פילינג שגוי Rhodopsin גורם ניוון רשתית מתקדמת הנקראת רטיניטיס פיגמנטוזה. בעוד שיטת הדמיה מסורתית יש יכולת מוגבלת לכמת את התחבורה rhodopsin, זה חדש שפותחה תמונה מבוססת assay מאפשר סינון תפוקה גבוהה, ביטול תוצאות חיוביות שגויות. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של פרמקודינמיקה של תרופות.
בעין הצלת קיפול של רודופסין גורם למחלות, ובכך להאיץ את הפוטנציאל לטיפול במחלה שקטה בלתי ניתנת לטיפול מסנוור, רטיניטיס פיגמנטוזה. לוקליזציה תאית של חלבון ממברנה חשובה מאוד לתפקודו. שיטה זו ניתן לשנות בקלות ולהחיל לכמת את ההובלה של כל חלבון קרום אחר של עניין.
הקפד להכין מפת צלחת בעדינות להוסיף ולספירה נוזלית מכל באר של הצלחת, כדי לשמור על מספר התא ואת תנאי מצב האימון עקבי בין התאים. זה יניב גורם Z גבוה, ותוצאות אמינות. כדי להתחיל, זרע 5000 תאים לתוך שחור מוקף, תחתית ברורה, לי לסין פולי מטופלים 384-well-plate.
הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז CO2 במשך שלוש שעות לתאים לצרף לתחתית הצלחת. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 10 microliters ל הבאר של פתרונות עבודה 5X, על פי מפת לוח שנקבע מראש כמו זה המוצג כאן. כעת, הוסף 10 מיקרוליטרים ל באר של 2%DMSO לעמודות 22 ו- 24.
כמו כן, להוסיף 10 microliters לכל באר של 25 micromolar 9-cis-רשתית לעמוד 23 בחדר חשוך תחת אור אדום עמום. לאחר סיום טעינת כל תרכובות הבדיקה השונות, מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מוציאים את צלחת 384 היטב בחדר חשוך עם אור אדום עמום.
כאן, באמצעות 8 ערוצים שאפה, מחובר בקבוק איסוף ואקום, כדי לשואב בעדינות את המדיום מן בארות הצלחת. לאחר מכן, השתמשו בפימטה רב-ערוצית כדי להוסיף 20 מיקרוליטרים ל הבאר של 4% Paraformaldehyde המוכן טרי לכל צלחת 384 הבאר, ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קיבעון, מניחים את הצלחת לאור רגיל.
שם, השתמשו ב-8 ערוצים שאפו, כדי לזמן את הפרפורמלדהיד בכל באר, ולהשתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים ל-Well of PBS. שאפו והחליפו את ה-PBS בשלושה מחזורי שטיפה בסך הכל. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים ל-5% סרום עיזים לכל באר, והדקירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, שאפו את הבארות, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של 20 מיקרוגרם למיליליטר נוגדן נגד רודופסין B630, בסרום עיזים של 1% ל הבארות בשורות A עד O.Next, הוסיפו 15 מיקרוליטרים ל הבאר של 1% סרום עיזים לשורה P עבור קבוצת הבקרה המשנית של נוגדנים בלבד. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות, או בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה. לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של פלואורופורים.
לאחר מכן, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 50 microliters ל הבאר של PBS. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את ה-PBS, והוסיפו 15 מיקרוליטרים ל הבאר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן IgG נגד עכברים של עזים תכלת. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters לכל באר של PBS, המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של כתם Hoechst בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לבסוף, לאטום את צלחת הבאר עם סרט שקוף, לכסות אותו עם רדיד אלומיניום, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע.
הסר את נייר הכסף והצב את לוח הדגימה בתמונה עם תוכן גבוה, כאשר A1 ממוקם בפינה השמאלית העליונה של הצלחת. לאחר מכן, פתח את התוכנה לרכישת תמונות כדי להגדיר פרמטרים לרכישת תמונות. פתח את חלון הגדרת רכישת הלוח וצור הגדרה חדשה או טען קובץ התקנה קיים.
בחר את המטרה 20X והגדר את הצמדת הפיקסלים לשניים, כך שגודל הפיקסל המכויל יהיה 0.80 על 0.80 מיקרון. לאחר מכן, הגדר את קווי הסריקה כ- 2000 ואת גודל התמונה כ- 1000 על 1000 פיקסלים לכל אתר. לאחר מכן, בחרו בסוג הלוח להדמייתו.
השתמש במידע שסופק על-ידי היצרן כדי למלא את ממדי הלוח. עכשיו, בחר את בארות להיות בתמונה יחד עם ארבעה אתרים להיות בתמונה לכל באר. הימנע מהצד של באר, אשר נגעו טיפים השאיפה.
להדמיה, בחר לייזרים לזרז כמו 405, 488 ו 461 ננומטר. לאחר מכן, בחר את מסנני הפליטה עבור ערוצי DAPI, FITC ו- Texas Red. לייעל את כוח הלייזר ורווחים של כל ערוץ, כדי להבטיח, בארות שליטה חיובית אינם רוויים.
בחר היטב כדי להתמקד היטב עבור מיקוד אוטומטי. לאחר מכן, בחר את הבאר הראשונית שיש לרכוש והגדר את המוקד האוטומטי של האתר עבור כל האתרים. כמו כן, בחרו ארבעה ממוצעים לכל ערוץ, ומטבו את ערך היסט Z לכל ערוץ.
