Name: a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

1. הכנת היעד רנ&quot;א Cas9 בונה וקטור תורם תיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט של gRNAs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב רצף יעד המדריך-RNA מיקוד גן N1L של וירוס vaccinia בעקבות העיקרון כאמור 25. יישר את רצף היעד מדריך-RNA נגד הגנום של הנגיף vaccinia (במקרה זה, זן ליסטר של וירוס vaccinia) כדי לשלול כל רצפי היעד gRNA מחוץ היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז ולשכפל oligos gRNA לתוך וקטור שיבוט gRNA כפי שתואר לעיל 25. אשר את הרצף של כל gRNA בודד הווקטור שהתקבל על ידי סנגרתי רצף 33. שם שהתקבל gRNA לבנות כמו gRNA N2 33. הערה: מטרת אתר gRNA הוא בתוך גן N1L, והוא באיזור שבין הזרוע הימנית ושמאלית הזרוע כי מכסה וקטור תורם תיקון (ראה איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבט את גן Cas9 חסר אות הלוקליזציה הגרעינית (NLS) לתוךpST1374 וקטור לייעד את המבנה כמו PST-Cas9 33. הערה: כל וקטור שיבוט ביטוי יונק יכול לשמש לבניית וקטור ביטוי Cas9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית וקטור תורם תיקון עבור HR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גן N1L של VV כפי לאזור המיקוד של שינוי 33. ודא כי האורכים של הזרועות על ימין ועל שמאל הם כ 500-600 נ&quot;ב כל, ומשני צדיה של אזור היעד. הערה: זרוע הזרוע / שמאל ימין יכולה להכיל עד 50 חפיפה נ&quot;ב עם אזור היעד (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone וקטור תורם התיקון באזור N1L כפי שתואר לעיל 33, 34 ו לייעד וקטור תורם התיקון כמו PT-N1L. הערה: ראה איור 1 עבור וקטור תורם תיקון ובאזור היעד שלה. אזורים אחרים של VV עשויים להיות ממוקדים באמצעות באזור (גנים) -specific gRNA (הים) ו וקטור תורם תיקון ספציפי לאזור. כל וקטור שיבוט יכול לשמש לבניית וקטור תורם תיקון. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחבת פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הפלסמיד לתוך כימית מוסמכות E. coli פי הוראות היצרן. לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד בהתייחסו פרוטוקול המסופק על ידי היצרן. </li></ol></li></ol> 2. תאים מתזמנים (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים CV-1 (פיברובלסטים כליות קוף) ב בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 5% בסרום שור העובר (FBS), 100 פניצילין U / mL, ו- 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize CV-1 תאים הנמצאים 80-90% ומחוברות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום תרבית תאים מבקבוק T-175 המכיל תאי CV-1. שוטפים את monolayer עם 5 מ&quot;ל של PBS סטרילי כדי להסיר בסרום שיורית לשאוב PBS. להוסיף 2.5 מ&quot;ל 1 × פתרון טריפסין-EDTA כדי לכסות את התאים ומניחים את הבקבוק ב -37 חממה מעלות צלזיוס למשך כ 5 דקות כדי לסייע ניתוק התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהוֹסִיף10 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים (ראה שלב 2.1) להשעות את התאים על ידי פעולה פיפטה בעדינות. ספירת המספרים הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת תאים 6 צלחות היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 2 × 10 5 CV-1 התאים 2 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים לתוך הבאר כל צלחת 6-גם יום לפני transfection. הערה: צעד צנטריפוגה נוסף כדי להסיר טריפסין אינה נדרשת. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Transfection של Cas9 פלסמיד ו gRNA פלסמיד (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect CV-1 תאים (מוכן בשלב 2.2.3.1) עם 0.5 מיקרוגרם PST-Cas9 פלסמיד ו 0.5 מיקרוגרם פלסמיד gRNA N2 באמצעות מגיב transfection פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 24 שעות באינקובטור (37 ° C עם 5% CO 2), ולאחר מכן להחליף את מדיום עם 2 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים טרי (כמתואר בשלב 2.1). </li></ol> 4. זיהום של CV-1 תאים ו- V תורם ההסעותEctor Transfection עבור HR (יום 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנגיף עמוד השדרה VVL15 עם תרבית תאים בינוניים DMEM לריכוז של 2 × 10 5 pfu / מ&quot;ל. 24 שעות לאחר transfection של פלסמידים Cas9 ו gRNA, להוסיף 100 μL של הנגיף בדילול לבאר כל התאים CV-1 transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 h זיהום פוסט-וירוס, transfect וקטור התורם הסעות 1.0 מיקרוגרם לתוך התאים שנדבקו VVL15 עבור HR באמצעות מגיב transfection בהתאם להוראות היצרן. מניחים את התאים transfected בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. </li></ol> 5. קציר וירוס רקומביננטי (יום 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של transfection עם וקטור תורם הסעות עבור HR בשלב 4.2, לנתק את תאי CV-1 transfected באמצעות מגרד תא. אסוף את ההשעיה התא לתוך cryovial ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. הערה: לקנח כל שפיכת תרבית תאים בינונית עם חיטוי מייד ונגבה שוב עם 70% ethanol. </li></ol> 6. טיהור של VV השתנה (סיבוב ראשון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, זרע 15 6 צלחות גם עם 3 × 10 5 CV-1 תאים בכל טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, להפשיר את ההשעיה תא קפוא משלב 5.1 באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ו מערבולת cryovials במרץ למשך 30 שניות כדי להשיג lysate התא מבלי להסיר פסולת התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדבקת 6-גם צלחת אחת של תאים CV-1, לדלל 1 μL של lysate תא עם 3 מ&quot;ל של DMEM ולהוסיף 0.5 מ&quot;ל של lysate התא מדולל לבאר כל צלחת 6-היטב, על גבי מדיה כבר מתנה. להדביק את כל 6 הצלחות היטב מוכנות בשלב 6.1. הערה: הסרת תאים פסולת אינו נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יומיים של זיהום (כלומר, ביום 4), לזהות הפלאק RFP חיובי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות 10X עדשה אובייקטיבי לתייג את הפלאק מתחת לצלחת באמצעות עט סימון על ידי מקיפים את מיקום פלאק. הערה: ראה <stרונג&gt; איור 3 עבור לוחית RFP חיובי נציג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שישה cryovials שכותרתו המכיל 200 μL סרום ללא בינוני תרבית תאים DMEM להרים שישה לוחות שונים RFP חיובי. לשאוב את מדיום תרבית תאים מבאר עם לוחית שכותרתו (ים) (שלב 6.3). צרף טיפ 200 μL כדי פיפטה P200, להגדיר את עוצמת ב 30 μL ולקחת ~ 10 בינוני μL תרבית תאים מן cryovial אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את לחצן לדחוף פיפטה מבלי לשחרר את המדיום ולהשתמש הקצה לשרוט את האזור של פלאק אחד שכותרתו. שחרר את לחצן פיפטה לדחוף להרים את התאים מנותקים ולהעביר אותו לתוך cryovial המכיל 190 μL של סרום ללא DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עוד 10 בינוני μL מהבקבוקון עם התאים השרוטים (לאחר השלב האחרון) לחזור על התהליך של להרים אותו פלאק RFP חיובי שלוש פעמים לאסוף כמה שיותר תאים שרוטים ככל האפשר. להעביר את כל התאים לתוך באותו הבקבוקון ולאחסן את הבקבוקון ב -80 מעלות צלזיוס. </ol></li></ol> 7. טיהור של VV השתנה (סיבוב שני) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 3 × 10 5 CV-1 תאים לבאר כל שש 6 צלחות היטב בתרבות התאים למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את cryovials הקפוא (משלב 6.3.3) ב 37 ° C אמבט מים במשך 3 דקות, ואז מערבולת cryovials במרץ למשך 30 שניות כדי להשיג lysate תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μL של lysate התא המעורב אחד טוב של צלחת 6 באר. להדביק צלחת 6-גם אחד לכל פלאק. דגירת צלחות VV הנגועה 6-גם על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 על 2 ימים (טיהור פלאק סיבוב שנייה). לאחר מכן חזר בסעיף 6.3. הערה: יותר משישה לוחות RFP חיובי ניתן לאסוף; שתיים או יותר 6 צלחות גם יכולות לשמש לניקוי של כל פלאק. </li></ol></li></ol> 8. סבב נוסף של לוחית פורהfication <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carry על שלושה עד חמישה סבבים של טיהור נוסף הבאים באותו פרוטוקול כמתואר בשלב 7 עד שכל הפלאק נוצר פלאק