This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation של DNA חוד מעוגל באמצעות מסוף transferase (TDT) הערה: השתמש T4 DNA (166 KBP), שהינה DNA חוד מעוגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 2.5 מ&quot;מ 2 CoCl, 5 μl של 10 × חיץ התגובה, 0.5 μl של 10 מ&quot;מ ביוטין-11-dUTP, 0.5 μl של transferase הטרמינל (10 יחידות), ו -0.5 μl של ה- DNA T4 (0.5 מיקרוגרם / μl) לתערובת התגובה. הפוך לנפח סופי של 50 μl ידי הוספת 38.5 μl של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. הערה: זמן תגובה מורחבת עשוי להניב הדנ&quot;א הדו-קשור, כלומר, יתכן כי biotins מתויג בשני קצותיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ &#39;EDTA, pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation של DNA הסתיימה דביק שימוש DNA האנזים הערה: DNA λ השתמש (48.5 KBP), שהינה DNA דביק-סוף. &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של ה- DNA האנזים T4, 5 μl של חיץ קשירת 10 ×, 1 μl של 25 ng / μl DNA הפאג λ, ולהוסיף 43 μl של מים כדי ליצור נפח סופי של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. derivatization Surface הפונקציונלי הערה:. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ&quot;א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1 תהליך PEGylation זה חשוב הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין אקראי רעש נוצר על ידי התקשרות של רצויי מולקולות משמעותיים על פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיראנה ניקוי הערה: פתרונות פיראנה להגיב נמרצות עם חומרים אורגניים, ולכן זה צריך להיות מטופל בזהירות, עמידה בהנחיות בטיחות נאותה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips על מדף polytetrafluoroethylene (PTFE), ולהחזיק אותם בy PTFE חותם חוט קלטת לאורכו, חצי על קצה משטחים וחצי על המדף. לאחר גלישה, להשאיר חתיכה ארוכה (~ 5 סנטימטרים) של סרט לטיפול המתל במהלך הליך הניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס זכוכית 1 ליטר עם 350 מ&quot;ל של H 2 SO 4 ו -150 מ&quot;ל של H 2 O 2 כדי להפוך פתרון פיראניה במנדף. מניחים את מתלה בתמיסה פיראניה במשך שעה 2.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פיראניה ריק מן הקנקן, ולשטוף coverslips ביסודיות עם מים ללא יונים עד pH של המים בכוס מגיע נייטרלי. השתמש רצועות נייר pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate המדפים של תלושים לכסות במים המכילים המבחנה, למשך 30 דקות. מים ריקים מהקנקן רק לפני silanization אמינו. השתמש 75 ואט sonication לנקות derivatize מצעי הזכוכית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aminosilanization על משטח זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine ו -10 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית 200 מ&quot;לשל מתיל אלכוהול במיכל פוליפרופילן נקי להכנת הפתרון aminosilanization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslips לנקות בתוך המיכל פוליפרופילן. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל&quot;ד ו החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate כוס עם מכסה מחליק derivatized במשך 15 דקות ב 75 W. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל&quot;ד ו מקום לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את הפתרון מן הקנקן, ולשטוף coverslips בזהירות, פעם עם אלכוהול מתיל, ופעמיים עם כוהל אתילי. coverslips אחסן כוהל אתילי ולהשתמש בהם תוך שבועיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PEGylation של coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 10 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;סודיום ביקרבונט (NaHCO 3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2 מ&quot;ג של קרבונט ביוטין-PEG-succinimidyl (ביוטין-PEG-SC) ו -80 מ&quot;ג של valerate PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) ב 350 μl של NaHCO 3. השתמש צינור הגנת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינור נמרצות במשך 10 שניות, צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × דקות 1 כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון, ואחריו