We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. תרבית תאי C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור myoblasts העכבר C2C12 בצלחת 100 מ&quot;מ במדיום הגידול (המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)) בתוספת 20% בסרום שור עוברית, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. אפשר תאי passaged C2C12 להיות כ 50 - 60% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ&quot;ל בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA כדי לנתק את התאים. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 3 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיום הגידול 3 מ&quot;ל. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. הוסף 1 מ&quot;ל של תאים מושעה לצלחת 100 מ&quot;מ חדש לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 2. Transfection Cell C2C12 / התמרה בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection פלסמיד C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני transfection, עמ &#39;7.0 מאוחר x 10 5 C2C12 תאים לתוך אחד טוב של צלחת שש היטב עבור כל transfection. הערה: זה מוביל 50 - 60% מפגש ידי בזמן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (GFP-CUG5 או GFP-CUG200) לתוך 200 μl מחומם מראש בינוני חופשי בסרום ו מערבולת בקצרה. הוסף מגיב transfection 6 μl למדיום ומערבבים מיד למשך 30 שניות בעזרת מערבולת. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת של תאי C2C12 2.5 מ&quot;ל מדיה סרום ללא צמיחה. מוסיפים את תערובת transfection לתאים לאחר דגירה. החזר את הצלחות על 5% CO 2, 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים ב תערובת transfection / מדיה סרום ללא צמיחה עבור 4 שעות או עד הלילה. שינוי תקשורת חזרה תקשורת הצמיחה למחרת או כאשר cytotoxicity ניכר. הערה: Cytotoxicity נבחנת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של ceLLS. בוחן את שינויי מורפולוגיה תאי ניתוק תא. כל עוד אין cytotoxicity גלויה, דגירה לילה במדיה סרום ללא צמיחה משפרת transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים 48 שעות לאחר transfection ידי הוספת 1.2 - G418 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עבור ~ 10 ימים עד שהתרבות מלאה (טרנספקציה ללא פלסמידים) אין תאים חיים. שנה את התקשורת כל יומיים עם התקשורת צמיחה בתוספת G418. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים G418 עמידים במדיום הגידול ו 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך הניסויים הבאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת רטרו-וירוס תמרת retroviral C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבות HEK 293 על ידי השלמת גלוקוז DMEM גבוהה עם 10% בסרום שור עוברית, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 24 שעות לפני transfection, צלחת 4.0 x 10 6 ecotropic HEK תאי אריזת 293 מבוססים בבית (מפגש 80% ב transfection) 100 מ&quot;מ צלחת גתרבית תאים בינוני ontaining. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 15 מיקרוגרם DNA פלסמיד (pMSCV-Puro או pMSCV-Celf1Flag-Puro) ב 1 בינוני מ&quot;ל סרום ללא צמיחה. בקצרה וורטקס. הוסף 30 מגיבים transfection μl משלבים 2.2.2 לתוך צינור מדיום גידול DNA / סרום ללא, ומערבבים בעזרת מערבולת היטב. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף dropwise תערובת transfection אל HEK ecotropic מבוסס 293 תאי האריזה. מערבולת בעדינות את הצלחות ולהחזיר אותם בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, לשנות את התקשורת עד 10 מיליליטר מחומם מראש מדיום גידול טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר supernatant (המכיל רטרו-וירוס) 48 שעות לאחר transfection בעזרת פיפטה ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת החמה החדשה לצלחת ולהחזיר אותו אל האינקובטור. שמור את supernatant על 4 מעלות צלזיוס. הערה: התקשורת מתווספת בעדינות כדי לאהוא בצד של הבאר כדי לא לשבש את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection וברכה זה עם supernatant מ 2.2.5. צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל חדש. השתמש רטרו-וירוס כדי transduce תאים C2C12 בשלב זה על ידי שתמשיך לשלב 2.2.9 או aliquot ולאחסן את supernatant ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה רטרו-וירוס מ 2.2.7 בטמפרטורת החדר, אם מניה קפוא משמש כאן. הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי C2C12 באותו היום של התמרה המכוונת במשך 30 - 40% של מפגש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ&quot;ל בטמפרטורת החדר PBS. הסר את PBS, להוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA, דגירה צלחת 2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO עבור 3 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מ&quot;ל med צמיחהium. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף 8.0 x 10 5 C2C12 תאים לצלחת 60 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל רטרו-וירוס להדביק צלחת אחת 60 מ&quot;מ של תאים בתקשורת צמיחה 3 מ&quot;ל. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם 3 מ&quot;ל התקשורת טריים בתוספת אנטיביוטיקה הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מ&quot;ל) 48 שעות לאחר ההדבקה. החלף 3 מ&quot;ל בינוני עם אנטיביוטיקה כל יום במשך ~ 5 ימים עד שהתרבות מלאה C2C12 untransduced גוועת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Lentivirus ו התמר lentiviral C2C12 הערה: בצע את כל ההליכים הקשורים lentivirus ב בטיחות ביולוגית רמה 2 ארון ולפעול בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגיות. פסולת נוזלית בעלת הנגיף יש לחטא לפני סילוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 4.0 x 10 6 293T תאים בצלחת 100 מ&quot;מ (~ 80 מפגש% ביום של transfection) עם תרבית תאים בינוניים HEK 293 (גלוקוז DMEM גבוהה, בתוספת 10% עובריתבסרום שור, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין) 24 שעות לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר. מערבבים את וקטורים אריזה lentiviral (4 מיקרוגרם pMD2.G ו -6 מיקרוגרם psPAX2) יחד