חיובי אחד להיראות כאילו RFP חיובי תחת מיקרוסקופ. הערה: זה פלאק אז נחשב טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פלאק הוא טהור (איור 4, כל התאים הנגועים המבטאים RFP), למסוק לוחית חיובית לתוך cryovial ולאחסן ב -80 ° C, כמתואר בסעיף 6.3. בדוק את הלוחית בעקבות הפרוטוקול המתואר בשלב 9 ו -10. </li></ol> 9. הרחב את לוחית מטוהרים (ים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 3 × 10 5 CV-1 תאים לבאר כל יום 6-גם צלחת אחת לפני ההדבקה בנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה cryovial קפוא לעומת 8.2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי להשיג lysate התא. מוסיפים את כל lysate (מבלי להסיר פסולת התא) לתוך אחד טוב של צלחת 6-גם של תאים CV-1 (זורעים בשלב 9.1). דגירת תאי CV-1 הנגוע ב 37 מעלות צלזיוס עם 5CO% 2 עד 3 ימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב הכל הפלאק המטוהרים (לפחות שלושה לוחות). הערה: בפעם זיהום משתנה בין 1-3 ימים, תלוי כמות הנגיף lysate. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי VV הנגוע באמצעות מגרד תא כאשר יותר מ -50 תאי% להראות השפעת cytopathic שנצפתה במיקרוסקופ (תאים מעוגלים, בקלות מנותקת RFP חיובית). אוספים את התאים מנותקים יחד עם תרבית תאים בינוניים לתוך צינור 15 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 3 דקות. הסר את supernatant ולשמור התא גלולה ב -80 ° C עד לשימוש נוסף או להשתמש התא גלולה מיד צעד 10. </li></ol></li></ol> אימות 10. של שינוי של Mutant VV שימוש PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ VV DNA מן התא גלולה מוכן בשלב 9.3.1 באמצעות ערכת מיצוי DNA בעקבות פרוטוקול של היצרן. Elute DNA עם 200 μL של מים מזוקקים פעמיים. הערה: משתמש מחצית מהמחזור של הגלולה לחלץ דנ&quot;א לשמור את שאר לייצור ויראלי אם השיבוט מאומת כמכיל השינוי / ההכנסה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימות של המחיקה של הגן N1L ואת החדרת הגן RFP לאזור N1L. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר קטע DNA פרש גן N1L (L025) ואת פריימרים L026 גן באמצעות תוכנן נגד גן N1L. להגביר את הגן RFP באמצעות פריימרים -specific RFP. להגביר קטע DNA שליטה פורש A52R ידי PCR באמצעות פריימרים ספציפיים A52R. הערה: ראה רשימה של חומרי פריימרים ספציפיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את PCR באמצעות ערכת תערובת אמן PCR. הגדר 25 μL של תגובת PCR באמצעות 2 μL של תבנית ה- DNA, לפגל את תגובת PCR ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל 30 מחזורים של PCR ביצוע השלבים הבאים: לפגל את ה- DNA ב 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואז לחשל פריימרים על תבניות DNA ב 52 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות להאריך את תגובת PCR ב 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור את מוצרי ה- PCR באמצעות ג&#39;ל 1% agarose 33. ללכוד את התמונה ג&#39;ל באמצעות doc ג&#39;ל UV. אם N1L PCR שלילי PCRs A52R ו RFP הוא חיוביים, אז פלאק השתנה באופן נכון באזור N1L. </li></ol>

<ol>
	<li>Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+base-paired+flip-flop+terminal+loops+link+the+two+DNA+strands+of+the+vaccinia+virus+genome+into+one+uninterrupted+polynucleotide+chain.">Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain.</a> Cell. 28, 315-324 (1982).</li><li>Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brock biology of microorganisms, 9th edn. , (2000).</li><li>Cooney, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+and+immunological+response+to+a+recombinant+vaccinia+virus+vaccine+expressing+HIV+envelope+glycoprotein.">Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein.</a> Lancet. 337, 567-572 (1991).</li><li>Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+recombinants:+expression+of+VSV+genes+and+protective+immunization+of+mice+and+cattle.">Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle.</a> Science. 227, 433-435 (1985).</li><li>Legrand, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+potent+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+by+attenuated+vaccinia+virus+vectors+with+deleted+serpin+genes.">Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes.</a> J Virol. 78, 2770-2779 (2004).</li><li>Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+live+vaccines+by+using+genetically+engineered+poxviruses:+biological+activity+of+recombinant+vaccinia+virus+expressing+influenza+virus+hemagglutinin.">Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin.</a> Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).</li><li>Wiktor, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+rabies+by+a+vaccinia+virus+recombinant+containing+the+rabies+virus+glycoprotein+gene.">Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene.</a> Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).</li><li>Gallucci, S., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danger+signals:+SOS+to+the+immune+system.">Danger signals: SOS to the immune system.</a> Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+model:+a+renewed+sense+of+self.">The danger model: a renewed sense of self.</a> Science. 296, 301-305 (2002).</li><li>Guo, Z. S., Bartlett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+as+a+vector+for+gene+delivery.">Vaccinia as a vector for gene delivery.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).</li><li>Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vectors+for+cancer+immunotherapy.">Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy.</a> Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).</li><li>Tysome, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lister+strain+of+vaccinia+virus+armed+with+endostatin-angiostatin+fusion+gene+as+a+novel+therapeutic+agent+for+human+pancreatic+cancer.">Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer.</a> Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).</li><li>Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+poxvirus+oncolytic+effects+through+increased+spread+and+immune+evasion.">Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion.</a> Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).</li><li>Park, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+poxviruses+as+cloning+vectors:+insertion+of+the+thymidine+kinase+gene+from+herpes+simplex+virus+into+the+DNA+of+infectious+vaccinia+virus.">Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus.</a> Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> J Virol. 61, 1788-1795 (1987).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).</li><li>Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+that+are+associated+with+DNA+repeats+in+prokaryotes.">Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.</a> Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes.">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Cas9+endonucleases+reveal+RNA-mediated+conformational+activation.">Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation.</a> Science. 343, 1247997 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing.">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156, 836-843 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Res. 24, 122-125 (2014).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> J Virol. 89, 5176-5179 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9.">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).</li><li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation:+recombination-independent+selectable+cloning+vectors.">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li><li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper.">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li><li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li></ol>

