Name: a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

Hedef RNA ve Cas9 Yapıları ve Onarım Donör Vektör 1. Hazırlık <ol><li> gRNAs klonlanması <ol><li> Daha önce 25 belirtilen prensip aşağıdaki aşı virüsünün N1L genini hedef alan bir kılavuz-RNA hedef dizisi tasarlayın. ineklerdeki çiçek hastalığı virüs genomu karşı kılavuz-RNA hedef sekans hizalama (bu durumda, aşı virüsü Lister suşu) bir hedef dışı gRNA hedef sekanslarını ekarte etmek için. </li><li> Sentezlemek ve daha önce 25 açıklandığı gibi bir gRNA klonlama vektörüne gRNA oligos klonlamak. Sanger dizileme 33 ile sonuçlanan vektör içinde her gRNA sırasını onaylayın. Ortaya çıkan gRNA gRNA N2 33 olarak inşa adlandırın. NOT: gRNA hedef site N1L geni içinde ve sol kol ve sağ kol arasındaki bölgede olduğu onarım verici vektör kapakları (Şekil 1). </li></ol></li><li> nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) yoksun Cas9 genini klonlamakpST1374 vektör ve PST-Cas9 33 olarak yapı belirleyin. NOT: herhangi bir memeli sentezleme klonlama vektörü Cas9 sentezleme vektörünün kurulması için kullanılabilir. </li><li> HR onarım donör vektörü İnşaatı <ol><li> Modifikasyon 33 için hedef bölge olarak VV N1L genini kullanın. sol ve sağ kol uzunlukları yaklaşık 500-600 bp her ve hedef bölgeyi komşu olduğundan emin olun. NOT: Sol kol / sağ kol hedef bölge ile 50 bp üst üste kadar olabilir (Bakınız Şekil 1). </li><li> Daha önce 33, 34 anlatıldığı gibi N1L bölge onarım donör vektör Clone ve pT-N1L olarak onarım donör vektör belirler. NOT: onarım donör vektörü ve hedef bölge için Şekil 1&#39;e bakınız. VV Diğer bölgeler bölgesi (gen) -özel gRNA (ler) ve bölgeye özgü onarım verici vektörü kullanılarak hedef alınabilir. Herhangi bir klonlama vektörü onarım verici vektör yapımı için kullanılır. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> plasmid genişletilmesi <ol><li> Kimyasal olarak, yeterli E. plazmidi Dönüşümü E. coli, üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. İmalatçı tarafından sağlanan protokole ilişkin bir plazmid ekstraksiyon takımı kullanılarak plazmit saflaştırılır. </li></ol></li></ol> 2. Tohum Hücreler (Gün 1) <ol><li> Bakım CV-1 37 ° C de% 5 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) &#39;de hücreleri (Maymun böbrek fibroblastları),% 5 CO 2. </li><li> % 80-90 konfluent Trypsinize CV-1 hücreleri, <ol><li> CV-1 hücreleri ihtiva eden T-175 şişesi hücre kültür ortamı çıkarın. PBS kalan serumu çıkarmak ve aspire steril PBS 5 ml tek tabaka durulayın. hücreleri kapsar ve hücre ayrışması yardımcı olmak için yaklaşık 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir 2.5 ml 1 x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. </li><li> EklemekHücre kültür ortamı 10 ml yumuşak bir pipet hareketi ile hücrelerin süspansiyonu (adım 2.1). Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak. </li><li> 6-yuvalı plakalar içinde Hücrelerin Serpilmesi <ol><li> 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, hücre kültür ortamı 2 mL tohum 2 x 10 5 CV-1 hücreleri, transfeksiyondan bir gün önce. Not: tripsin çıkarmak için ek bir santrifüjleme aşaması gerekli değildir. </li></ol></li></ol></li></ol> Cas9 Plazmid ve gRNA 3. Plasmid transfeksiyonu (Gün 2) <ol><li> 0.5 ug PST-Cas9 plasmidi ile ve imalatçının talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak 0.5 ug gRNA N2 plazmid (adım 2.2.3.1 hazırlandı) Transfect CV-1 hücreleri. </li><li> Bir kuluçka makinesi içinde 24 saat süreyle inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2), ve daha sonra (adım 2.1 tarif edilmiştir), taze hücre kültür ortamında 2 mL orta yerine. </li></ol> CV-1 hücreleri, ve Servis Verici V 4. Enfeksiyonector Transfeksiyon HR (Gün 3) <ol><li> 2 x 10 5 pfu / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar DMEM hücre kültür ortamı ile omurgası VVL15 virüsü seyreltilir. Cas9 ve gRNA plasmidlerin 24 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş CV-1 hücrelerinde, her kuyuya seyreltilmiş virüs, 100 uL ilave edin. </li><li> 2 saat sonra, virüs enfeksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak HR VVL15 enfekte hücrelere 1.0 ug Servisi verici vektör transfekte. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör transfekte edilmiş hücrelerin yerleştirin. </li></ol> 5. Hasat Rekombinant virüs (Gün 4) <ol><li> Adım 4.2 HR mekik donör vektörü ile transfeksiyondan 24 saat sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak nakledilen CV-1 hücreleri ayırmak. kriyotüpe içine hücre süspansiyonu toplayın ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklayın. NOT: derhal dezenfektan ile herhangi bir hücre kültür ortamı Dökülen siliniz ve daha sonra% 70 Ethan ile tekrar silinol. </li></ol> Modifiye VV 6. saflaştırılması (Birinci Tur) <ol><li> 1. günde, her yuva içinde 3 x 10 5 CV-1 hücreleri ile 15 6 oyuklu plakalar tohum. <ol><li> 2. günde, 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde aşama 5.1 dondurulmuş hücre süspansiyonu çözülme ve hücre artıkları çıkarmadan hücre lizatının elde edilmesi için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap. </li></ol></li><li> CV-1 hücreleri, bir 6-yuvalı plaka Enfeksiyon için, DMEM 3 mL hücre lizatının 1 uL seyreltilmiş ve daha önce ortam üzerine, 6 oyuklu plakanın her bir seyreltilmiş hücre lizatı 0.5 mL eklemek mevcut. Adım 6.1 hazırlanan 6-kuyucuğu bulaştırmak. Not: Hücre kalıntılarının çıkarılması gerekli değildir. </li><li> Enfeksiyon iki gün sonra (yani, günde 4), plak konumunu çizerek bir işaretleyici kalem kullanarak plaka altında plaklar 10X objektif lens kullanarak bir floresan mikroskop altında RFP-pozitif plaklar tanımlamak ve etiket. NOT: Daha <stRong&gt; temsilci RFP-pozitif plak Şekil 3. <ol><li> altı farklı RFP pozitif plaklar almak için 200 uL serumsuz DMEM hücre kültür ortamı içeren altı etiketli cryovials hazırlayın. etiketli plaka (lar) (adım 6.3) ile iyice hücre kültür ortamı aspire. Bir P200 pipet 200 uL ucu takın 30 uL seviyesini ayarlamak ve bir cryovial gelen ~ 10 mcL hücre kültür ortamı alır. </li><li> orta bırakmadan pipet itme düğmesini basılı tutun ve bir etiketli plak alan kazımak için ucu kullanın. müstakil hücreleri yukarı kaldırın ve serum serbest DMEM 190 uL içeren cryovial içine aktarmak için pipet itme düğmesini bırakın. </li><li> (Son adımından) çizik hücreleri ile şişeden başka bir 10 uL orta alın ve mümkün olduğunca çok sayıda çizik hücreleri toplamak için aynı RFP-pozitif plak üç kez toplayıp işlemi tekrarlayın. Aynı şişenin içine tüm hücreleri aktarın ve -80 ° C&#39;de şişe saklayın. </ol></li></ol> Modifiye VV 7. saflaştırılması (İkinci Tur) <ol><li> Her birine Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreler, altı 6 oyuklu plakalar ve Kültür 24 saat boyunca hücre. </li><li> 3 dakika için 37 ° C su banyosunda (aşama 6.3.3 arasında) dondurulmuş cryovials çözülme daha sonra hücre lizatı elde etmek için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde cryovials girdap. <ol><li> 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna karma hücre lizatının 0.5 uL ekleyin. Her bir plak, bir 6-yuvalı plaka Infect. 