עם וקטור העברת 8 מיקרוגרם lentiviral (Celf1 shRNA או מקושקשות shRNA שליטה) ב 1 בינוני מ&quot;ל תרבית תאים חופשית בסרום. בקצרה וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 36 μl מגיב transfection מחומם מראש ל הצינור DNA / DMEM ומערבבים היטב על ידי מערבולת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי 293T מן החממה ולהוסיף לתערובת transfection לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, להחליף את תערובת transfection עם המדיום תרבות טרי 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את lentivirus supernatant המכיל 48 שעות לאחר transfection ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מדיה חמה חדשה מיליליטר לצלחת ולהחזירוחממה. אחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection, ולשלב אותו עם supernatant מ 2.3.5. בקצרה צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור 50 מ&quot;ל צנטריפוגות טריים. אם אתה משתמש וירוס טרי, המשך לשלב 2.3.9. לשימוש עתידי, חנות וירוס המכילים supernatant ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר מהווירוס 2.3.7 בטמפרטורת החדר לפני השימוש, אם מניה קפוא משמש. הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי C2C12-CUG200 (המתקבלים בסעיף 2.1) כמתואר 2.2.9 באותו היום של תמרה. הערה: כוון 30 - 40% של מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל וירוס להדביק צלחת 60 מ&quot;מ של C2C12-CUG200 ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם תקשורת טריה בתוספת אנטיביוטיקת הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר) 72 שעות לאחר תמרה.רענן היומיום תקשורת והתרבות עם אנטיביוטיקת הבחירה ~ 5 ימים עד שכל התרבות מלאת C2C12-CUG200 untransduced גוועת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כתם מערבי לאמת מציאת Celf1 בתאי transfected GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. התמיינות תאים C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 x 10 6 תאים אחד טוב של צלחת 6-היטב 2.5 מיליליטר תקשורת צמיחת 24 שעות לפני תחילת הבידול. הערה: צפיפות הציפוי עשויה להיות מותאמת כך מפגש מלא הוא הגיע ב -24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים ומחוברות עם PBS ולהוסיף 2.5 מ&quot;ל של מדיום בידול נמוכה בסרום (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 2% נסיוב סוס, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו -1 מיקרומטר אינסולין) . החלף את המדיום כל יומיים. הערה: שמור אינסולין המניות קפוא ולהוסיף אותו בתקשורת בכל שינוי בינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התמיינות C2C12, לאסוף דגימות עבור קוואןtitative RT-PCR (ראה סעיף 4) בנקודות הזמן הבאות: יום 0, 1, 2, 4, ו -6 תהליך ההתרבות עבור immunostaining ביום 6 - 8 (ראה סעיף 5). </li></ol> בידוד RNA 4. וכמותי RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פרוטוקול של היצרן עבור בידוד RNA. לאחר בידוד, resuspend גלולה רנ&quot;א 30 מים μl RNase ללא ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים. הערה: הדוגמות תהיינה רשאיות להמשיך כמוני RT-PCR או יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת qPCR RT עבור כמותי RT-PCR 10 ובצע את ההוראות של היצרן. מכינים את תערובת התגובה על פי טבלה 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רְכִיב </td><td> נפח (μl) </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> מאגר התגובה 2x </td><td> 10 </td><td> 1x </tד&gt; </tr><tr><td> פריימר קדימה </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> פריימר הפוך </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> בְּדִיקָה </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> הפוך transcriptase &amp; RNase אינהיביטור </td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / ml </td></tr><tr><td> תבנית </td><td> 1 </td><td> 100 RNA סך ng </td></tr><tr><td> מים חינם RNase </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> מערבבים סה&quot;כ </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. כמותי RT-PCR מיקס מאסטר הכנה <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובת 20 μl RT-qPCR באמצעות טבלה 2 פרופיל תרמית. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צעד שעתוק הפוך </td><td> 30 דקות, 48 ° C </td></tr><tr><td> פולימר DNAאיון ASE הפעלה / הפוך transcriptase </td><td> 10 דקות, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 מחזורים </td><td> 15 שניות, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 דק &#39;, 60 ° C </td></tr></tbody></table> טבלה 2. כמותי פרופיל תרמי RT-PCR 5. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התרבות monolayer ב 2.5 מ&quot;ל מוכן טרי 4% paraformaldehyde / PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize דגימות 2.5 מ&quot;ל 0.1% Triton X-100 / PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות בתא humidified. חסום את דגימות 2.5 מ&quot;ל חסימת חיץ (0.1% nonionic פעילי שטח / PBS, 10% נסיוב עז רגיל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל חסימת חיץ ולהחיל 800 μl נוגדן ראשוני נגד שרשרת שרירן כבד מדולל חסימת חיץ (1: 100). מדגירים לילה בתא humidified בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 times (10 דקות כל אחד) עם חיץ 2.5 מ&quot;ל לשטוף (0.1% polysorbate 20 / PBS) ביום 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיץ לשטוף ולהחיל 800 נוגדנים משני μl (IgG אנטי העכבר העז, 1: 500 בדילול מלא PBS). דגירה בתא humidified בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים (10 דקות כל אחד) עם חיץ לשטוף 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 800 μl DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בדילול מלא O H 2 deionized מזוקקים) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חיץ 2.5 מ&quot;ל לשטוף שוב למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את חיץ כביסה 2.5 מ&quot;ל PBS ולהשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ללכוד תמונות. </li></ol>

