This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

הערה: myoblasts מספיק תשואות עכבר אחת עבור כשני 35 מנות מ&quot;מ או שתי מנות חי-הדמיה, כך תוכנית Mattings, לנתיחה, וציפוי (שלב 2.6) בהתאם. מאז myoblasts מבודד באמצעות centrifugations רציפי preplating, הפרוטוקול צריך להיעשות בקבוצות של 5 - 10 חיות. כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה החי מולקולרית Instituto de Medicina ו et אוניברסיטת פייר ומארי קירי 1. Dissection של עכברי ילודי שרירים הינד גפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל פתרונות מראש (לוח חומרים) לעקר ידי סינון (0.22 מיקרומטר מסנן). ודא שכל התקשורת על 37 מעלות צלזיוס לפני בנוסף התאים, למעט הניסוחים המכילים מטריקס קרום במרתף (למשל, Matrigel). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את החומר דיסקציה (אחד לכל אחד: מספריים מעוקלים, מספריים ישר, מלקחיים קבועים,ו-טיפ נאה מלקחיים) וספסל העבודה על ידי מנגב אותם עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת פטרי 100 מ&quot;מ עם 5 מ&quot;ל של בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) לאיסוף שריר ולשמור על הקרח עד צעד זהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף P6 - עכברים P8 עם מספריים ישר לעקר את העור עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בעור הגב ולמשוך אותו בעדינות לכיוון הגפיים האחוריות עד להסרתו, חושף לגמרי את שרירי הגפיים האחוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להסיר רקמות שומן מבלי לפגוע בשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את שרירי הגפיים אחוריים הגבה, לשמור על האיבר נמתח לכופף את הכף לחשוף את הגידים בעקב. השתמש במספריים מעוגלים שריר נפרד מן העצם, החל גידים, על ידי הזזה בעדינות חיתוך כלפי מעלה. ובלו השרירים ומניחים אותם DPBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הארבעה על ידי צובט את השריר עם מלקחיים בסדר-קצה החיתוך סביב אותו מבלי לפגוע עצם הירך או מפרק הברך.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לנתח כל בעלי החיים, המשך ברדס תרבית תאי זרימה למינרית סטרילי, שבו כל השלבים הבאים יש לבצע. </li></ol> בידוד myoblast 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר העודף DPBS. לרכך את הרקמה במספריים מעוגלים מעוקרים כדי להשיג מסה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הרקמות הטחונות ב צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מיליליטר באמצעות 5 מיליליטר של תערובת עיכול דגירה אותו עם תסיסה על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי הוספת 6 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה צנטריפוגות ההשעיה למשך 5 דקות ב 75 XG כדי גלולה הרקמה הנותרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לאסוף את supernatant. ודא שלא לאסוף פסולת רקמות. צנטריפוגה זה ב 350 XG במשך 5 דקות; resuspend את זה ב 5 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. הוסף 25 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה preplate אותו בצלחת 150 מ&quot;מ של 4 שעות בתוך חממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 &lt;תת /&gt;) כדי לאפשר fibroblasts לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד preplating, מנות מעיילות עם 500 μL של מטריקס קרום במרתף מדולל 1: 100 ב IMDM הקר למשך 1 שעות ב RT. שטפי פעם עם DPBS ואת צלחת התאים מיד (שלב 2.8) או לעזוב עם מדיום הגידול עד ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי preplating, לאסוף את supernatant ו צנטריפוגות זה ב XG 350 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend זה במדיום הגידול לספור את התאים על hemocytometer. התאם את עוצמת הקול כך בין 150,000 ו 250,000 תאים מצופים לכל צלחת מטריקס מצופה קרום במרתף. שמור את התאים בתוך תרבית תאי חממה. </li></ol> 3. בידול Myofiber הערה: לאחר 3 ד, התאים צריכים להתחיל פתיל והצורה myotubes בסביבות 70% confluency (איור 1B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, transfect התאים, אם תרצה בכך, עם siRNA או DNA של עניין. אם התאים אינם להיות transfected, לשנות ישירות בינוני בידול סקיp לשלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect עם ריאגנטים transfection בעקבות הוראות היצרן. דגירה התאים למשך 5 שעות עם מתחמי siRNA שומנים בדם (20 ננומטר + 1 μL של מגיב) או מתחמי השומנים-DNA (1 מיקרוגרם + 1 μL של מגיב). מטב את ריכוזי siRNA ו- DNA במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעם עם בינוני בידול ולאחר מכן לעבור בינוני בידול חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לדלל את מטריקס קרום במרתף 1: 2 במדיום בידול קר כקרח. הסר את המדיום הקיים ולהוסיף 200 μL של מטריקס קר כקרח על כל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בתוך תרבית תאי חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף המדיום בידול עם Agrin (100 ng / mL) ובזהירות מוסיפים 2 מ&quot;ל לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשנות מחצית בינונית כל 2 ד, תמיד להשלים עם Agrin לריכוז סופי של 100 ng / μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בידול כדאיות התא. בהתאם למגוון גורמים (כמו FBS ו גhicken לחלץ עובר מקורות), התאים עלולים לקחת בין 5 - 10 בידול ד להגיע התבגרות מלאה (איור 2). </li></ol> 4. Immunostaining במנות זכוכית תחתונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunostaining, בכל עת-נקודת עניין, לשטוף את התאים פעם עם DPBS ולתקן אותן עם 4% PFA ב RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעמיים עם DPBS. בשלב זה, התאים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize אותם עם 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעמיים עם PBS ולחסום עם חסימת פתרון 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותם עם נוגדן ראשוני מדולל חסימת פתרון O / N ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם DPBS במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותם עם נוגדנים משני 0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DAPI עבור 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם DPBS במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של המדיום גובר והמשך הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השימוש בפרוטוקול זה לגידול של myoblasts העיקרי מוליד נישה מיוחדת שבגדול המטפחת את התפתחות myofibers. זה נובע בחלקו סוגי תאים אחרים נוכחים גם במספרים קטנים מאוד. איזון בין ריכוז myoblast וטוהר התרבות חייב להיות מושגת. תרבית תאים טובה גם תלויה באיכות של המוצרים המשמשים לגיבוש הבינוני. הכל מוצרים שמקורם מן החי צריך להיבדק ביסודיות. מניסיוננו, תנאי העיכול צריכים גם להיות במעקב. כרגיל עבור תרבויות עיקריות, השתנות ניסיוני יכולה להיות גבוהה יותר מאשר במחקרים עם סיבים מבודדים או myoblasts הונצח. השתנות זו יכולה להצטמצם על ידי סטנדרטיזציה של רכיבים בינוני ועיכול, גיל עכברים וגודל, ואת נקודות זמן מניפולציה התרבות ואיסוף התוצאות. עם זאת, היתרון של בוחן בזמן אמת את המנגנונים המורכביםנחוץ להתפתחות myofiber עולה על חסרון ההשתנות מאוד. פרוטוקול זה מקנה את היתרונות של גישות במבחנה מבלי להתפשר התמיינות תאים. Myofibers להבשיל עד השלשות נוצרות התכווצויות הם מצמידים את ניצוצות סידן. פלטים פונקציונליים אלה ניתן לגשת בתנאי ניסוי שונים. יתר על כן, ייתכנו שינויים טכניים רבים שנעשו בפרוטוקול. Myoblasts ניתן לקצור מעכברים בילוד עם מוטציות של עניין הנוגע להתפתחות השריר. תאים יכולים להיות lysed לאנליזה ביוכימית בנקודות זמן בידול שונות. האינדיקטורים סידן ניתן להוסיף לתרבות לעקוב הדינמיקה שלה. בונה optogenetic ניתן להשתמש כדי לאכוף מסלולי איתות מסוים או כדי לגרום לתגובות מקומיות ספציפיות. לבסוף, myofibers ניתן cocultured עם סוגי תאים אחרים כדי לחקור אינטראקציות שלהם.