2 gün boyunca% 5 CO2 (ikinci devre plak saflaştırma) ile 37 ° C&#39;de VV enfekte 6 oyuklu inkübe edin. Sonra bölüm 6.3 tekrarlayın. NOT: Daha fazla altı RFP-pozitif plaklar alınabilir; İki ya da daha fazla 6-oyuklu plakalar, her plak saflaştırılması için de kullanılabilir. </li></ol></li></ol> Plak Puri 8. Ek turlarSınıflamasına <ol><li> bir pozitif plak oluşan tüm plaklar mikroskop altında RFP-pozitif gibi görünen kadar 7. adımda açıklanan aynı protokolü takip arınma daha üç beş tur sürdürmektedir. Not: Daha sonra bu plak saf olarak kabul edilir. </li><li> Plak saf kez bölümde 6.3 anlatıldığı gibi (Şekil 4, RFP ifade tüm enfekte hücreler), -80 ° C&#39;de cryovial ve mağaza içine pozitif plak hasat. Aşama 9 ve 10&#39;da tarif edilen protokol izlenerek plak edin. </li></ol> 9. genişletin Saf Plak (ler) <ol><li> Virüs enfeksiyonu önce 6 plaka bir gün her oyuğuna Tohum 3 x 10 5 CV-1 hücreleri. </li><li> Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde 8.2 dondurulmuş cryovial çözülme. CV-1 hücreleri, 6 gözlü bir plakanın bir kuyuya (hücre kalıntıları çıkarmadan) Tüm lisatı, ekleme (adım 9.1 tohumlanmış). 5 ile 37 ° C &#39;de enfekte edilmiş CV-1 hücreleri, inkübeEn fazla 3 gün süreyle% CO 2. <ol><li> Tüm saflaştırılmış plaklar (en az üç plaklar) genişletin. NOT: Bu enfeksiyon uzun lizat virüsün miktarına bağlı olarak 1-3 gün arasında değişir. </li></ol></li><li> % 50&#39;den fazla hücreler mikroskop altında incelendi sitopatik etki gösterirken bir hücre kazıyıcı kullanarak VV-enfekte hücreleri hasat (hücreler kolayca sökülüp ve RFP pozitif yuvarlanır). 15 ml tüp içine hücre kültürü ortamı ile ayrılan hücreler toplanır. <ol><li> 3 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C hücre pelletini tutmak veya adım 10 hemen hücre pelet kullanın. </li></ol></li></ol> PCR kullanarak Mutant VV Modifikasyonu 10. Doğrulama <ol><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak aşama 9.3.1&#39;de hazırlanan hücre topağından VV DNA ekstrakte edin. iki kez damıtılmış su, 200 uL DNA yıkayın. NOT: DNA ayıklamak ve klon doğru modifikasyon / ilavesini içeren olarak doğrulandı ise viral üretim için geri kalanı tutmak için pelet hacminin yarısını kullanın. </li><li> N1L geninin silme ve N1L bölgeye RFP geninin sokulması doğrulanması. <ol><li> N1L gen (L025) ile N1L gen karşı tasarlanan primerler kullanılarak L026 geni kapsayan, bir DNA fragmanını çoğaltmak. RFP-spesifik primerler kullanılarak RFP genini çoğaltmak. A52R-spesifik primerler kullanılarak PCR ile A52R kapsayan bir kontrol DNA fragmanını çoğaltmak. NOT: spesifik primerler için Malzeme Listesine bakınız. <ol><li> PCR master miks kiti kullanılarak PCR gerçekleştirin. en fazla 25 uL DNA şablonu 2 uL kullanılarak PCR reaksiyonunun yer alan 2 dakika süre ile 94 ° C &#39;de, PCR reaksiyonu denatüre ve aşağıdaki adımları PCR 30 döngü çalıştırmak: 15 saniye süreyle 94 ° C&#39; de DNA&#39;yı denatüre ardından tav 15 saniye için 52 ° C &#39;de, DNA şablonları primerler 30 s için 72 ° C&#39;de PCR reaksiyonunu uzanır. </li></ol></li></ol></li><li> Bir% 1 agaroz jeli 33 kullanarak PCR ürünleri giderin. UV jel doc kullanılarak jel görüntü yakalamak. N1L PCR negatif ve A52R ve RFP PCR pozitif iseniz, o plak doğru N1L bölgesinde değiştirilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+base-paired+flip-flop+terminal+loops+link+the+two+DNA+strands+of+the+vaccinia+virus+genome+into+one+uninterrupted+polynucleotide+chain.">Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain.</a> Cell. 28, 315-324 (1982).</li><li>Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brock biology of microorganisms, 9th edn. , (2000).</li><li>Cooney, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+and+immunological+response+to+a+recombinant+vaccinia+virus+vaccine+expressing+HIV+envelope+glycoprotein.">Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein.</a> Lancet. 337, 567-572 (1991).</li><li>Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+recombinants:+expression+of+VSV+genes+and+protective+immunization+of+mice+and+cattle.">Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle.</a> Science. 227, 433-435 (1985).