לאמת, כי הכל מוגדר כראוי, על ידי בדיקה ראשונה שתיים עד שלוש בארות בפינות הצלחת, כדי לוודא את התמונות הם על המוקד עבור כל בארות שנבדקו. לאחר מכן, בדוק, כי תמונות מכל האתרים לכל באר יש תאים עם יותר מ 40%confluence. לבסוף, בדוק, כי התעצמות הפלואורסצנטיות בכל הערוצים הם כל כמחצית רווי 100% שליטה בארות.
לאחר מכן, שמרו את שיטת רכישת התמונה והפעילו את הלוח כולו. צפה בתמונה עד שתסיים ללכוד תמונות מהעמודה הראשונה של הלוח כדי לבדוק שוב את איכות התמונה לפני שתעזוב את התמונה. בסיום, מוציאים את הצלחת ומאחסנים אותה בארבע מעלות לשימוש עתידי.
שלף נתוני תמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות תוכן גבוהה. בחר באחת מ- 100%control wells בעמודה 23 כדי להגדיר את הפרמטרים. תחילה, בחר את ניקוד התאים באורך גל מרובה כשיטה לניתוח והתחל לקבוע את התצורה של ההגדרות הנוספים.
הגדר את הגרעינים באמצעות תמונות מערוץ DAPI. תצוגה מקדימה, כדי לוודא שצורות הגרעינים המוגדרות באר שנבחרה מתאימות היטב לתמונות הגרעינים. לאחר מכן, הגדר את צורת התא בערוץ FITC, שבו רודופסין ונוס הוא בתמונה.
כדי לבצע זאת, הגדר קטרים מינימליים ומקסי מקסימום של כל תא, עוצמת פלואורסצנטיות מינימלית מעל הרקע, כמו גם שטח מינימלי של כל תא. עכשיו, להגדיר את אזורי כתם פני השטח של תא rhodopsin בערוץ האדום טקסס, על ידי הגדרת הקטרים המינימליים והמקסימליים של צורת התא, עוצמת פלואורסצנטיות minium מעל הרקע, כמו גם שטח מינימלי של כל תא מוכתם. בדוק את האלגוריתם הנוכחי בחמש בארות כדי לקבוע, אם ההגדרות ממוטבות.
לאחר מכן, שמור את ההגדרות וסגור את חלון התצורה. הפעל את כל בארות עם שיטת ניתוח ממוטבת. לאחר שתסיים, יצא את מספר האובייקט כמספר התא שלם.
לייצא את העוצמה הממוצעת של ערוץ FITC כמו עוצמת רודופסין ונוס, ולייצא את האינטנסיביות הממוצעת של התעלה האדומה טקסס כמו עוצמת רודופסין על פני השטח של התא. השתמש בתוכנת הגיליון האלקטרוני כדי ליצור מפת חום בשני צבעים עבור כל פרמטר. סדר את שם קווי התאים בציר ה- x ואת התרכובות בציר ה- y.
כאן, התמונות שלנו של P23H rhodopsin ונוס טיפלו בתאי U2OS, המביעים פלואורסצנטיות של ונוס בירוק, וכתמים חיסוניים של פני השטח של התא באדום. התאים טופלו ב- DMSO או בחמישה מיקרומולרים 9-cis-רשתית. בדיקה הובלת rhodopsin, השוואת כמות rhodopsin בתא כולו בתנאים שונים, מראה התאוששות משמעותית בקו התא מוטנט P23H, כאשר מטופלים עם 9-cis-רשתית.
בנוסף, עוצמת הרודופסין על פני התא, והיחס בין כתם הרודופסין על פני התא לעוצמת רודופסין ונוס בתא כולו, אינם נמוכים משמעותית עבור מוטציית P23H, בהשוואה לרודופסין הבר שטופל ב- DMSO. מפת חום היא דרך יעילה להשוות את כמות הרודופסין הממוצעת לוקליזציה לכל תא על פני מוטציות מרובות. כאן, פקדי wildtype ושישה מוטציות rhodopsin מפורטים אופקית, ואת ההשפעות של טיפולים מורכבים מושווים אנכית.
בהסכמה עם מחקרים קודמים, עוצמת הרודופסין על פני התא והיחס של כתם רודופסין על פני התא לעוצמת רודופסין ונוס נמוכים יותר עבור ששת המוטנטים בהשוואה לטבע שטופלו ב- DMSO. תרכובות 1, 2, 6 ו-9 הגדילו באופן משמעותי את היחס בין כתם הרודופסין על פני התא לעוצמת רודופסין ונוס במוטנטים T4R, P23H, D190N ו- P267L rhodopsin, מה שמרמז על כך שתרכובות אלה מצילות את הובלת המוטנטים הרודופסינים האלה לממברנה הפלזמה. זכור שתאים אלה צריכים להיות בין 50% ל- 70%confluent לפני הקיבעון, מכיוון שזה קריטי לניתוח תמונה.
כמו כן, הראינו תמונות של בארות על פני כל הצלחת. ודא, כי התמונות בפוקוס, כי הפלואורסצנטיות, כי לא לצאת, יש את כל ערך הסף עבור כל ערוץ. עד תרכובות בחירה, כי הצלה misfolded תחבורה rhodopsin, אנחנו יכולים לאמת את התהליך, ואז להעביר את היעילות של תרכובות אלה ב vivo, באמצעות מודל העכבר המבטאת מוטציה P23H rhodopsin.
שיטה זו מאפשרת לנו לכמת את כמות חלבון הממברנה, ואת לוקליזציה שלה. לכן, זהו כלי נהדר עבור טעות מיקרו התחיל על חלבון קרום לכל לסייע לשמור השפלה. Paraformaldehyde, כפי שהוא בניסוי זה, יש נהלים מעורבים הטיפול של reagent זה.
זה ייעשה מתחת למכסה המנוע. פסולת כולל זה reagent צריך להיות מסולק כראוי כמו כימיקל מסוכן.