<ol>
	<li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).</li><li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies.">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li><li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy:+expansion+of+a+trinucleotide+(CTG)+repeat+at+the+3'+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member.">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li><li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1:+Back+to+the+basics.">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li><li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing.">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li><li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation.">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li><li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue,+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression.">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li><li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity.">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li><li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation.">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li><li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+(DM)+mutation+in+a+cell+culture+model.">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li><li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(CTG)n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line:+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy.">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li><li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy.">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li><li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in muscle biology. 52, (1997).</li><li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1.">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li><li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1.">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שורת תאים C2C12 נוצל בעבר כמודל ללמוד myogenesis 11-14. תאים אלה לשמור על המראה כמו-פיברובלסטים, להתרבות במהירות מדיה המכילה 20% בסרום שור העובר ולבדל בקלות מדיה המכילה 2% נסיוב סוס 15. הצמיחה וההתבדלות מהר הם מאפייני יתרון מודל תא myogenesis. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש פל?...

ניוון Myotonic (DM) הוא מחלה דומיננטית אוטוזומלית המשפיעה מערכות מרובות, בעיקר שרירי לב שלד 1. ישנם שני תת סוגים של המחלה הזאת, DM1 ו DM2. DM1 נפוץ יותר ויש לו ביטוי חמור יותר DM2 2. המוטציה הגנטית הבסיסית DM1 היא רחבה של חזרות שלישיית CUG הממוקמות באזור המתורגם &#39;3 (UTR) של גן החלבון קינאז DM (DMPK) 3. מספר חוזרי CUG אצל אנשים לא מעושה משתנה בין 5 ל 37. לעומת זאת, היא מגדילה ליותר מ -50, ולפעמים עד אלף בחולי DM1 4. כתוצאה מכך, חלבונים קושרי RNA, כגון muscleblind דמוי 1 (MBNL1), CUGBP, ו Elav-כמו משפחה 1 (Celf1), הם misregulated. בשל התפיסה על חזרות CUG המורחבות, MBNL1 מאבד את יכולתו לווסת שחבור חלופי 5. Celf1, ומצד שני, הוא למעלה מוסדר 6,7. התבטאות יתר של Celf1 קשורה לאובדן שרירחולשה, אשר אינן מיוחסות אובדן תפקוד MBNL1. במודלים של בעלי חיים לדמות שינויים הקשורים DM1, ובכלל זה, הרחבת DMPK 3&#39;-UTR CUG, אובדן MBNL1, ואת יתר של Celf1, הוקמו. עם זאת, דוגמנות DM1 ב myoblasts מציעה אלטרנטיבה יעילה, במיוחד עבור לנתח הקשורות DM1 אירועים תאיים ומולקולריים. C2C12 שורת תאי myoblast בודד לראשונה מ שריר עכבר C3H נפצע בשימוש נרחב ללמוד 8,9 בידול myogenic. תאי C2C12 להתרבות במהירות בסרום שור עובר (FBS) המכיל תקשורת לעבור התמיינות בקלות כאשר FBS ייגמר. עם זאת, באמצעות מודל בידול myoblast זה מציג שני אתגרים: תאי C2C12 הם בדרך כלל עמידים בפני transfection גן / תמרה ויראלית; ו שינויים קלים טיפול תא הליך בידול יכולים להוביל לשינויים חדים בהשקעות myotube. המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמש myoblasts C2C12 כמו acell מודל פתח פרוטוקולים להעברת גנים ביעילות על ידי transfection פלסמיד, תמרת retroviral, תמרת lentiviral לתוך תא C2C12 קו 10. בסרטון, אנחנו מדגימים את הנהלים אופטימיזציה עבור transfecting / transducing C2C12 תאים ושמירה על עקביות בידול בהקמת מודלים myoblast DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Insulin from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>for differentiation medium</td></tr><tr><td>equine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>for differentiation medium</td></tr><tr><td>FuGENE&amp;nbsp;HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311&amp;nbsp;</td><td>for transfection</td></tr><tr><td>G418 sulfate&amp;nbsp;</td><td>Gold Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>for drug resistant selection</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>for drug resistant selection</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>primary Ab for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secondary Ab for immunostaining</td></tr><tr><td>One step qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>for RNA isolation</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Antibody (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primary Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin Antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>goat polyclonal IgG for loading control</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>cells for retrovirus preparation</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>house-constructed</td><td>not available</td><td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>gift from Didier Trono</td><td>not available</td><td>for lentivirus preparation</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>gift from Didier Trono</td><td>not available</td><td>for lentivirus preparation</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>gift from M.S. Mahadevan</td><td>not available</td><td>details in reference 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>gift from M.S. Mahadevan</td><td>not available</td><td>details in reference 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TWEEN&amp;nbsp;20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