</li><li>Legrand, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+potent+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+by+attenuated+vaccinia+virus+vectors+with+deleted+serpin+genes.">Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes.</a> J Virol. 78, 2770-2779 (2004).</li><li>Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+live+vaccines+by+using+genetically+engineered+poxviruses:+biological+activity+of+recombinant+vaccinia+virus+expressing+influenza+virus+hemagglutinin.">Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin.</a> Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).</li><li>Wiktor, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+rabies+by+a+vaccinia+virus+recombinant+containing+the+rabies+virus+glycoprotein+gene.">Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene.</a> Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).</li><li>Gallucci, S., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danger+signals:+SOS+to+the+immune+system.">Danger signals: SOS to the immune system.</a> Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+model:+a+renewed+sense+of+self.">The danger model: a renewed sense of self.</a> Science. 296, 301-305 (2002).</li><li>Guo, Z. S., Bartlett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+as+a+vector+for+gene+delivery.">Vaccinia as a vector for gene delivery.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).</li><li>Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vectors+for+cancer+immunotherapy.">Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy.</a> Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).</li><li>Tysome, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lister+strain+of+vaccinia+virus+armed+with+endostatin-angiostatin+fusion+gene+as+a+novel+therapeutic+agent+for+human+pancreatic+cancer.">Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer.</a> Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).</li><li>Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+poxvirus+oncolytic+effects+through+increased+spread+and+immune+evasion.">Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion.</a> Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).</li><li>Park, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+poxviruses+as+cloning+vectors:+insertion+of+the+thymidine+kinase+gene+from+herpes+simplex+virus+into+the+DNA+of+infectious+vaccinia+virus.">Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus.</a> Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> J Virol. 61, 1788-1795 (1987).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).</li><li>Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+that+are+associated+with+DNA+repeats+in+prokaryotes.">Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.</a> Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes.">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Cas9+endonucleases+reveal+RNA-mediated+conformational+activation.">Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation.</a> Science. 343, 1247997 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing.">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156, 836-843 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Res. 24, 122-125 (2014).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> J Virol. 89, 5176-5179 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9.">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).</li><li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation:+recombination-independent+selectable+cloning+vectors.">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li><li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper.">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li><li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li></ol>

Authors have no competing financial interests.