שטיפה עם כוהל אתילי. אפשר את השקופית אוויר יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ירידה (50 μl) של פתרון PEG בשקופית הזכוכית הנקיה. מכסים את אגל בעדינות עם תלוש כיסוי silanized אמינו, מבלי ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית עבור 3 שעות עד לילה חשוך, גם מפולס בתא לח בטמפרטורת חדר. השתמש בעל קצה פיפטה וריק כמו התא, עם מים בתחתית. חותם פתרון PEG שיורית בצינור ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslip PEGylated ביסודיות עם מים ללא יונים. אחסן אותו במקום חשוך ויבש עד השימוש. </li></ol></li></ol> 3. הרכבת תא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק בעל אקריליק אגרוף, כמו באיור 2. ודא בקוטר של להכניס צינורות הוא 0.762 מ&quot;מ, וציין חור אחד הוא מפרץ קטן והשני הואלשקע (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רצועות סרט דביקות דו-צדדיות (רוחב 5-6 מ&quot;מ) על בעל אקריליק (איור 2), יישור בניצב חור כניסה ויציאה, לא מביך כל חורי ערוץ. השתמש רצועות קלטת אלה קירות רב ערוצית לעשות תאים. שפשפו את הקלטת באמצעות קצה pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip PEGylated על העליונה כדי ליצור תאי זרימה, כשהצד PEGylated עם הפנים כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע כל פתרון דליפה, לחץ על החלק העליון של coverslip על האזור שבו קלטות דו צדדית ממוקמות. להוסיף דבק אפוקסי מהיר יבש כדי לסגור את הקצוות של החדר בראש בתחתית (צבע צהוב באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קטע קצר (2.5 ס&quot;מ) של צינורות (קוטר חיצוני, OD, 0.042 &quot;) כדי מזרק חזק גז ולאטום המפרק עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות (OD: 0.03 &quot;) ארוכים וגמישים אל הצינורות צמודים המזרק ולאטום מפרק עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הטוביםng צמוד מזרק עם מים די. ודא שאין בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצינור לתוך החור של תא הזרימה חתום עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפ צהוב (200 קצה μl) על החור אחרים כמאגר. </li></ol> 4. טוענים דוגמא אל לשכת התזרים הערה: Neutravidin ניתן להחליף חלבונים avidin אחרים כגון streptavidin. כל התגובות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם כן היא מוזכרת. קח פתרון מדגם טיפ צהוב, ולהתקין את הקצה עם הפתרון לתוך החור של בעל אקריליק (איור 2b). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מזרק ב 50 μl / min. טען 20 μl של חלבון avidin (25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתמיסה T50, טריס 10 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 8), ולשמור אותו במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של oligodeoxynucleotides biotinylated (100 מיקרומטר 1 × TE), ולשמור אותו במשך 10 דקות. אם transferase הטרמינל משמש, לדלג על הטעינהשל oligodeoxynucleotides. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של פתרון ה- DNA משלב 1 לתוך תא זרימה בקצב זרימה של 10 μl / min, ולשמור אותו במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את תא הזרימה עם 1 × TE, ולטעון 40 μl של 10 FP-DBP (~ 80 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זרימה רציפה של מולקולות מכתימות ב 1 × TE על עדשה אובייקטיבית 60X. השתמש 488 לייזר מצב מוצק ננומטר עירור של FP (eGFP) -DBP. עבור מתיחה מלאה של מולקולות DNA, להחיל ספיקות שונות לפי אורכי DNA בשימוש. לדוגמה, להחיל 50 μl / min 48.5 KBP של DNA λ, ו 100 μl / min 166 KBP של דנ&quot;א T4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מחזור של בעל אקריליק, להשרות תאי זרימה התאספו בתמיסת דטרגנט בית 12. הסר קלטות אפוקסי עם סכין גילוח ולשפשף עם ידות כדי לקחת אותם לגמרי. סתימה חורה עם מחטי מזרק. שמור על הבעלים במי deionized עד לשימוש נוסף. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מציגים פלטפורמה המאפשר הדמיה מולקולות דנ&quot;א ארוכות biotinylated לעיגון על משטחים. דיווחנו גישה עבור מולקולות DNA קשור על משטח מצופה חלבון avidin עם אלבומין בסרום שור biotinylated. 6 לפי הגישה קודם לכן, מצאנו נושא מכריע של מחשוף צילום DNA הנגרם על ידי צבעי bis-העיבור כי להכ?...

ויזואליזציה של מולקולות דנ&quot;א גדולות קשורות ברצועה על משטחי זכוכית או חרוז נוצלה על חקירת אינטראקציות חלבון דנ&quot;א, דינמיקת חלבון על מצע DNA, 1,2 ופיזיקת פולימר. 3,4 פלטפורמת מולקולות דנ&quot;א גדולות יחידות קשורות יש כמה ברור יתרונות בהשוואה לשיטות וקיבוע DNA אחרים. 5 ראשית, מולקולת דנ&quot;א גדולה הקשורה על פני השטח יש קונפורמציה טבעי אקראי סליל ללא אספקת גזירה, מהם החשיבות מכרעת עבור חלבון-DNA מחייבת להכיר אתר הקישור שלו. שנית, זה מאוד קל לשנות את הסביבה הכימית סביב מולקולות DNA לסדרת תגובות אנזימטיות בתא זרימה. שלישית, זרימת גזירת microfluidic גורמת DNA המולקולרית המתיח עד 100% של אורך המסלול המלא, וזה מאוד קשה להשיג באמצעות התארכות DNA גישות חלופית כגון משטח וקיבוע 6 וכליאת nanochannel. 7 מלא stretcheמולקולת הדנ&quot;א ד גם מספקת מידע מיקומית כי יכול להיות שימושי עבור ניטור תנועות האנזימטית על המפה הגנומי. אף על פי כן, גישת קשירת DNA יש חסרון קריטי כי לצבוע intercalating כגון YOYO-1 בדרך כלל גורם למולקולות DNA קשורות להישבר בקלות על ידי אור עירור קרינה. באופן כללי, מולקולות דנ&quot;א גדולות צריכות להיות מוכתמות עם פלורסנט לצבוע להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך, YOYO-1 או צבעי סדרת הטוטו אחרים משמשים בעיקר בגלל צבעים אלה לזרוח רק כשהם intercalate פעמיים גדילי דנ&quot;א. 8 עם זאת, ידוע כי bis-intercalating לצבוע גורם צילום מחשוף DNA האור הנגרמת בגלל של עיבור fluorophores. 9 יתר על כן, מולקולות DNA מוכתמות fluorescently הקשור על פני השטח הן יותר שבירות מאז תזרים גזירה יכול להפעיל שבירת כוחות על העברת מולקולות DNA באופן חופשי. לכן, פיתחנו FP-DBP כרומן DNA-מכתים חלבון לצבוע הדמית מולקולות דנ&quot;א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח. היתרון של שימוש FP-DBP הוא שזה לא לגרום צילום מחשוף של מולקולות DNA שאליו הוא נקשר. 10 בנוסף, FP-DBP אינה מגדילה את אורך קווי המתאר של ה- DNA, ואילו צבעים-intercalating bis להגדיל את אורך המסלול בכ -33%. שיטת וידאו זה מציגה את הגישה ניסיון אולי לקשירת מולקולות דנ&quot;א גדולות משטח PEG-ביוטין. איור 1 מדגים גישות שונות של קשירת DNA עם קצוות בוטים קצוות דביקים. לכן, שיטה מכתימה זה יכול להיות מיושמת על כל סוג של מולקולת הדנ&quot;א. איור 2 מתאר ייצוג סכמטי של הרכבת תא הזרימה שיכולה להיות נשלטה על ידי משאבת מזרק כדי ליצור תזרים גזירה למתוח מולקולות דנ&quot;א וכן לטעון כימיים אנזים פתרונות. איור 3 מדגים micrographs של מולקולות DNA נמתח מלא קשורה על PEGylatמשטח ed 11 ומוכתם FP-DBP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="925">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1. DNA Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Terminal Transferase</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:133px;">M0315S</td>
			<td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotin-11-dUTP</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">R0081</td>
			<td>Biotin-ddNTP is also available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">T4GT7 Phage DNA</td>
			<td style="width:167px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:133px;">318-03971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">E6758</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:133px;">M0202S</td>
			<td>Provided with 10x reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Lambda Phage DNA</td>
			<td style="width:167px;">Bioneer</td>
			<td style="width:133px;">D-2510</td>
			<td>Also available at New England Biolabs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:925px;">2. Functionalized Surface Derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.1) Piranha Cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Coverslip</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:133px;">0101050</td>
			<td>22x22 mm, No. 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Teflon rack</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Custom Fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">PTFE Thread Seal Tape</td>
			<td style="width:167px;">Han Yang Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">3032292</td>
			<td>Teflon&#8482; tape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sulferic acid</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">S280823</td>
			<td>H2SO4, 95 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">H290423</td>
			<td>H2O2, 35 % in water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sonicator</td>
			<td style="width:167px;">Daihan Scientific Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">WUC-A02H</td>
			<td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.2) Aminosilanization on Glass Surface</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] 
			ethylenediamine</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">104884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Duksan Chemicals</td>
			<td style="width:133px;">414</td>
			<td>99 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methyl Alcohol</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">M300318</td>
			<td>99.9 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polypropylene Container</td>
			<td style="width:167px;">Qorpak</td>
			<td style="width:133px;">PLC-04907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ethyl Alcohol</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">A300202</td>
			<td>99.9 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.3) PEGylation of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Syringe Filter</td>
			<td style="width:167px;">Sartorius</td>
			<td style="width:133px;">16534----------K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Biotin-PEG-SC</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:133px;">Biotin-PEG-SC-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">mPEG-SVG</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:133px;">MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">A300129</td>
			<td>99 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:133px;">1000612</td>
			<td>~76x26x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">3. Assembling a Flow Chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylic Support</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Custom Fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Double-sided Tape</td>
			<td style="width:167px;">3M</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Transparent type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Quick-dry Epoxy</td>
			<td style="width:167px;">3M</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:167px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:133px;">06417-11, 06417-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Gas Tight 250 &#181;l Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Hamilton</td>
			<td style="width:133px;">81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:167px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:133px;">NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">4. Sample Loading into Flow Chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Neutravidin</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;">31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tris base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T1503-5KG</td>
			<td>Trizma base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:133px;">IX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:167px;">Q Imaging</td>
			<td style="width:133px;">Rolera EM-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Solid-state Laser (488 nm)</td>
			<td style="width:167px;">Oxxius</td>
			<td style="width:133px;">LBX488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Alconox</td>
			<td style="width:167px;">Alconox Inc.</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

איור 1 מציג שתי שיטות קשירת DNA שונות בהתאם מבני מסוף של מולקולת הדנ&quot;א. האיור 1 א ממחיש כיצד מולקולות DNA הסתיימו הדביקות הם הכלאה עם oligonucleotides biotinylated משלים, אשר משותק על פני שטח PEG מצופה avidin. 1B איור מראה תוספת של biotinylated ddNTP או d...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Video: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

DNA-איזוטופ יציב גשוש (ה-DNA SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

הפגנות חומרת הסביבה מופחתת כובד של טכנולוגיה cytometer זרימה וCompanion Microfluidic אב טיפוס מוקטנת ערבוב

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...