שרירי שלד מלחינים עד 40% ממשקל הגוף האנושי 1. הפרעות קשורות שרירים מייצגות בריאות עצומה ניטל כלכלי 2. איך זה מאוד רקמות מורכבות מאורגנות נוצרה, נשמרו, מחדש מהווה שדה מחקר מקיף ומבוסס. בהתאם העניין המדעי הספציפי, הגישה המתאימה ביותר יכולה לנוע בין תרבויות myotube פשוטות אל מסובך במודלי vivo 3 - 6. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת במבחנה המאפשר ניטור של myogenesis באמצעות הדמיה חיה immunofluorescence. לעומת גישות מסורתיות, מערכת זו מציעה תובנה מלא ודינמי מאוד לתהליך העכבר myogenic. תאים ניתן בעקבות משלב myoblast אל myofiber הבוגר, multinucleated מוצג שלשות משוכלות וגרעינים היקפיים 7. רמת התבגרות זה יכוללהיות מושגת באמצעות ציוד תרבית תאים רגילים, ללא צורך למיכשור גירוי או מכני מורכב. למרות שחלק מוצלח במערכות חוץ גופייה דווח 8,9, למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול בלבד שהניב myofibers עכבר בוגר עם T-tubules לזווג transversally עם sarcoplasmic הרטיקולום (SR). לפיכך, מערכת במבחנה זה יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של היווצרות שלישייה, שעדיין לא ידוע ולא מובנים 10. יתרון נוסף של שימוש במערכת זו הוא הזמינות של משאבי עכבר במיקוד תוקף, כגון נוגדנים, סמים וכלי RNAi. הפרוטוקול פשוט יחסית ואינו דורש צעדים מדוקדקים, מניפולציה מיומנת, או ציוד יקר ומסור. Myofibers התבגר להתחיל להופיע לאחר 5 ד של בידול תרבות 7, מוצג contractility יחד עם ניצוצות סידן (נתונים שלא פורסמו). בשבוע אחד, הפיתוח השונהבשלבים אל אחד התאים המורכבים ביותר בגוף היונק ניתן ללמוד בשילוב עם מגוון רחב של מבחני חוץ גופייה.

<table><tbody><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase&amp;nbsp;type V</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>C9263</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Glutamax supplemented</td><td>Gibco</td><td>31980022</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth reduced factor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be &amp;lt;1.5</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>MP biomedical</td><td>2850145</td><td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td></tr><tr><td>Recombinant rat agrin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>550-AG-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>11581831</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>used to transfect siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338-100</td><td>used to transfect DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668030</td><td>used to transfect siRNA plus DNA</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td><td>Science Services GmbH</td><td>E15710</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 200 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions and Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Mix</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 5 mg/mL collagenase&lt;br/&gt; 3.5 mg/mL dispase&lt;br/&gt; sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dissection Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% Penicillin/Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Growth Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 20% FBS&lt;br/&gt; 1% Chicken Embryo Extract&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Differentiation Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 2% Horse Serum&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 10% Goat Serum&lt;br/&gt; 5% BSA&lt;br/&gt; add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

שרירי השלד מורכבים myofibers, התאים הגדולים בגופם של יונקים ואחד הבודדים syncytia. כיצד מבנים מורכבים מבחינה אבולוציונית משומר שמרכיבים אותו הם התאספו נשאר תחת חקירה. התכונות גודל והפיזיולוגיות שלהם לעתים קרובות להגביל יישומי מניפולציה והדמיה. תרבות שורות תאים הנציחו נעשתה שימוש נרחב, אבל זה יכול רק לשכפל את השלבים המוקדמים של בידול. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר מניפולציה גנטית קלה של myofibers שמקורם myoblasts עכבר העיקרי. לאחר שבוע של בידול, את myofibers להציג התכווצות, מיושר סרקומר ואת שלשות, וכן גרעיני פריפריה. תהליך ההתמיינות כולו ניתן ואחריו הדמיה או immunofluorescence חיים. מערכת זו משלבת את היתרונות של vivo לשעבר קיימים פרוטוקולים במבחנה. האפשרות של transfection קל ויעיל כמו גםההקלות של גישה לכל שלבי הבידול מרחיבות את היישומים האפשריים. Myofibers יכול לאחר מכן לשמש לא רק כדי לענות על שאלות בביולוגיה התפתחותית תא רלוונטיות, אלא גם כדי לשחזר פנוטיפים מחלת שריר עבור יישומים קליניים.

היקף פיתוח myofiber נקבע בעיקר על ידי טוהר הכדאיות של myoblasts המבודד. ההידבקות, ההתפשטות, ויכולת ההיתוך ניתן להשתמש כדי לגשת באופן אמפירי הפרמטרים האלה (איור 1 א &#39;, ב). בשעת ההתפשטות D2, myoblasts צריך דבק והם אמורים להציג את צורת כישורים הטיפוסית. הפצת צפוי לקרות בהרחבה בשלב זה, המוביל להיווצרות myotube ספונטנית למחרת (איור 1B). תא confluency שיהיה עליך לערוך בהם שינויים קלים. זה צריך להיות מוגבר אם myoblasts לקחת יותר מ -3 D להתרבות פתיל. זה צריך להיות ירידה אם myofibers אינו מורשה לגדול להאריך יחסית ישר עקב הצפיפות שלהם. Confluency בדרך כלל פוחתת מהמרכז אל הפריפריה של המנה, כך myofibers הטוב ביותר צריך להימצא לעבר האזורים החיצוניים. Myotubes יהיה להאריך במהירות מרובה תצוגת גרעינים מיושרים מרכזי (תרשים 1C). על ידי D5, כמה תאים להתחיל לרכוש פסים ומרגש הגרעינים שלהם לפריפריה. מספר myofibers עם מאפיינים בוגרים יגדל עם זמן, כמו גם עם עובי תא (האיור 1D). מידת הבידול ניתן להבחין עוד יותר על ידי immunofluorescence. Myofibers קבועה שלשות משוכלות נוכחי בידול D8. זה יכול להיות מאושר על ידי רכיבי הדמיה של T-tubules (DPHR) ואת SR (triadin), אשר צפויים colocalize על השלשות (איור 2). הפונקציונליות של myofibers ניתן לטפל על ידי הדמיה לחיות. מתוך בידול D3 ואילך, התאים להציג עוויתות ספונטנית. על ידי transfecting חיישן סידן (למשל., GCaMP6f 11), אפשר לצפות כי הצירים הם מצמידים עם פסגות סידן (איור 3). באמצעות מערכת זו, הצלחנו לזהות מסלול מולקולרי רומן מופר ב myopathies centronuclear ו dystrophies myotonic, ולפיכך יכולה להיות מטרת רומן עבור טיפולים מולקולריים חדשניים 7. גם אנחנו צריכים להתאים את השיטה בחקר התפתחות צומת עצב-שריר (NMJ) 12. דרך coculture עם explants בחוט השדרה של חולדה, שתיארנו תפקיד dynein במבנה NMJ 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> איור 1: שלבי ההתפתחות של תרבות myoblast. א) בשעת ההתפשטות D2, myoblasts דבק וחל מתרבה. ב) proliferation D3, confluency של 60 - 80% הגיע לסיומה, myoblasts להתחיל פיוזינג ספונטני. ג) בשעה בידול D3, myotubes המכיל גרעינים במיקום מרכזי הם השולט. D) מתוך בידול D5 ואילך (למשל, יום 8), myofibers להתחיל מפגין תלמים וגרעינים היקפי ולהתחיל להתעבות. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> איור 2: תמונה Confocal נציג של D8 Myofiber immunostain. א) Immunostaining עבור קולטן dihydropyridine (DHPR, הפאנל העליון) ואת triadin (TRDN, פאנל באמצע). כיסוי של DHPR, TRDN, וערוצי DAPI תערוכות colocalization של רכיבי השלישייה. B)<html> פרופיל עוצמת הקו הצהוב נמשך בדו א) תמונת 3D של טיוח נפח של myofibers מוכתם עבור α-actinin (ירוק) ו DAPI (כחול). רוחב בר ורשת Scale: 5 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> איור 3: הדמיה חיה של רמות הסידן Myofibers עם ספונטנית מתעוות. א) זמן לשגות מהיר (20 מסגרות ms) מיקרוסקופיה של ניצוץ סידן בתוך myofiber מתעוות. סידן אותר דרך הביטוי של GCaMP6f (Addgene פלסמיד # 40,755). כימות B) של עוצמת הקרינה לאורך זמן עבור חיישן סידן א פאנל_blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K Views.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Video: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Genetics

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biology

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Medicine

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

מדידות כיווץ בתפוקה גבוהה של סיבי שריר עכבר שלמים המשובצים בהידרוג'ל באמצעות מערכת מבוססת אופטיקה

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...