Myotonic ניוון 1 (DM1) היא צורה נפוצה של ניוון שרירים. למרות במודלים של בעלי חיים כמה הוקמו DM1, מודלי תא myoblast הם עדיין חשובים משום שהם מציעים אלטרנטיבה הסלולר ביותר ללימוד אירועים תאיים ומולקולריים. למרות תאים myoblast C2C12 כבר בשימוש נרחב ללמוד myogenesis, עמידות transfection הגן, או התמרה ויראלית, מעכבת מחקר בתאי C2C12. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה הכולל תחזוקה יומית, נהלי transfection התמר להציג גנים לתוך myoblasts C2C12 ואת האינדוקציה של בידול myocyte. ביחד, נהלים אלה לאפשר יעילות transfection / תמרה הטובות ביותר, כמו גם תוצאות בידול עקביות. הפרוטוקול המתואר בהקמת מודלי תא myoblast DM1 ירוויח לחקר ניוון myotonic, כמו גם מחלות שרירים אחרות.

תאי C2C12 היו transfected עם GFP-CUG5 או GFP-CUG200. לאחר בחירת התרופה-התנגדות, ברכות יציבות הוקמו, אשר ניתן דמיינו ידי ביטוי של GFP (איור 1 א). היווצרות Myotube ב myoblasts הבדיל זוהה על ידי שרירן שרשרת כבדה immunostaining 10 (איור 1 ב). כימות של היווצרות myotube הראו ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Views.  University of Houston.  בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte. 

Video: Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Bioengineering

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Developmental Biology

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Neuroscience

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in C2C12 myoblasts can be applied to study the role of these proteins in skeletal muscle development. Here, we describe a protocol to deplete the ECM protein ADAMTSL2 as an example, using small-hairpin (sh) RNA in C2C12 cells. Following transfection of shRNA plasmids, stable cells were batch-selected using puromycin. We further describe the maintenance of these cell lines and the phenotypic analysis via mRNA expression, protein expression, and C2C12 differentiation. The advantages of the method are the relatively fast generation of stable C2C12 knockdown cells and the reliable differentiation of C2C12 cells into multinucleated myotubes upon depletion of serum in the cell culture medium. Differentiation of C2C12 cells can be monitored by bright field microscopy and by measuring the expression levels of canonical marker genes, such as MyoD, myogenin, or myosin heavy chain (MyHC) indicating the progression of C2C12 myoblast differentiation into myotubes. In contrast to the transient knockdown of genes with small-interfering (si) RNA, genes that are expressed later during C2C12 differentiation or during myotube maturation can be targeted more efficiently by generating C2C12 cells that stably express shRNA. Limitations of the method are a variability in the knockdown efficiencies, depending on the specific shRNA that may be overcome by using gene knockout strategies based on CRISPR/Cas9, as well as potential off-target effects of the shRNA that should be considered.

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin shRNA

We provide a protocol to stably knock down genes encoding extracellular matrix (ECM) proteins in C2C12 myoblasts using small-hairpin (sh) RNA. Targeting ADAMTSL2 as an example, we describe the methods for the validation of the knockdown efficiency on the mRNA, protein, and cellular level during C2C12 myoblast to myotube differentiation.

יציבה מנוק של גנים הקידוד מיקתאי מטריקס חלבונים ב C2C12 Myאובלסט התא באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in ...

Genetics

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...