tedavi amaçlı VV değişiklik ile ilgili olarak iki ana amacı vardır. Bu tür bir anti-tümör terapötik kullanım için virüs azaltmak için timidin kinaz (TK) geni gibi, belirli bir gen silme etmektir. Diğer (GM-CSF gibi) arzu edilen bir terapötik gen ya da (örneğin, lusiferaz geni gibi) bir işaretleyici gen ile VV kol etmektir. Bunlardan birini başarılması bir hedef bölge / genin silinmesini gerektirir. Bir doğrudan DNA ligasyonu yöntemi 35 ve bir in vitro paketleme yöntemi 36 TK geni modifikasyonları mutant vaccinia virüsleri üretmek için daha önce kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler, bağlı genom arasında benzersiz restriksiyon enzimi bölgeleri eksikliğine genomunda başka bölgelerde mutasyon ile ilgili kısıtlı uygulanma olanakları vardır. Mutant VV oluşturmak için mevcut bir yaklaşım, homolog rekombinasyon incorporati endüklemek üzere iki saat VV ile enfeksiyondan sonra CV-1 hücrelerinde bir seçim işaretleyici (RFP veya GFP) ile mekik (donör) vektörünün transfeksiyonu kapsarHedef bölgeye seçim markerini ng. Marker-pozitif plak seçimi saflaştırılması 24 saat sonra transfeksiyonu ile takip edilir. plak saflaştırma işlemi, 10 mermi kadar sürebilir son 3-4 hafta ve genellikle kapalı hedef bölgelerde takılı seçim işaretleri ile istenmeyen rekombinant virüslerin neden olabilir. DNA, iki iplikçikli kırılmalar etkili memeli hücrelerinde 37 homolog rekombinasyona neden olabilir, ve bu mekanizma yararlanarak, mutan VV üretme verimi büyük ölçüde geliştirilebilir. GRNA eşliğinde Cas9 sistemi başarılı bir şekilde genom düzenleme çalışan ve 25, ökaryotik organizmalar 22 homolog rekombinasyon verimliliği arttırır edilmiştir. Son zamanlarda, konakçı hücreler, herpes simpleks virüsü gRNA güdümlü Cas9 tarafından düzenlendiği bir adenovirüs ve tip genleri sistem 24. En son CRISPR yer Cas9 sistemi etkin bir şekilde W genomuna düzenleme ve ifade etmek için bir VV vektörünün elde edilmesi için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirÖzellikle geni. Her iki N1L gRNA güdümlü Cas9 ve geleneksel homolog rekombinasyon (HR) yöntemi N1L aynı hedef bölgeye başarılı İK etkinlikleri sonuçlandı. İlginç bir şekilde, bununla birlikte, geleneksel sıcak yöntem daha verimliliği çok daha yüksek seviyelerde Cas9 neden HR gRNA eşliğinde. Bu nedenle, gRNA güdümlü Cas9 kullanımı mutan VVS elde etmek için çok sayıda plak saflaştırılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu çalışmada, önemli ölçüde gRNA güdümlü Cas9 sistemi 33 kullanılarak mutant VV üretimi için verimlilik ve zaman çerçevesi geliştirmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, benzer bir yeniden birleştirme yüksek verim elde etmek için bir kritik adım geleneksel homolog rekombinasyon gerçekleştirmeden önce 24 saat boyunca Cas9 ve gRNA ifade eden plasmidler ile CV-1 hücrelerini transfekte etmektir. 24 saat aralığı Cas9 ve gRNA makul bir düzeyde ifade edilmesini sağlar. Farklı gRNA t dizileri tespit Dahası, belirli bir geni hedef gRNA sekansı optimize edilmesi gerekebilirargeting N1L geni verimliliklerinin 33, 34 değişiyordu. düzenleme VV CRISPR / Cas9 için sınırlama rekombinasyon ilk turda RFP-pozitif plaklar düşük oranıdır. sıkıcı tarama ilk tur yapar rekombinant virüs içeren TTT pozitif plaklar yeterli sayıda, genellikle en az on 6 oyuklu plakalar ihtiyaç vardır, elde etmek için. Bu nedenle, bu sınırlamayı aşmak için protokol optimize etmek için bir ihtiyaç vardır. TTT pozitif plaklar küçük boyutlu 6 oyuklu plaka enfekte etmek için kullanılan