Authors have no competing financial interests.

ישנן שתי מטרות עיקריות לגבי השינוי של VV למטרות טיפוליות. אחת היא למחוק גן מסוים, כגון קינאז thymidine גן (TK) כדי להחליש וירוס לשימוש טיפולי אנטי סרטניים. השני הוא לחמש VV עם גן טיפולי רצוי (כגון GM-CSF) או גן סמן (כגון גן בלוציפראז). השג אחת משני אלה כרוך את המחיקה של אזור היעד / גן. שיטת קשירה הישירה DNA 35 ותמונת אופן אריזה במבחנה ב -36 שמשו בעבר כדי ליצור וירוסי vaccinia מוטציה עם שינויי גן TK. עם זאת, שיטות אלו מוגבלות יישום לגבי המוטציה של אזורים אחרים בגנום בשל חוסר אתרי אנזים הגבלה ייחודיים על פני הגנום. הגישה הנוכחית ליצירת מוטצית VV כרוכה transfection של וקטור הסעות (תורם) עם סמן בחירה (RFP או GFP) לתוך CV-1 תאי שעות לאחר הדבקה עם VV להשפיע על incorporati ההומולוגיng סמן הבחירה לאזור היעד. מבחר לוחות סמן חיובי ואחריו-transfection פוסט h 24 טיהור שלהם. תהליך טיהור פלאק יכול להימשך עד 10 סיבובים, אחרון 3-4 שבועות ולעתים קרובות מוביל וירוסים רקומביננטי רצויים עם סמני מבחר מוכנס באזורים מחוץ היעד. פעמיים גדיל DNA הפסקות יכול לגרום הומולוגיים ביעילות בתאי יונקים 37, ועל ידי רתימת מנגנון זה את האפקטיביות של יצירת VV מוטציה ניתן לשפר לאין ערוך. מערכת gRNA מונחה Cas9 הועסקה בהצלחה בעריכה הגנום ומשפרת את היעילות של הומולוגיים באורגניזמים איקריוטיים 22, 25. לאחרונה, בתאים המארח את הגנומים של אדנו וסוג לי הרפס סימפלקס נערכו על ידי gRNA מונחה Cas9 מערכת 24. הוכח לאחרונה כי מערכת CRISPR Cas9 הוא כלי רב עוצמה עבור ביעילות עריכת הגנום VV ובניית וקטור VV דווקא משום שהביעגן מסוים. שניהם N1L gRNA מונחה Cas9 ואת הומולוגיים המסורתית (HR) השיטה הביאה אירועים HR מוצלח באותו אתר היעד של N1L. מעניין, עם זאת gRNA מונחה HR Cas9 המושרה ברמות גבוהות הרבה יותר של יעילות מאשר שיטת HR המסורתית. לפיכך, השימוש של gRNA מונחה Cas9 מבטל את הצורך לטהר כמה הפלאק להשיג VVS מוטציה. בעבודה זו, אנו שיפרה בצורה משמעותית את היעילות ואת מסגרת הזמן עבור דור של מוטנטים VV באמצעות מערכת Cas9 gRNA מונחה 33. מן ראוי לציין כי צעד קריטי אחד להשגת יעילות גבוהה של הומולוגיים הוא transfect תאי CV-1 עם פלסמידים להביע Cas9 ואת gRNA במשך 24 שעות לפני הביצוע הומולוגי הקונבנציונלית. מרווח 24 שעות מאפשר Cas9 ו gRNA להתבטא ברמה סבירה. יתר על כן, רצף gRNA מיקוד גן מסוים עשוי צריך להיות מותאם כפי שמצאנו כי gRNA השונה רצפי tגן argeting N1L מגוון יעילותם 33, 34. המגבלה עבור CRISPR / Cas9 ב VV עריכה היא השיעור הנמוך של הפלאק RFP החיובי בסיבוב הראשון של רקומבינציה. כדי להשיג כמות מספקת של הפלאק RFP חיובי המכיל וירוס רקומביננטי, בדרך כלל לפחות עשר צלחות 6-גם נדרשות, מה שהופך בסיבוב הראשון הקרנה מייגעת. לפיכך, יש עדיין צורך לייעל את הפרוטוקול להתגבר על מגבלה זו. גודלו הקטן של הפלאק RFP חיובי הוא עוד בעיה פוטנציאלית, אשר בשל נפח גבוה של lysate להשתמש כדי להדביק צלחת 6 באר. כדי להתגבר על זה, נפח קטן יותר של lysate יש להשתמש כדי להדביק צלחת 6-גם להשיג הפלאק RFP חיובי בגודל גדול יותר. באמצעות נפח קטן יותר של lysate תאפשר גם להפרדה טובה יותר של פלאק RFP חיובי מאלה RFP-שלילי. כתוצאה מכך פחות סיבובים של טיהור פלאק נדרשים להשיג הפלאק RFP חיובי טהור. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-יעד השפעות הן תמיד בעיה רצויה בעריכת גן. CRISPR-Cas9 הוכיח השפעות חוץ-היעד. עם זאת, עם תכנון זהיר של gRNA, מחוץ היעד תופעות ניתן להימנע בעת עריכת VV הגנום 33, 34. זהו יתרון מסוים של שימוש במערכת Cas9 gRNA מונחה לעריכת הגנום של VV. בהינתן הבטחות של VV, באמצעות מערכת CRISPR / Cas9 תאיץ את התפתחות VVS מוטציה למחקר ביורפואי ברפואה translational. בנוסף, מערכת כזו גם תזרז תגליות בביולוגיה של תא, כגון דיסקציה של מסלולי האיתות שמוצגים VV עבור תנועתיות תקטין המבוססת שלה.

וירוס Vaccinia (VV) הוא וירוס DNA עטוף השייכת למשפחת poxvirus ו מילאה תפקיד מכריע אחד ההישגים הגדולים ביותר ברפואה של מיגור האבעבועות השחורות. בעידן-מיגור הפוסט של אבעבועות שחורות, VV פותח כוקטור להעברת גנים עבור חיסונים נגד האיידס ומחלות זיהומיות אחרות 1-7 על ידי החדרת גנים של פתוגנים שונים לתוך וקטורי VV. VV גם נעשה שימוש נרחב כווקטור עבור חיסוני סרטן 8-14 במיוחד לפיתוח של שכפול וירוס vaccinia oncolytic במיקוד הגידול. על מנת ליצור וקטור חיסון יעיל עם סלקטיביות משופרת עבור תאים סרטניים, שינויים בתוך הגנום הויראלי נדרשים, כולל מחיקות הגן או הקדמה של גנים טיפוליים. עם התפתחות טכנולוגיית ה- DNA והבנה טובה יותר של הביולוגיה המולקולרית וירולוגיה, החדרת דנ&quot;א זר לתוך VV היה במקור להשיגד באמצעות רקומבינציה הומולוגי (HR) בשנת 1980 15. שיטה זו היא עדיין בשימוש נרחב לבניית וקטורי VV. מבוא של ההנדסה הגנטית מושג באמצעות וקטור הסעות עבור HR, אשר משלב מחדש עם הגנום VV בתאים טרום נגוע. עם זאת, שיטה זו הוכיחה להיות יעיל מאוד (פחות מ -1% הומולוגיים יעיל 16) ולעתים קרובות תוצאה היא כניסה אקראית של סמן מבחר לאזורים הלא ממוקד ו / או אובדן של הסמן על הרחבת וירוס. היעילות של הומולוגיים DNA להוספת DNA אקסוגני על לוקוסים הגנומי ניתן לשפר באופן דרמטי בנוכחות הפסקות פעמיים גדיל (DSBs) 17. לכן, הטכנולוגיה שיכול לגרום DSBs ב לוקוסי היעד בעל פוטנציאל גדול עבור הנדסת הגנום של VV. המערכת שפותחה לאחרונה CRISPR-Cas9 נראית מבטיחה עבור מפעילת DSBs בכל אזור גן VV. CRISPR-Cas9 הוא RNA-nuclease מודרך המעורבים חסינות אדפטיבית נגד פאגים הפולשים חומרים גנטיים זרים אחרים 18-20. ישנן שלוש מערכות CRISPR-קאש במגוון מינים של חיידקים 21. מערכת מסוג II CRISPR-קאש נעשה שימוש נרחב עבור עריכת הגנום של תאים איקריוטיים ווירוסים גדול. זה מורכב של endonuclease Cas9 מודרך-RNA (מ סטרפטוקוקוס pyogenes) חברה RNA מדריך יחיד (sgRNA) ואת טרנס-הפעלת crRNA (tracrRNA) 22-24. המתחם Cas9 / sgRNA מזהה את רצף הגנום של 20 נוקליאוטידים משלימים שקדמו מוטיב הסמוך 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer (PAM) רצף בתאי יונקים 22, 23. זה כבר נעשה שימוש בהצלחה לייצור יעיל של תאים מהונדסים גנטית, וירוסים ומודלים של בעלי חיים 22-32. מערכת CRISPR-Cas9 הוכיחה להיות כלי יעיל עבור הגנום מיקוד בשילוב עם הומולוגיים בציטופלסמה של VV נגוע תא CV-1ים כדי לייצר וירוסים vaccinia מוטציה 33, 34. על מנת להאריך את התחולה הפוטנציאלית של שיטה זו, אנו מציגים מידע מפורט על המתודולוגיה של מערכת זו. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי ליצור VV מוטציה עם מחיקת גן מסוימת ו / או לחמש את נגיף המוטציה עם transgene טיפולית.

<table><tbody><tr><td>Plasmid #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA cloning vector</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 cloning vector</td></tr><tr><td>pGEMT easy</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>repair donor vector cloning</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>C4040-10</td><td>Invitrogen</td><td>transformation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>27106</td><td>Qiagen</td><td>plasmid extraction</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>cell culture serum</td></tr><tr><td>penicillin, streptomycin</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>antibiotics</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>transfection</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0&amp;nbsp;mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>collect virus</td></tr><tr><td>fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus BX51 Fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>find RFP-positive plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Thermo Scientific</td><td>PCR reagent</td></tr><tr><td>10 cm culture dish</td><td>Z688819-6EA</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Z707759</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>C5981</td><td>sigma</td><td>scrap cells</td></tr><tr><td>1x Trypsin-EDTA solution</td><td>T4299</td><td>sigma</td><td>trypsinize cells</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfectant</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5&amp;rsquo;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>N1L reverse&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#039;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R forward 5&amp;rsquo;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R reverse 5&amp;rsquo;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP forward 5&amp;rsquo;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP reverse 5&amp;rsquo;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR product</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

לבנייה של וקטור VV חדש, נקודת מוצא המפתח היא לתכנן ולבנות וקטור הסעות תורמות שיכול למקד לאזור מסוים של הגנום. במחקר זה, הגן VV N1L שימש מטרה למשל. הקלטת של וקטור ההסעות התורמות עבור רקומבינציה ובאזור הממוקד VV מוצגת באיור 1. על מנת לשפר את היעילות של רקומבינציה ההומולוגי, פלסמידים להביע Cas9 וכן N1L ספציפי gRNA היו שיתוף transfected לתוך CV -1 תאים 48 שעות לפני הביצוע ההומולוגי 33. יום אחד (24 שעות) לאחר transfection, RFP התבטאה התאים CV-1 (איור 2). לאחר הדבקה של תאי CV-1 עם lysate כולו מן הומולוגי (השלב 5),-RFP החיובית ושלטים שליליים הן נצפו תאי CV-1 (איור 3). בעקבות פרוטוקול הטיהור תאר, שותף פלאק טהור<html> ULD להתקבל לאחר 3-5 סיבובים של טיהור. כפי שניתן לראות בתרשים 4, כל הפלאק לאחר הדבקה עם lysate תא נגזר לוחית טהורה בוירוס vaccinia המוטציה הציג אות RFP. כדי לברר אם המוטציה הטהורה VV היה השינוי הגנטי הנכון, PCR שמשה כדי לאשר את העדר של גן N1L הממוקד, כפי שמוצג באיור 5. PCR של הנגיף השונה הראה איתות חיובית עבור RFP ו אות נעדרה במשך N1L ( איור 5 AG ליין), ואילו תוצאות PCR של N1L עבור הווירוס המלא (CTR) עם אזור N1L שלם הן חיוביות. שברי DNA שליטת A52R היו חיוביים עבור כל הווירוסים רקומביננטי ונגיף Ctr. יעילות HR פלאק RFP החיובי היא 100% (6/6) בניסוי הזה (זה היה עד 94% בעבודה הקודמת 34). השיטה המתוארת במסמך זה שפרה את יעילות רקומבינציה ידי יותר מ -100 לקפל לעומת פרוטוקולים קונבנציונליים 33, 34. התוכן &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> איור 1:. הקלטת של וקטור ההסעות התורמות עבור הומולוגיים, ואת האזור בגנום VV מכרז גן סמן הטיהור הוא מונע על ידי אמרגן H5. וקטור התורם תיקון מיקוד תוצאות באזור N1L בגן RFP השתלבותה לאזור N1L לאחר הומולוגיים. &quot;X&quot; מציין את הרצף ההומולוגי וקטור תורם התיקון שיחליף אותו הרצף על הגנום וירוס vaccinia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> איור 2:. הדמיה של תאים 1 CV יום אחד לאחר הומולוגיים יום אחד after הומולוגי, את התאים נגועים עם VV ו transfected ידי וקטור תורם תיקון הם RFP חיובי ת:. בניגוד שלב תמונה (100X הגדלה המקורי) B:. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (100X הגדלה המקורי). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> איור 3:. לוחית RFP-חיובית הטיהור בסיבוב הראשונה של וירוס מוטנטי הטיהור בסיבוב הראשון של נגיף המוטציה, שלט RFP-חיובי (מסומן בעיגול עם קו אדום) עם המחיקה באזור היעד מוקף הפלאק נוצר על ידי סוג הווירוס פרוע (מסומן בעיגול עם קו צהוב) ת:. בניגוד שלב תמונה (100X הגדלה המקורי) B:. קרינת micrתמונת oscopy (100X הגדלה המקורי). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> איור 4:. המוטציה הטהורה VV לאחר 3-5 סיבובים של טיהור, הפלאק טהור התקבל כל הפלאק היה RFP חיובי ת:. בניגוד שלב תמונה (100X הגדלה המקורי) B:. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (100X הגדלה המקורי) . סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> איור 5: Verification של מוטציה הטהור VV. DNA היה שחולץ מן VV נגוע CV-1 תאים. את המחיקה של אזור היעד N1L אומת על ידי PCR באמצעות פריימרים N1L, החדרת RFP לתוך אזור N1L אושרה על ידי ה- PCR באמצעות פריימרים RFP. Lanes AF מתאימה שישה לוחות מטוהרים, ליין G הוא שלט שליטה עם מחיקת N1L אומתה בעבודה קודמת 33, ליין Ctr (שליטה) הוא וירוס vaccinia הסוג הבר (עם אזור N1L ללא פגע). A52R גן היה מוגבר כמו הגן המלא עבור כל הדגימות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Views.  Queen Mary University of London.  וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. 

Video: A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Cancer Research

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Neuroscience

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...