This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

הערה: myoblasts מספיק תשואות עכבר אחת עבור כשני 35 מנות מ&quot;מ או שתי מנות חי-הדמיה, כך תוכנית Mattings, לנתיחה, וציפוי (שלב 2.6) בהתאם. מאז myoblasts מבודד באמצעות centrifugations רציפי preplating, הפרוטוקול צריך להיעשות בקבוצות של 5 - 10 חיות. כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה החי מולקולרית Instituto de Medicina ו et אוניברסיטת פייר ומארי קירי 1. Dissection של עכברי ילודי שרירים הינד גפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל פתרונות מראש (לוח חומרים) לעקר ידי סינון (0.22 מיקרומטר מסנן). ודא שכל התקשורת על 37 מעלות צלזיוס לפני בנוסף התאים, למעט הניסוחים המכילים מטריקס קרום במרתף (למשל, Matrigel). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את החומר דיסקציה (אחד לכל אחד: מספריים מעוקלים, מספריים ישר, מלקחיים קבועים,ו-טיפ נאה מלקחיים) וספסל העבודה על ידי מנגב אותם עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת פטרי 100 מ&quot;מ עם 5 מ&quot;ל של בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) לאיסוף שריר ולשמור על הקרח עד צעד זהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף P6 - עכברים P8 עם מספריים ישר לעקר את העור עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בעור הגב ולמשוך אותו בעדינות לכיוון הגפיים האחוריות עד להסרתו, חושף לגמרי את שרירי הגפיים האחוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להסיר רקמות שומן מבלי לפגוע בשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את שרירי הגפיים אחוריים הגבה, לשמור על האיבר נמתח לכופף את הכף לחשוף את הגידים בעקב. השתמש במספריים מעוגלים שריר נפרד מן העצם, החל גידים, על ידי הזזה בעדינות חיתוך כלפי מעלה. ובלו השרירים ומניחים אותם DPBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הארבעה על ידי צובט את השריר עם מלקחיים בסדר-קצה החיתוך סביב אותו מבלי לפגוע עצם הירך או מפרק הברך.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לנתח כל בעלי החיים, המשך ברדס תרבית תאי זרימה למינרית סטרילי, שבו כל השלבים הבאים יש לבצע. </li></ol> בידוד myoblast 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר העודף DPBS. לרכך את הרקמה במספריים מעוגלים מעוקרים כדי להשיג מסה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הרקמות הטחונות ב צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מיליליטר באמצעות 5 מיליליטר של תערובת עיכול דגירה אותו עם תסיסה על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי הוספת 6 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה צנטריפוגות ההשעיה למשך 5 דקות ב 75 XG כדי גלולה הרקמה הנותרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לאסוף את supernatant. ודא שלא לאסוף פסולת רקמות. צנטריפוגה זה ב 350 XG במשך 5 דקות; resuspend את זה ב 5 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. הוסף 25 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה preplate אותו בצלחת 150 מ&quot;מ של 4 שעות בתוך חממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 &lt;תת /&gt;) כדי לאפשר fibroblasts לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד preplating, מנות מעיילות עם 500 μL של מטריקס קרום במרתף מדולל 1: 100 ב IMDM הקר למשך 1 שעות ב RT. שטפי פעם עם DPBS ואת צלחת התאים מיד (שלב 2.8) או לעזוב עם מדיום הגידול עד ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי preplating, לאסוף את supernatant ו צנטריפוגות זה ב XG 350 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend זה במדיום הגידול לספור את התאים על hemocytometer. התאם את עוצמת הקול כך בין 150,000 ו 250,000 תאים מצופים לכל צלחת מטריקס מצופה קרום במרתף. שמור את התאים בתוך תרבית תאי חממה. </li></ol> 3. בידול Myofiber הערה: לאחר 3 ד, התאים צריכים להתחיל פתיל והצורה