lizat bir yoğunluğu nedeniyle bir başka olası sorun vardır. Bunun üstesinden gelmek için, lizat daha az miktarda daha büyük bir boyutu TTT-pozitif plaka elde etmek için bir 6-yuvalı plaka enfekte etmek için kullanılır. Lizat daha küçük bir hacmi kullanılması da TTT negatif olanlar TTT pozitif plaklar daha ayrılması için sağlayacaktır. Sonuç olarak plak arınma az mermi saf RFP-pozitif plaklar almaları gerekmektedir. <petkiler her zaman gen düzenleme istenmeyen bir sorunu vardır Off-hedefe class = &quot;jove_content&quot;&gt;. CRISPR-Cas9 off-hedef etkilerini göstermiştir. VV 33, 34 genomları düzenlerken Ancak, gRNA dikkatli tasarımı ile, hedef dışı etkileri önlenebilir. Bu VV genomu düzenleme için gRNA eşliğinde Cas9 sistemini kullanarak özel bir şeydir. biyomedikal araştırmalar ve translasyonel tıpta mutant VVS gelişimini hızlandıracak CRISPR / Cas9 sistemini kullanarak, VV vaatlerde. Buna ek olarak, böyle bir sistem aynı zamanda onun aktin esaslı hareketlilik için VV tarafından kullanılan sinyal yollarının diseksiyonu olarak hücre biyolojisinde keşifler, hızlandırmak olacaktır.

Vaccinia virüsü (VV) poksvirüs ailesine ait zarflı bir DNA virüsüdür ve çiçek eradikasyon tıpta büyük başarılarından biri çok önemli bir rol oynamıştır. Çiçek sonrası eradikasyon dönemde, VV VV vektörleri içine çeşitli patojenlerden genleri ekleyerek HIV ve diğer bulaşıcı hastalıklara karşı aşılar 1-7 genlerini sunmak için bir vektör olarak geliştirilmiştir. VV Ayrıca, bilhassa, tümör hedefli replike onkolitik vaccinia virüsü geliştirilmesi için kanser immünoterapisi 8-14 için bir vektör olarak kullanılmıştır. kanser hücreleri için geliştirilmiş seçiciliğe sahip etkili bir aşı maddesine vektörü oluşturmak için, viral genom içinde modifikasyonlar geni delesyonu veya terapötik genlerin katılmasıyla da dahil olmak üzere, gerekmektedir. DNA teknolojisinin gelişmesi ve VV içine moleküler biyoloji ve viroloji, yabancı DNA&#39;nın yerleştirilmesi daha iyi anlaşılması ile başlangıçta elde edildid 1980&#39;lerde 15 homolog rekombinasyon (HR) kullanarak. Bu yöntem hala VV vektörleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılan olduğunu. genetik modifikasyon giriş önceden enfekte edilmiş hücrelerde VV genom ile birleşir HR, bir mekik vektörü, kullanılarak elde edilir. Bununla birlikte, bu yöntem, (% 1&#39;den daha az homolog rekombinasyon verimliliği 16) son derece verimsiz olduğu kanıtlanmıştır ve genellikle hedeflenmemiş bölgeler ve / veya virüs genişlemesi üzerine, markör kaybı içine seçim işaretleyicinin rastgele ekleme ile sonuçlanmaktadır. Genomik lokuslar ekzojen DNA sokulması için DNA homolog rekombinasyon verimliliği önemli ölçüde çift iplikli kırılmalara (DSBs) 17 mevcudiyetinde arttırılabilir. Bu nedenle, hedef lokusların DSBs uyarabilir teknoloji VV genom mühendisliği için büyük bir potansiyele sahiptir. Son zamanlarda geliştirilen CRISPR-Cas9 sistemin herhangi VV gen bölgesinde DSBs tetiklenmesi için umut vermektedir. CRISPR-Cas9 bir RNA olanişgalci fajlar ve diğer yabancı genetik materyallerin 18-20 karşı adaptif bağışıklık katılan güdümlü nükleaz. Mikrobiyal türlerin 21, bir dizi üç CRISPR-Cas sistemleri vardır. tip II CRISPR-Cas sistemi yaygın ökaryotik hücreler ve büyük virüs genomunu düzenlemek için kullanılır. Bu (Streptococcus pyogenes den), RNA yönlendirmeli Cas9 endonükleaz oluşur tek bir kılavuz RNA (sgRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) 22-24. Cas9 / sgRNA kompleks bir memeli hücre 22 