td>Roche</td>
 <td>11667165001</td>
 <td>Mdetagenomic 				RNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEGAscript 				T7 kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1334</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA probes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaseZap</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9780</td>
 <td>RNase 				free working area </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-16-UTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11388908910</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-11-CTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4739205001</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin 				magnetic beads</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1420S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic 				separation rack</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1506S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy 				mini kit</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>74104</td>
 <td>Purification 				of subtracted RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free 				DNase Set</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>79254</td>
 <td>Removal 				DNA contamination </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 				RNA 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Gen 				PRO200 				Homogenizer</td>
 <td>PRO 				Scientific</td>
 <td>01-01200</td>
 <td>Mosquito 				gut tissue homogenization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 				1000 Spectrophotometer</td>
 <td>Thermo 				Scientific</td>
 <td></td>
 <td>DNA 				&amp; RNA quantitation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2100 				Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>G2940CA</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq

בטן היתוש להכיל קהילות מיקרוביאלי דינמיות על פני שלבים שונים של מחזור החיים של החרק. אפיון של היכולות ותפקודים הגנטיים של קהילת המעיים יספק תובנה לתוך ההשפעות של חיידקי מעיים על תכונות חי יתושים. Metagenomic RNA-Seq הפך כלי חשוב לנתח transcriptomes מחיידקים המצויים בקהילת חיידקים שונים. RNA השליח בדרך כלל מהווה רק 1-3% מכלל רנ&quot;א, בעוד rRNA מהווה כ 90%. זה מאתגר להעשרת RNA שליח ממדגם רנ&quot;א מיקרוביאלי metagenomic כי מיני mRNA פרוקריוטים רוב חסרים (A) זנבות פולי יציבים. זה מונע בידוד Oligo ד (ט) בתיווך-mRNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שמעסיק מדגם נגזר rRNA ללכוד בדיקות כדי להסיר rRNA ממדגם RNA סך metagenomic. כדי להתחיל, גם יתושים וברי rRNA של חיידקים קטנים וגדולים למקטע הם מוגברים מדגימת DNA קהילת metagenomic. ואז, commuבדיקות nity ספציפיות biotinylated antisense RNA ריבוזומלי מסונתזות במבחנה באמצעות RNA פולימראז T7. בדיקות rRNA biotinylated הם הכלאה לרנ&quot;א בסך הכל. הכלאיים נתפסו על ידי חרוזי streptavidin מצופים והוצאו מכלל רנ&quot;א. פרוטוקול חיסור מבוסס ביעילות מסיר גם יתושים וrRNA של חיידקים מדגימת RNA המוחלטת. המדגם המועשר mRNA עובר עיבוד נוסף להגברת RNA ו-RNA-Seq.

הפרוטוקול כולל שלושה חלקים: (1) הכנת תבניות DNA metagenomic לrRNA PCR, (2) יצירת בדיקות rRNA לכידה ספציפיות לדוגמה: (3) דלדול של rRNA מרנ&quot;א כלל על ידי הכלאת חיסור. בידוד של metagenomic DNA ו-RNA באיכות הגבוהה הוא חיוני לכל התהליך. פרוטוקול בידוד דנ&quot;א Meta-G-נום השונה מניב דנ&quot;א באיכות גבוהה metagen...

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

פרוטוקול ריבוזומלי רנ&quot;א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

depletion-of-ribosomal-rna-for-mosquito-gut-metagenomic-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

19.5K Views.  New Mexico State University. פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

Video: Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...