דגי זברה מציעים מודל התחדשות עצבי יקר ערך בשל יכולתם להתאושש מפגיעה בחוט השדרה. שיטה זו מתארת סיבולת שחייה והתנהגות שחייה כקריאות של תיקון חוט השדרה פונקציונלי. טכניקה זו מספקת הערכה אמינה ומכמתת של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים.
שיטות אלה חלות באותה מידה על מחקרים של התפתחות שרירית ושרירים ושלד, מחלות והתחדשות. כדי להעריך סיבולת שחייה, פתח את תוכנת בקרת מהירות הזרימה. לחץ על התיבה שכותרתה ניסוי ולבטל את הבדיקה Uswim ו Uwater.
לאחר מכן שנה את מהירות הזרימה בתיבת Uwater בצד שמאל התחתון כדי להתאים את מהירויות זרם המים. כדי להתחיל פרוטוקול אוטומטי, לחץ על התיבה התחל רישום. בחלון הדו-שיח שנפתח, בחר אוטומטי מהרשימה הנפתחת.
כדי לפתוח קובץ פרוטוקול שנשמר בעבר, לחץ על סמל הקובץ לצד קובץ הפרוטוקול. לאחר מכן, הגדר את קובץ הפלט על-ידי לחיצה על סמל הקובץ לצד קובץ יומן הרישום. בחלון סייר הקבצים שנפתח, תן שם לקובץ הפלט ושמור אותו במיקום הרצוי.
לאחר מכן, הגדר חלון טיימר הקפה מפוצל כדי להבטיח גישה בו-זמנית לתוכנת בקרת מהירות הזרימה ולחלונות הטיימר במסך המחשב. לאחר מכן, הקימו מיכל איסוף דגים כדי לשכן את הדגים המותשים לאחר הסרתם ממנהרת השחייה. מלאו את מיכל האיסוף וצינור פוליוויניל כלוריד ארוך במי מערכת דגי זברה.
מניחים קצה אחד של הצינור הממולא מראש במיכל האיסוף וקצה אחר במיכל החיץ, ומבטיחים שהמים יוכלו לזרום בחופשיות ממיכל החיץ למיכל האיסוף. הדקו את הקצה העליון של הצינור עם קליפ קלסר למניעת זרימת מים, והשתמשו בקליפס הקלסר כדי לשלוט בזרימת המים לפי הצורך. סגור את מנהרת השחייה עם מכסה סיבולת השחייה לפני הצבת קבוצה אחת של דגים בתוך מנהרת השחייה.
כדי להסתגל לדגים למנהרת השחייה ולכיוון הזרימה, הפעילו את טיימר ההקפה המפוצל והתאמו את המהירות הנוכחית לאפס סנטימטרים לשנייה בחמש הדקות הראשונות, תשעה סנטימטרים לשנייה בחמש הדקות הבאות ו-10 ס"מ לשנייה במשך חמש הדקות הבאות. לאחר ההתאקלמות, פתחו את הפרוטוקול והתחילו את תוכנית בקרת מהירות הזרימה האוטומטית, שתגדיל את מהירות זרם המים בשני ס"מ לשנייה בכל דקה. תשגיח על הדגים לתשישות.
דגים מותשים יידחקו לכיוון הקצה האחורי של מנהרת השחייה. כדי להבטיח שהדגים מותשים, הקישו בעדינות על הקצה האחורי של המנהרה או צרו צל מעל אזור זה כדי לעורר את הדגים לשחות. דגים מותשים לא הגיבו לגירוי המבהיל ושכבו שטוחים בקצה האחורי של המנהרה.
כאשר דג מותש, לא לכלול את צינור איסוף הדגים. פתחו את חלון מנהרת השחייה ואספו את הדגים במיכל האיסוף. הקלט את השעה בתשישות באמצעות טיימר ההקפה המפוצל.
לאחר שכל הדגים מותשים ונאספים במיכל האיסוף, לחצו על כפתור עצירת החירום בתוכנת בקרת מהירות הזרימה ועצרו את הטיימר. כדי לצלם סרטים לבדיקת התנהגות השחייה, הניחו קבוצת דגים במנהרת השחייה וסגרו את המנהרה באמצעות מכסה סטנדרטי וסגור לחלוטין. לאחר מכן, פתח חלון הקלטה חדש ותן שם לקובץ.
אל תלחץ עדיין על הקלט. לפני תחילת ניסוי חדש, הניחו מגבת נייר או פיסת בד בצד מנהרת השחייה כדי להבטיח שכל ההתנהגויות נובעות משחייה בדגים, ולא בגלל תגובה מבהילה הנגרמת על ידי תנועה בסביבה. לאחר שהבטחת שהמים רגועים ולא אדוות נעות על פני המסגרת, לחץ על הקלט בחלון תוכנת המצלמה כדי להתחיל להקליט את קובץ הסרט.
לאחר מכן לחץ על התחל בתוכנת בקרת מהירות הזרימה כדי להתחיל את הפרוטוקול, אשר ימשיך ללא הפרעה. צפה בסרט כדי להבטיח כי אין מסגרות נפלו, אין בועות בשדה הראייה, וכל הדגים מתועדים. לאחר השלמת הקלטת הסרט, לחץ על עצירת חירום כדי לסיים את פרוטוקול בקרת מהירות הזרימה ולבדוק שקובץ פלט הנתונים נשמר באופן אוטומטי.
לאחר מכן, סגור את חלון ההקלטה כדי לשמור את קובץ הסרט. לאחר ההקלטה, הסר את המכסה. בזהירות לאחזר את הדגים ולהחזיר אותם למיכל שלהם.
כדי לנתח את הסרטים שנתפסו, פתח את tracking_v2. סקריפט ijm בפיג'י ולחץ על הפעל כדי להתחיל את התוכנית. בחלון המוקפץ, בחר את התיקיה המכילה את סרטי התנהגות השחייה למעקב ולחץ על פתח.
חפש מסגרת אחד מהסרטים הראשונים, תיבת דיאלוג, ואת אזור העניין, או מנהל החזר על ההשקעה, שיעלה. בצע את ההוראות שניתנו בתיבת הדיאלוג וצור החזר השקעה בתחתית תא מנהרת השחייה. לאחר מכן לחץ על אישור וודא כי אין פינות שחורות נראים.
חלון הסף ייפתח יחד עם מסגרת בעלת סף ערוך. שנה את ערכת הצבעים משחור-לבן לאדום והתאם את הערך המרבי עד שמסגרת אחת מציגה רק את הדג באדום ולא שום דבר אחר. הקלט את הסף ולחץ על אישור בתיבת הדו-שיח.
ליישור, הרכבה ורכישה של סטטיסטיקה תיאורית, פתח את SwimBehavior_v7-3. R script ב- RStudio ולחץ על מקור בפינה השמאלית העליונה של מקטע הסקריפט. בחלון חדש שנפתח, בחר את התיקיה המכילה את _raw.
קבצי csv שנוצרו על-ידי פיג'י ולחצו על פתח. התוכנית תפעל באופן אוטומטי. בתיבת הדו-שיח המוקפצת, אשר את מספר הדגים בכל סרט.
לחץ על כן אם המספרים הנתונים נכונים או לא אם המספרים שגויים. לאחר יישור הקבצים, בדוק אם יש _aligned חדשה שנוצרה. קובץ csv.
לאחר שתוודא שהתוכנית משלבת את הנתונים, מפעילה סטטיסטיקה ומתווה תרשימי פלט, בדוק אם קיימים קבצי הניתוח שנוצרו בתיקיה חדשה בשם Results בתוך תיקיית האב המכילה את _raw. סי.אס.וי _aligned. קבצי csv.
סיבולת השחייה שהוערכה בשבועיים, ארבעה ושישה שבועות לאחר הפציעה הראתה אובדן של 60% מכושר סיבולת השחייה בשבועיים. הדגים המתחדשים חזרו בהדרגה לסיבולת השחייה בגיל ארבעה ושישה שבועות לאחר הפציעה. בבדיקת התנהגות השחייה, פקדים שחו בהתמדה בחלק הקדמי של תא מנהרת השחייה המתאים לתנוחת Y מוגבהת.
לעומת זאת, בשבועיים שלאחר הפציעה, דגים פצועים לא יכלו לשמור על יכולת שחייה יציבה מול הזרם. כתוצאה מכך, מסלולי השחייה שלהם אינם סדירים יותר, עם ירידה כוללת בתנוחת Y. תנוחת ה- Y עלתה בארבעה ושישה שבועות לאחר הפציעה, מה שמצביע על כך שבעלי חיים מתחדשים חזרו בהדרגה ליכולתם לשחות.
יתר על כן, ביחס לבקרות שלא נפגעו, בעלי חיים שנגעו בשבועיים שלאחר הפציעה היו פחות פעילים באופן משמעותי, נתקעו ברביע האחורי של מנהרת השחייה, ואיבדו את יכולתם לשחות נגד מהירויות נמוכות זרם. בהתאם ליכולתם המולדת להשיג התאוששות תפקודית, בעלי חיים נגועים נרמלו בהדרגה את הפרמטרים של התנהגות השחייה בארבעה ושישה שבועות לאחר הפציעה. השימוש בתוכנת בקרת מהירות הזרימה בפרוטוקול זה הוא אופציונלי.
החלופה היא לשלוט באופן ידני במנוע זרם המים. הבדיקות המתוארות במחקר זה ניתן להשתמש כדי מראש הקרנה עבור פנוטיפים עצביים, שריריים, או שלד. לאחר מכן ניתן לקצור את רקמת העניין לבדיקה היסטולוגית או מולקולרית.
המעבדה שלנו ואחרים השתמשו בפרוטוקול זה כדי לזהות גנים הנדרשים לתיקון עצבי מולד וגורמים שמספיקים כדי לשפר את ההתחדשות העצבית.