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer bitişik motifi (PAM) sekansı, 23, önceki tamamlayıcı 20 nükleotid genomik dizisini tanır. Başarıyla genetik olarak tadil edilmiş hücreler, virüsler etkin üretimi için kullanılmaktadır ve hayvan modelleri 22-32. CRISPR-Cas9 sistemi VV sitoplazmasında homolog rekombinasyon ile birlikte hedef genom için etkin bir araç olduğu kanıtlanmıştır CV-1 hücre enfekte olans mutant aşı virüsleri 33, 34 oluşturmak için. Bu yöntemin potansiyel uygulama uzatmak için, biz bu sistemin metodolojisi hakkında detaylı bilgi sunmak. Açıklanan protokol, belirli bir geni delesyonu ile bir mutan VV oluşturmak ve / veya terapötik bir transgen mutant virüs kol için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Plasmid #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA cloning vector</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 cloning vector</td></tr><tr><td>pGEMT easy</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>repair donor vector cloning</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>C4040-10</td><td>Invitrogen</td><td>transformation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>27106</td><td>Qiagen</td><td>plasmid extraction</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>cell culture serum</td></tr><tr><td>penicillin, streptomycin</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>antibiotics</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>transfection</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0&amp;nbsp;mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>collect virus</td></tr><tr><td>fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus BX51 Fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>find RFP-positive plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Thermo Scientific</td><td>PCR reagent</td></tr><tr><td>10 cm culture dish</td><td>Z688819-6EA</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Z707759</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>C5981</td><td>sigma</td><td>scrap cells</td></tr><tr><td>1x Trypsin-EDTA solution</td><td>T4299</td><td>sigma</td><td>trypsinize cells</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfectant</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5&amp;rsquo;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>N1L reverse&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#039;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R forward 5&amp;rsquo;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R reverse 5&amp;rsquo;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP forward 5&amp;rsquo;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP reverse 5&amp;rsquo;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR product</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Yeni bir VV vektörünün kurulması için, önemli bir başlangıç ​​noktası tasarım ve genomun belirli bir bölgeyi bir verici mekik vektörü inşa etmektir. Bu çalışmada, VV N1L geni örnek hedef olarak kullanıldı. Rekombinasyon ve VV hedef bölge için donör mekik vektörüne kaset Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir., Homolog rekombinasyon etkinliğini artırmak amacıyla, Cas9 ve N1L özgü gRNA ifade eden plasmidler CV birlikte-transfekte edilmiştir homolog rekombinasyon 33 gerçekleştirmeden 48 saat önce -1 hücreleri. Bir gün (24 saat) post-transfeksiyon, RFP CV-1 hücrelerinde (Şekil 2) olarak ifade edildi. Homolog rekombinasyon gelen bütün lizat (aşama 5) CV-1 hücre enfeksiyonundan sonra, pozitif bir TTT-negatif plaklar iki CV-1 hücrelerinde (Şekil 3) tespit edilmiştir. arıtma protokolü tarif ardından, saf bir plak ko<html> arınma 3-5 turdan sonra elde edilebilir uld. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, mutant vaccinia virüsü ile saf plak türetilen hücre lizatı ile enfeksiyondan sonra tüm plaklar bir RFP sinyal verdi. Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, VV doğru gen modifikasyon da saf mutan, PCR, hedef N1L geninin olmadığını teyit etmek için kullanıldı olup olmadığını doğrulamak için. Modifiye virüs PCR RFP bir pozitif sinyal ve N1L için mevcut sinyal (gösterdi Şekil 5, şerit AG), sağlam bir N1L bölge ile kontrol virüsü (TO) için N1L PCR sonuçları olumlu ise. A52R kontrol DNA fragmanları, tüm rekombinant virüs ve Ctr virüsü pozitif bulunmuştur. RFP-pozitif plaklar İK verimliliği bu deneyde (önceki çalışmalarında 34 kadar% 94 idi)% 100 (6/6) &#39;dir. Burada tarif edilen metod, geleneksel protokollere 33, 34 oranla daha fazla 100 misli rekombinasyon verimliliği geliştirdi. içerik &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Şekil 1:., Homolog rekombinasyon için donör Servisi vektör kaseti ve W genomuna hedef bölgesi saflaştırma marker geni RFP H5 promotör ile tahrik edilir. RFP geninde N1L bölgesi sonucu hedef onarım verici vektör, homolog rekombinasyon sonrası N1L bölgesine dahil edilmiştir. &#39;X&#39; aşı virüsü genomu aynı diziyi yerini alacak tamir donör vektörü homolog sırasını gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Şekil 2:. Aften homolog rekombinasyon sonrası CV-1 hücreleri, bir gün Görüntüleme bir günr homolog rekombinasyon, onarım donör vektörle VV ile enfekte ve transfekte hücreler RFP-pozitif A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan mikroskobu görüntüsü (orijinal büyütme 100X). Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Şekil 3:. Mutant virüs ilk turda saflaştırma bir RFP-pozitif plak mutant virüs ilk tur saflaştırma, hedef bölge silme ile RFP pozitif plak (kırmızı çizgi ile çember) tarafından oluşturulan plaklar ile çevrilidir vahşi (sarı çizgi ile çember) tipi virüsü A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan microscopy görüntü (orijinal büyütme 100X). Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Şekil 4:. VV arınma 3-5 tur sonra, saf plaklar tüm plaklar olarak elde edildi saf mutant RFP-pozitif A:. Faz kontrastlı görüntü (orijinal büyütme 100X) B:. Floresan mikroskobu görüntüsü (orijinal büyütme 100X) . Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Şekil 5: VerificatioVV elde edildi, saf mutan VV. DNA N, CV-1 hücrelerini enfekte. N1L N1L primerler kullanılarak PCR ile doğrulanmıştır hedef bölgesinin silinmesi, N1L bölgeye RFP yerleştirme RFP primerler kullanılarak PCR ile onaylandı. Lanes AF altı saflaştırılmış plaklar karşılık, şerit G önceki çalışmalarda 33 doğrulandı N1L silinmesi ile kontrol plak, şerit Ctr (kontrol) (N1L bölge bozulmamış) vahşi tip aşı virüsüdür. A52R gen tüm örnekler için kontrol geni olarak çoğaltıldı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Görüntüleme.  Queen Mary University of London.  Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır. 

Video: A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Kanser Araştırmaları

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Nörobilim

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları & VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi