Name: a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

1. Preparazione di Target RNA e Cas9 costrutti e riparazione donatore vettore <ol><li> Clonazione di gRNAs <ol><li> Progettare una guida-RNA sequenza bersaglio mira il gene N1L di virus del vaccino seguendo il principio affermato in precedenza 25. Allineare la sequenza bersaglio guida-RNA contro il genoma del virus del vaccino (in questo caso, Lister ceppo di virus del vaccino) per escludere eventuali sequenze bersaglio gRNA centra la porta. </li><li> Sintetizzare e clonare oligos gRNA in un vettore di clonaggio gRNA come descritto in precedenza 25. Confermare la sequenza di ogni singolo gRNA nel vettore risultante dal sequenziamento Sanger 33. Nome risultante gRNA costruire come gRNA N2 33. NOTA: Il sito target gRNA è all&#39;interno del gene N1L, ed è nella regione tra il braccio sinistro e il braccio destro che le coperture vettore riparazione donatori (vedi Figura 1). </li></ol></li><li> Clonare il gene Cas9 manca il segnale di localizzazione nucleare (NLS) nelpST1374 vettoriale e designare il costrutto come PST-Cas9 33. NOTA: Qualsiasi mammiferi espressione vettore di clonaggio può essere utilizzato per la costruzione del vettore di espressione Cas9. </li><li> Costruzione di vettore di riparazione dei donatori per HR <ol><li> Utilizzare il gene N1L di VV come la regione di destinazione per la modifica 33. Assicurarsi che le lunghezze dei bracci destro e sinistro sono circa 500-600 bp ciascuno, e che fiancheggia la regione di destinazione. NOTA: Il braccio / braccio destro sinistro può avere fino a 50 bp sovrapposizione con la regione di destinazione (vedi figura 1). </li><li> Clonare la regione di riparazione vettore donatore N1L come descritto in precedenza 33, 34 e designare il vettore donatore di riparazione come PT-N1L. NOTA: Vedere la Figura 1 per il vettore di riparazione donatore e la sua regione di destinazione. Altre regioni del VV possono essere mirati utilizzando regione (gene) SPECIFICI gRNA (s) e vettoriale riparazione donatore specifici per regione. Qualsiasi vettore di clonaggio può essere utilizzato per la costruzione del vettore riparazione donatore. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> L&#39;espansione del plasmide <ol><li> Trasformare il plasmide in E. chimicamente competente coli secondo le istruzioni del produttore. Purificare il plasmide usando un kit di estrazione plasmide riferimento al protocollo fornito dal produttore. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule Semina (Giorno 1) <ol><li> Mantenere CV-1 cellule (fibroblasti di rene di scimmia) in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS), 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / streptomicina mL, a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Trypsinize CV-1 le cellule che sono 80-90% confluenti <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura cellulare dal pallone T-175 contenenti cellule CV-1. Risciacquare il monostrato con 5 ml di PBS sterile per rimuovere il siero residuo e aspirare il PBS. Aggiungere 2,5 mL di soluzione 1 × tripsina-EDTA per coprire le cellule e mettere il pallone in 37 ° C incubatore per circa 5 minuti per aiutare il distacco delle cellule. </li><li> Aggiungere10 ml di terreno di coltura cellulare (vedi punto 2.1) di sospendere le cellule delicata azione pipetta. Contare le numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Semina cellule in 6 pozzetti <ol><li> Seed 2 × 10 5 CV-1 cellule in 2 ml di mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti il giorno prima della transfezione. NOTA: Un passo ulteriore centrifugazione per rimuovere tripsina non è richiesta. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trasfezione di Cas9 plasmidi e gRNA plasmidi (2 ° giorno) <ol><li> Trasfezione CV-1 le cellule (previste al punto 2.2.3.1) con 0,5 mcg PST-Cas9 plasmide e 0,5 mg gRNA N2 plasmide usando un reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Incubare le cellule per 24 h in un incubatore (37 ° C con 5% CO 2), e quindi sostituire il mezzo con 2 ml di terreno di coltura cellulare fresca (descritto nel passaggio 2.1). </li></ol> 4. L&#39;infezione di CV-1 le cellule e navetta donatore Vettore Transfection per HR (3 ° giorno) <ol><li> Diluire il virus VVL15 backbone con terreno di coltura cellulare DMEM ad una concentrazione di 2 x 10 5 pfu / ml. 24 ore dopo la trasfezione di Cas9 e gRNA plasmidi, aggiungere 100 ml di virus diluito in ciascun pozzetto del CV-1 cellule transfettate. </li><li> infezioni post-virus di 2 h, trasfezione 1,0 mcg navetta vettore nelle cellule del donatore VVL15 infette per HR utilizzando un reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. Collocare le cellule trasfettate in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 per 24 h. </li></ol> 5. raccogliere il virus ricombinante (4 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore di trasfezione con il vettore shuttle donatori per HR nella fase 4.2, staccare le cellule trasfettate CV-1 con un raschietto cellulare. Raccogliere la sospensione cellulare in un esageratamente e conservare a -80 ° C per un uso futuro. NOTA: Rimuovere eventuali fuoriuscite di coltura cellulare di media con un disinfettante immediatamente e quindi pulire di nuovo con il 70% Ethanolo. </li></ol> 6. Purificazione della VV Modified (primo turno) <ol><li> Il giorno 1, seminare 15 6 pozzetti con 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto. <ol><li> Il giorno 2, scongelare la sospensione di cellule congelate dal punto 5.1 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 3 min e agitare le cryovials vigorosamente per 30 s per ottenere lisato cellulare senza rimuovere detriti cellulari. </li></ol></li><li> Per l&#39;infezione di una piastra da 6 pozzetti di CV-1 cellule, diluire 1 ml di lisato cellulare con 3 ml di DMEM e aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare diluita in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti, sulla parte superiore del supporto già presente. Infettare tutti i 6 pozzetti previste al punto 6.1. NOTA: La rimozione di detriti cellulari non è necessaria. </li><li> Dopo due giorni di infezione (vale a dire, il giorno 4), identificare le placche RFP-positivi sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando 10X lente obiettiva ed etichettare le placche sotto la piastra utilizzando un pennarello cerchiando la posizione della placca. NOTA: Vedere <strong&gt; Figura 3 per rappresentante placca RFP-positivo. <ol><li> Preparare sei cryovials etichettati contenenti 200 microlitri DMEM mezzo di coltura cellulare senza siero per raccogliere sei diverse placche RFP-positivo. Aspirare il terreno di coltura cellulare dal pozzo con targa marcato (s) (passo 6.3). Fissare una punta di 200 microlitri di una pipetta P200, impostare il volume a 30 ml e prendere ~ 10 microlitri terreno di coltura cellulare da un esageratamente. </li><li> Tenere premuto il pulsante pipetta spinta senza rilasciare il medio e utilizzare la punta di graffiare la superficie di una placca etichettati. Rilasciare il tasto pipetta spinta per sollevare le cellule staccate e trasferirlo nel esageratamente contenente 190 ml di DMEM senza siero. </li><li> Prendere un altro 10 microlitri di media dalla fiala con le cellule graffiati (da ultimo passo) e ripetere la procedura di prendere in mano la stessa RFP-positivo targa tre volte quello di raccogliere il maggior numero di cellule graffiati possibile. Trasferire tutte le celle nella stessa fiala e conservare il flacone a -80 ° C. </ol></li></ol> 7. Purificazione della VV Modified (secondo turno) <ol><li> Seed 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto di sei 6 pozzetti e la cultura le cellule per 24 h. </li><li> Scongelare i cryovials congelati (dal punto 6.3.3) a 37 ° C bagnomaria per 3 minuti, poi vortice i cryovials vigorosamente per 30 secondi per ottenere lisato cellulare. <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare mista ad un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Infettare un 6-pozzetti per ogni placca. Incubare le piastre 6 pozzetti VV-infettati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 giorni (Seconda purificazione placca turno). Quindi ripetere paragrafo 6.3. NOTA: Più di sei placche RFP-positivi possono essere ritirati; due o più piastre da 6 pozzetti possono essere utilizzati per la purificazione di ogni placca. </li></ol></li></ol> 8. cicli di placca Purizione <ol><li> Continuare altri tre a cinque cicli di purificazione seguendo lo stesso protocollo descritto nel passaggio 7 finché tutte le placche formate da una placca positiva sembrano essere RFP-positive al microscopio. NOTA: Questa targa, allora è considerato puro. </li><li> Una volta che la placca è pura (figura 4, tutte le cellule infette che esprimono RFP), raccogliere una targa positivo in un esageratamente e conservare a -80 ° C, come descritto nel paragrafo 6.3. Verificare la placca secondo il protocollo descritto nella fase 9 e 10. </li></ol> 9. Espandere la placca purificata (s) <ol><li> Seed 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto di un 6-pozzetti un giorno prima infezione da virus. </li><li> Scongelare il esageratamente congelata da 8,2 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 3 minuti per ottenere lisato cellulare. Aggiungere tutto il lisato (senza rimuovere i detriti cellulari) in un pozzetto di un 6-pozzetti di CV-1 le cellule (testa di serie nella fase 9.1). Incubare il CV-1 le cellule infette a 37 ° C con 5% CO 2 per 3 giorni. <ol><li> Espandere tutte le targhe pulite (almeno tre placche). NOTA: Il tempo di infezione varia da 1-3 giorni a seconda della quantità di virus nel lisato. </li></ol></li><li> Raccogliere le cellule VV-infettate con un raschietto cellulare quando più di 50 cellule% mostrano effetto citopatico osservato al microscopio (le cellule sono arrotondati, facilmente distaccato e RFP positivo). Raccogliere le cellule staccate insieme con mezzo di coltura cellulare in una provetta da 15 ml. <ol><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 g per 3 min. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet cellulare a -80 ° C fino all&#39;utilizzo o utilizzare il pellet cellulare immediatamente passaggio 10. </li></ol></li></ol> 10. Verifica della modifica di Mutant VV Usando PCR <ol><li> Estratto VV DNA dal pellet cellulare preparato al punto 9.3.1 utilizzando un kit di estrazione del DNA seguendo il protocollo del produttore. Eluire il DNA con 200 ml di acqua bidistillata. NOTA: utilizzare metà del volume del pellet per estrarre DNA e tenere il resto per la produzione virale se il clone è verificato come contenente la corretta modifica / inserimento. </li><li> Verifica della delezione del gene N1L e l&#39;inserimento di geni RFP nella regione N1L. <ol><li> Amplificare un frammento di DNA che attraversa il gene N1L (L025) e la L026 gene utilizzando primer disegnati contro il gene N1L. Amplificare il gene RFP utilizzando primer specifico d&#39;RFP. Amplificare un frammento di DNA di controllo si estende A52R mediante PCR utilizzando primer specifici A52R. NOTA: vedere elenco dei materiali per primer specifici. <ol><li> Eseguire la PCR utilizzando un kit master mix PCR. Impostare 25 microlitri di reazione PCR utilizzando 2 ml di DNA stampo, denaturare la reazione di PCR a 94 ° C per 2 minuti, e quindi eseguire 30 cicli di PCR seguendo questi passaggi: denaturare il DNA a 94 ° C per 15 s, poi ricottura i primer ai modelli di DNA a 52 ° C per 15 s estendono la reazione PCR a 72 ° C per 30 s. </li></ol></li></ol></li><li> Risolvere i prodotti di PCR utilizzando un gel 1% 33. Acquisire l&#39;immagine del gel utilizzando un documento di gel UV. Se il N1L PCR è negativo e A52R e RFP PCR sono positivi, allora la placca viene correttamente modificata nella regione N1L. </li></ol>

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Authors have no competing financial interests.

Ci sono due obiettivi principali di modifica della VV a fini terapeutici. Uno è quello di eliminare un particolare gene, come il gene della timidina chinasi (TK) per attenuare virus per antitumorale uso terapeutico. L&#39;altro è di armare VV con un gene desiderato terapeutico (come GM-CSF) o un gene marcatore (ad esempio gene luciferasi). Il raggiungimento di uno di questi comporta la soppressione di una regione bersaglio / gene. Un metodo di legatura del DNA diretto 35 e un metodo in vitro confezione 36 sono state usate in precedenza per generare virus vaccinia mutanti con modifiche gene TK. Tuttavia, questi metodi hanno limitato l&#39;applicazione relativa mutazione altre regioni del genoma a causa della mancanza di siti di enzimi di restrizione unici in tutto il genoma. L&#39;attuale approccio per la creazione di VV mutante comporta trasfezione di un vettore shuttle (donatore) con un indicatore di selezione (RFP o GFP) in CV-1 le cellule due ore dopo l&#39;infezione con VV per indurre una incorporati ricombinazione omologang il marcatore di selezione nella regione di destinazione. Selezione di placche marcatori positivi è seguito da loro purificazione 24 h post-trasfezione. Il processo di purificazione placca può durare fino a 10 giri, ultime 3-4 settimane e spesso porta a virus ricombinanti indesiderate con marcatori di selezione inseriti nelle regioni fuori bersaglio. DNA rotture del doppio filamento possono indurre efficacemente ricombinazione omologa in cellule di mammifero 37, e sfruttando questo meccanismo, l&#39;efficienza di generazione VV mutante possono essere notevolmente migliorate. Il sistema Cas9 gRNA-guidato è stato impiegato con successo in editing genoma e migliora l&#39;efficienza di ricombinazione omologa in organismi eucarioti 22, 25. Recentemente, in cellule ospiti il genoma di adenovirus e tipo I virus dell&#39;herpes simplex è stato curato dal Cas9 gRNA-guidata sistema 24. E &#39;stato recentemente dimostrato che il sistema CRISPR Cas9 è un potente strumento per la modifica in modo efficiente il genoma VV e la costruzione di un vettore VV per esprimere unparticolare gene. Sia il metodo tradizionale ricombinazione omologa (HR) Cas9 N1L gRNA-guidato e portato a eventi HR di successo nello stesso sito di destinazione di N1L. È interessante notare, tuttavia gRNA guidato Cas9 HR indotta a livelli molto più elevati di efficienza rispetto al metodo tradizionale HR. Pertanto, l&#39;uso di Cas9 gRNA guidata elimina la necessità di purificare altrettanti placche avere VVs mutanti. In questo lavoro, abbiamo migliorato significativamente l&#39;efficienza e la lasso di tempo per la generazione di VV mutante utilizzando il sistema gRNA guidato Cas9 33. Da segnalare, un passo fondamentale per l&#39;ottenimento di una elevata efficienza della ricombinazione omologa è trasfezione le cellule CV-1 con i plasmidi che esprimono Cas9 e la gRNA per 24 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa convenzionale. L&#39;intervallo di 24 ore permette Cas9 e gRNA ad essere espressi ad un livello ragionevole. Inoltre, potrebbe essere necessario ottimizzare la sequenza gRNA mira un particolare gene, come abbiamo scoperto che il diverso gRNA sequenze targeting N1L gene variato nella loro efficienza 33, 34. La limitazione per il CRISPR / Cas9 in editing VV è il basso tasso di placche RFP-positivo nel primo turno di ricombinazione. Per ottenere un numero sufficiente di placche RFP-positivi contenenti virus ricombinante, di solito almeno una decina sono necessari 6 pozzetti, che rende al primo round di screening noioso. Quindi, vi è ancora la necessità di ottimizzare il protocollo per superare questa limitazione. La piccola dimensione delle placche RFP-positivo è un altro problema potenziale, che è causa di un elevato volume di lisato utilizzato per infettare una piastra da 6 pozzetti. Per ovviare a questo, un minor volume di lisato deve essere usato per infettare una piastra da 6 pozzetti per ottenere dimensioni più grandi placche RFP-positive. Utilizzando un minor volume di lisato consentirà anche una migliore separazione delle placche RFP-positivi da quelli RFP-negativo. Di conseguenza, un minor numero di giri di purificazione placca devono ottenere placche puri RFP-positivo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-bersaglio effetti sono sempre un problema indesiderato in editing gene. CRISPR-Cas9 ha mostrato effetti off-target. Tuttavia, con un&#39;attenta progettazione di gRNA, fuori bersaglio effetti possono essere evitati quando si modifica la VV genomi 33, 34. Questo è il particolare vantaggio di utilizzare il sistema di Cas9 gRNA-guida per modificare il genoma di VV. Date le promesse di VV, utilizzando il sistema CRISPR / Cas9 accelererà lo sviluppo di VVs mutanti per la ricerca biomedica e nella medicina traslazionale. Inoltre, un simile sistema è inoltre accelerare scoperte in biologia cellulare, come dissezione delle vie di segnalazione utilizzati da VV per la sua motilità actina-based.

virus vaccinico (VV) è un virus a DNA con involucro appartenente alla famiglia poxvirus e ha svolto un ruolo cruciale in uno dei più grandi successi nel campo della medicina della eradicazione del vaiolo. Nell&#39;era post-eradicazione del vaiolo, VV è stato sviluppato come un vettore per la consegna di geni per i vaccini contro l&#39;HIV e altre malattie infettive 1-7 con l&#39;inserimento di geni provenienti da vari agenti patogeni in vettori VV. VV è anche stato ampiamente utilizzato come vettore per l&#39;immunoterapia del cancro 8-14 particolare per lo sviluppo del virus vaccinia oncolytic tumore targeting replica. Al fine di creare un vettore di vaccino efficace con migliorata selettività per le cellule tumorali, sono necessarie modifiche all&#39;interno del genoma virale, compresa gene delezioni o introduzione di geni terapeutici. Con lo sviluppo della tecnologia del DNA e una migliore comprensione della biologia molecolare e virologia, inserimento di DNA estraneo in VV originariamente conseguired utilizzando la ricombinazione omologa (HR) nel 1980 15. Questo metodo è ancora ampiamente utilizzato per la costruzione di vettori VV. Introduzione della modificazione genetica si ottiene utilizzando un vettore shuttle HR, che ricombina con il genoma VV di cellule pre-infettate. Tuttavia, questo metodo ha dimostrato di essere altamente inefficiente (meno dell&#39;1% dell&#39;efficienza ricombinazione omologa 16) e si traduce spesso in inserzione casuale del marcatore di selezione in regioni e / o perdita del marcatore all&#39;espansione virus non mirati. L&#39;efficienza del DNA ricombinazione omologa per l&#39;inserimento del DNA esogeno in loci genomici può essere notevolmente migliorata in presenza di rotture del doppio filamento (DSB) 17. Pertanto, la tecnologia che può indurre a DSB loci bersaglio ha un grande potenziale per l&#39;ingegneria del genoma di VV. Il sistema CRISPR-Cas9 recentemente sviluppato mostra la promessa per l&#39;attivazione DSB in qualsiasi regione del gene VV. CRISPR-Cas9 è un RNAnucleasi guidata coinvolti nella immunità adattativa contro fagi invasori e altri materiali genetici estranei 18-20. Ci sono tre sistemi CRISPR-Cas in una vasta gamma di specie microbiche 21. Il sistema CRISPR-Cas tipo II è ampiamente usato per modificare il genoma delle cellule eucariotiche e grandi virus. Si tratta del Cas9 endonucleasi RNA-guida (da Streptococcus pyogenes), una sola guida di RNA (sgRNA) e la trans-attivazione crRNA (tracrRNA) 22-24. Il complesso Cas9 / sgRNA riconosce l&#39;complementare 20-nucleotide sequenza genomica che precede una sequenza 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer motivo adiacente (PAM) in cellule di mammifero 22, 23. E&#39; stato usato con successo per un efficace generazione di cellule geneticamente modificate, virus e modelli animali 22-32. Il sistema CRISPR-Cas9 ha dimostrato di essere uno strumento efficace per il targeting genoma in combinazione con ricombinazione omologa nel citoplasma della cellula infettata VV CV-1s per generare virus vaccinia mutanti 33, 34. Al fine di estendere il potenziale applicazione di questo metodo, vi presentiamo informazioni dettagliate sulla metodologia di questo sistema. Il protocollo descritto può essere usato per creare un VV mutante con un particolare gene delezione e / o un braccio il virus mutante con un transgene terapeutico.

<table><tbody><tr><td>Plasmid #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA cloning vector</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 cloning vector</td></tr><tr><td>pGEMT easy</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>repair donor vector cloning</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>C4040-10</td><td>Invitrogen</td><td>transformation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>27106</td><td>Qiagen</td><td>plasmid extraction</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>cell culture serum</td></tr><tr><td>penicillin, streptomycin</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>antibiotics</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>transfection</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0&amp;nbsp;mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>collect virus</td></tr><tr><td>fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus BX51 Fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>find RFP-positive plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Thermo Scientific</td><td>PCR reagent</td></tr><tr><td>10 cm culture dish</td><td>Z688819-6EA</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Z707759</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>C5981</td><td>sigma</td><td>scrap cells</td></tr><tr><td>1x Trypsin-EDTA solution</td><td>T4299</td><td>sigma</td><td>trypsinize cells</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfectant</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5&amp;rsquo;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>N1L reverse&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#039;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R forward 5&amp;rsquo;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R reverse 5&amp;rsquo;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP forward 5&amp;rsquo;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP reverse 5&amp;rsquo;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR product</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Per la costruzione di un nuovo vettore VV, il punto di partenza fondamentale è quello di progettare e costruire un vettore shuttle donatore che può avere come bersaglio una particolare regione del genoma. In questo studio, il gene VV N1L stato usato come bersaglio esempio. La cassetta del vettore shuttle donatori per la ricombinazione e la regione mirato nel VV sono mostrati in Figura 1. Al fine di migliorare l&#39;efficienza della ricombinazione omologa, plasmidi esprimenti Cas9 e N1L specifico gRNA state co-trasfettate in CV -1 celle 48 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa 33. Un giorno (24 ore) post-trasfezione, RFP è stata espressa in cellule CV-1 (Figura 2). Dopo infezione di CV-1 cellule con l&#39;intero lisato dalla ricombinazione omologa (fase 5), RFP-positivi e placche negativi sono stati osservati sia nelle cellule CV-1 (Figura 3). A seguito del protocollo di purificazione descritto, una targa co puro<html> ULD essere ottenuto dopo 3-5 giri di purificazione. Come mostrato in figura 4, tutti placche dopo l&#39;infezione con lisato cellulare derivata da una placca puro con il virus vaccinia mutante presentato un segnale RFP. Per verificare se il mutante puro VV aveva modificazione genetica corretta, la PCR è stata utilizzata per confermare l&#39;assenza del gene N1L bersaglio, come mostrato in Figura 5. PCR del virus modificato ha mostrato un segnale positivo per RFP e un segnale assente per N1L ( Figura 5 corsia AG), mentre i risultati di PCR della N1L del virus di controllo (Ctr) con una regione N1L intatto è positivo. I frammenti di DNA di controllo di A52R sono stati positivi per tutti i virus ricombinanti e il virus Ctr. L&#39;efficienza delle risorse umane nelle placche RFP-positivi è del 100% (6/6) in questo esperimento (era fino al 94% nel lavoro precedente 34). Il metodo qui descritto è migliorata l&#39;efficienza di ricombinazione di più di 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali 33, 34. contenuti &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Figura 1:. La cassetta del vettore shuttle donatori per la ricombinazione omologa, e la regione di destinazione nel genoma VV La purificazione gene marcatore RFP è guidata dal promotore H5. Il vettore di riparazione donatore mira i risultati regione N1L nel gene RFP viene incorporato nella regione N1L dopo ricombinazione omologa. &#39;X&#39; indica la sequenza omologa nel vettore donatore di riparazione che andrà a sostituire la stessa sequenza sul genoma del virus vaccino. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Figura 2:. Imaging del CV-1 le cellule un giorno dopo la ricombinazione omologa Un giorno afteR ricombinazione omologa, le cellule infettate con VV e trasfettate mediante riparazione vettore donatore sono RFP-positivi. A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X). B: immagini di microscopia a fluorescenza (originale ingrandimento 100X). Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Figura 3:. Una targa RFP-positivo nel primo depurazione turno di virus mutante nella purificazione primo turno del virus mutante, la placca RFP-positivi (cerchiato con linea rossa) con la regione di destinazione eliminazione sono circondati da placche formate da virus selvaggio di tipo (cerchiato con linea gialla). A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X) B:. fluorescenza MICRimmagine oscopy (originale ingrandimento 100X). Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Figura 4:. Il mutante pura VV Dopo 3-5 giri di purificazione, placche puri sono stati ottenuti come tutte le targhe erano RFP-positivi. A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X). B: immagini di microscopia a fluorescenza (originale ingrandimento 100X) . Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Figura 5: Verification della pura mutante VV. DNA è stato estratto da VV infettato CV-1 cellule. La delezione della regione bersaglio N1L è stata verificata mediante PCR utilizzando primer N1L, l&#39;inserimento di RFP in regione N1L stata confermata mediante PCR utilizzando primer RFP. Lanes AF corrisponde a sei placche purificati, corsia G è una placca di controllo con l&#39;eliminazione N1L verificato nel precedente lavoro 33, corsia Ctr (controllo) è il virus di tipo selvaggio vaccino (con la regione N1L intatto). A52R gene è stato amplificato come il gene di controllo per tutti i campioni. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Views.  Queen Mary University of London.  virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9. 

Video: A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

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Immunologia e infezioni

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

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Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Neuroscienze

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...