myotubes בסביבות 70% confluency (איור 1B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, transfect התאים, אם תרצה בכך, עם siRNA או DNA של עניין. אם התאים אינם להיות transfected, לשנות ישירות בינוני בידול סקיp לשלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect עם ריאגנטים transfection בעקבות הוראות היצרן. דגירה התאים למשך 5 שעות עם מתחמי siRNA שומנים בדם (20 ננומטר + 1 μL של מגיב) או מתחמי השומנים-DNA (1 מיקרוגרם + 1 μL של מגיב). מטב את ריכוזי siRNA ו- DNA במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעם עם בינוני בידול ולאחר מכן לעבור בינוני בידול חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לדלל את מטריקס קרום במרתף 1: 2 במדיום בידול קר כקרח. הסר את המדיום הקיים ולהוסיף 200 μL של מטריקס קר כקרח על כל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בתוך תרבית תאי חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף המדיום בידול עם Agrin (100 ng / mL) ובזהירות מוסיפים 2 מ&quot;ל לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשנות מחצית בינונית כל 2 ד, תמיד להשלים עם Agrin לריכוז סופי של 100 ng / μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בידול כדאיות התא. בהתאם למגוון גורמים (כמו FBS ו גhicken לחלץ עובר מקורות), התאים עלולים לקחת בין 5 - 10 בידול ד להגיע התבגרות מלאה (איור 2). </li></ol> 4. Immunostaining במנות זכוכית תחתונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunostaining, בכל עת-נקודת עניין, לשטוף את התאים פעם עם DPBS ולתקן אותן עם 4% PFA ב RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעמיים עם DPBS. בשלב זה, התאים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize אותם עם 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אותם פעמיים עם PBS ולחסום עם חסימת פתרון 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותם עם נוגדן ראשוני מדולל חסימת פתרון O / N ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם DPBS במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותם עם נוגדנים משני 0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DAPI עבור 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם DPBS במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של המדיום גובר והמשך הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השימוש בפרוטוקול זה לגידול של myoblasts העיקרי מוליד נישה מיוחדת שבגדול המטפחת את התפתחות myofibers. זה נובע בחלקו סוגי תאים אחרים נוכחים גם במספרים קטנים מאוד. איזון בין ריכוז myoblast וטוהר התרבות חייב להיות מושגת. תרבית תאים טובה גם תלויה באיכות של המוצרים המשמשים לגיבוש הבינוני. הכל מוצרים שמקורם מן החי צריך להיבדק ביסודיות. מניסיוננו, תנאי העיכול צריכים גם להיות במעקב. כרגיל עבור תרבויות עיקריות, השתנות ניסיוני יכולה להיות גבוהה יותר מאשר במחקרים עם סיבים מבודדים או myoblasts הונצח. השתנות זו יכולה להצטמצם על ידי סטנדרטיזציה של רכיבים בינוני ועיכול, גיל עכברים וגודל, ואת נקודות זמן מניפולציה התרבות ואיסוף התוצאות. עם זאת, היתרון של בוחן בזמן אמת את המנגנונים המורכביםנחוץ להתפתחות myofiber עולה על חסרון ההשתנות מאוד. פרוטוקול זה מקנה את היתרונות של גישות במבחנה מבלי להתפשר התמיינות תאים. Myofibers להבשיל עד השלשות נוצרות התכווצויות הם מצמידים את ניצוצות סידן. פלטים פונקציונליים אלה ניתן לגשת בתנאי ניסוי שונים. יתר על כן, ייתכנו שינויים טכניים רבים שנעשו בפרוטוקול. Myoblasts ניתן לקצור מעכברים בילוד עם מוטציות של עניין הנוגע להתפתחות השריר. תאים יכולים להיות lysed לאנליזה ביוכימית בנקודות זמן בידול שונות. האינדיקטורים סידן ניתן להוסיף לתרבות לעקוב הדינמיקה שלה. בונה optogenetic ניתן להשתמש כדי לאכוף מסלולי איתות מסוים או כדי לגרום לתגובות מקומיות ספציפיות. לבסוף, myofibers ניתן cocultured עם סוגי תאים אחרים כדי לחקור אינטראקציות שלהם.

שרירי שלד מלחינים עד 40% ממשקל הגוף האנושי 1. הפרעות קשורות שרירים מייצגות בריאות עצומה ניטל כלכלי 2. איך זה מאוד רקמות מורכבות מאורגנות נוצרה, נשמרו, מחדש מהווה שדה מחקר מקיף ומבוסס. בהתאם העניין המדעי הספציפי, הגישה המתאימה ביותר יכולה לנוע בין תרבויות myotube פשוטות אל מסובך במודלי vivo 3 - 6. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת במבחנה המאפשר ניטור של myogenesis באמצעות הדמיה חיה immunofluorescence. לעומת גישות מסורתיות, מערכת זו מציעה תובנה מלא ודינמי מאוד לתהליך העכבר myogenic. תאים ניתן בעקבות משלב myoblast אל myofiber הבוגר, multinucleated מוצג שלשות משוכלות וגרעינים היקפיים 7. רמת התבגרות זה יכוללהיות מושגת באמצעות ציוד תרבית תאים רגילים, ללא צורך למיכשור גירוי או מכני מורכב. למרות שחלק מוצלח במערכות חוץ גופייה דווח 8,9, למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול בלבד שהניב myofibers עכבר בוגר עם T-tubules לזווג transversally עם sarcoplasmic הרטיקולום (SR). לפיכך, מערכת במבחנה זה יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של היווצרות שלישייה, שעדיין לא ידוע ולא מובנים 10. יתרון נוסף של שימוש במערכת זו הוא הזמינות של משאבי עכבר במיקוד תוקף, כגון נוגדנים, סמים וכלי RNAi. הפרוטוקול פשוט יחסית ואינו דורש צעדים מדוקדקים, מניפולציה מיומנת, או ציוד יקר ומסור. Myofibers התבגר להתחיל להופיע לאחר 5 ד של בידול תרבות 7, מוצג contractility יחד עם ניצוצות סידן (נתונים שלא פורסמו). בשבוע אחד, הפיתוח השונהבשלבים אל אחד התאים המורכבים ביותר בגוף היונק ניתן ללמוד בשילוב עם מגוון רחב של מבחני חוץ גופייה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase&#160;type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM, Glutamax supplemented</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth reduced factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be &#60;1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP biomedical</td>
			<td>2850145</td>
			<td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant rat agrin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>550-AG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>11581831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>used to transfect siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>used to transfect DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668030</td>
			<td>used to transfect siRNA plus DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>Science Services GmbH</td>
			<td>E15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 200ng/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			5 mg/ml collagenase 
			3.5 mg/ml dispase 
			sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			10% FBS 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			20% FBS 
			1% Chicken Embryo Extract 
			1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			2% Horse Serum 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			10% Goat Serum 
			5% BSA 
			add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

שרירי השלד מורכבים myofibers, התאים הגדולים בגופם של יונקים ואחד הבודדים syncytia. כיצד מבנים מורכבים מבחינה אבולוציונית משומר שמרכיבים אותו הם התאספו נשאר תחת חקירה. התכונות גודל והפיזיולוגיות שלהם לעתים קרובות להגביל יישומי מניפולציה והדמיה. תרבות שורות תאים הנציחו נעשתה שימוש נרחב, אבל זה יכול רק לשכפל את השלבים המוקדמים של בידול. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר מניפולציה גנטית קלה של myofibers שמקורם myoblasts עכבר העיקרי. לאחר שבוע של בידול, את myofibers להציג התכווצות, מיושר סרקומר ואת שלשות, וכן גרעיני פריפריה. תהליך ההתמיינות כולו ניתן ואחריו הדמיה או immunofluorescence חיים. מערכת זו משלבת את היתרונות של vivo לשעבר קיימים פרוטוקולים במבחנה. האפשרות של transfection קל ויעיל כמו גםההקלות של גישה לכל שלבי הבידול מרחיבות את היישומים האפשריים. Myofibers יכול לאחר מכן לשמש לא רק כדי לענות על שאלות בביולוגיה התפתחותית תא רלוונטיות, אלא גם כדי לשחזר פנוטיפים מחלת שריר עבור יישומים קליניים.

היקף פיתוח myofiber נקבע בעיקר על ידי טוהר הכדאיות של myoblasts המבודד. ההידבקות, ההתפשטות, ויכולת ההיתוך ניתן להשתמש כדי לגשת באופן אמפירי הפרמטרים האלה (איור 1 א &#39;, ב). בשעת ההתפשטות D2, myoblasts צריך דבק והם אמורים להציג את צורת כישורים הטיפוסית. הפצת צפוי לקרות בהרחבה בשלב זה, המוביל להיווצרות myotube ספונטנית למחרת (איור 1B). תא confluency שיהיה עליך לערוך בהם שינויים קלים. זה צריך להיות מוגבר אם myoblasts לקחת יותר מ -3 D להתרבות פתיל. זה צריך להיות ירידה אם myofibers אינו מורשה לגדול להאריך יחסית ישר עקב הצפיפות שלהם. Confluency בדרך כלל פוחתת מהמרכז אל הפריפריה של המנה, כך myofibers הטוב ביותר צריך להימצא לעבר האזורים החיצוניים. Myotubes יהיה להאריך במהירות מרובה תצוגת גרעינים מיושרים מרכזי (תרשים 1C). על ידי D5, כמה תאים להתחיל לרכוש פסים ומרגש הגרעינים שלהם לפריפריה. מספר myofibers עם מאפיינים בוגרים יגדל עם זמן, כמו גם עם עובי תא (האיור 1D). מידת הבידול ניתן להבחין עוד יותר על ידי immunofluorescence. Myofibers קבועה שלשות משוכלות נוכחי בידול D8. זה יכול להיות מאושר על ידי רכיבי הדמיה של T-tubules (DPHR) ואת SR (triadin), אשר צפויים colocalize על השלשות (איור 2). הפונקציונליות של myofibers ניתן לטפל על ידי הדמיה לחיות. מתוך בידול D3 ואילך, התאים להציג עוויתות ספונטנית. על ידי transfecting חיישן סידן (למשל., GCaMP6f 11), אפשר לצפות כי הצירים הם מצמידים עם פסגות סידן (איור 3). באמצעות מערכת זו, הצלחנו לזהות מסלול מולקולרי רומן מופר ב myopathies centronuclear ו dystrophies myotonic, ולפיכך יכולה להיות מטרת רומן עבור טיפולים מולקולריים חדשניים 7. גם אנחנו צריכים להתאים את השיטה בחקר התפתחות צומת עצב-שריר (NMJ) 12. דרך coculture עם explants בחוט השדרה של חולדה, שתיארנו תפקיד dynein במבנה NMJ 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> איור 1: שלבי ההתפתחות של תרבות myoblast. א) בשעת ההתפשטות D2, myoblasts דבק וחל מתרבה. ב) proliferation D3, confluency של 60 - 80% הגיע לסיומה, myoblasts להתחיל פיוזינג ספונטני. ג) בשעה בידול D3, myotubes המכיל גרעינים במיקום מרכזי הם השולט. D) מתוך בידול D5 ואילך (למשל, יום 8), myofibers להתחיל מפגין תלמים וגרעינים היקפי ולהתחיל להתעבות. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> איור 2: תמונה Confocal נציג של D8 Myofiber immunostain. א) Immunostaining עבור קולטן dihydropyridine (DHPR, הפאנל העליון) ואת triadin (TRDN, פאנל באמצע). כיסוי של DHPR, TRDN, וערוצי DAPI תערוכות colocalization של רכיבי השלישייה. B)<html> פרופיל עוצמת הקו הצהוב נמשך בדו א) תמונת 3D של טיוח נפח של myofibers מוכתם עבור α-actinin (ירוק) ו DAPI (כחול). רוחב בר ורשת Scale: 5 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> איור 3: הדמיה חיה של רמות הסידן Myofibers עם ספונטנית מתעוות. א) זמן לשגות מהיר (20 מסגרות ms) מיקרוסקופיה של ניצוץ סידן בתוך myofiber מתעוות. סידן אותר דרך הביטוי של GCaMP6f (Addgene פלסמיד # 40,755). כימות B) של עוצמת הקרינה לאורך זמן עבור חיישן סידן א פאנל_blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K Views.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Video: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של