Name: preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy at JoVE.com

We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

דם היקפיים מתורמים זכר בריא הושג עם הסכמה מדעת ואישור ועדת הביו-אתיקה של Centro de Investigaciòn en Dinámica Celular- Universidad האוטונומית del Estado de Morelos. בידוד הפעלת 1. הנאיבי האדם CD4 + T תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 2 מ&quot;ל של דם היקפיים נגזר מתורמים אדם בריא באמצעות הסכמה מדעת לדלל עם 2 מ&quot;ל של PBS-EDTA סטרילי (בופר פוספט 1x (PBS), 2 מ&quot;מ EDTA, pH 7.4). מוסיפים את דם מדולל לאט על גבי 3 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז עם 1.077 צפיפות כפי שתואר לעיל 8. הערה: הגירה דיפרנציאלי במהלך צנטריפוגה הנגרמת על ידי הבדלים בצפיפות תגרום אריתרוציטים משקעים לחלוטין שכבה של תאי mononuclear צפופים פחות תהווה לעיל. 2 מ&quot;ל של דם היקפיים יעבד כ 0.5 x 10 6 תאים מסוג CD4 + T נאיבי לאחר purificatiעל צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 30 דקות ב 250 XG ב 21 ° C (הרוטור לשימוש עבור צינורות תחתית עגולה עם בזווית קבועה של 30 מ&quot;מ) ללא הפסקה כדי ליצור שיפוע של תאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). לאחר צנטריפוגה, PBMCs ניתן להבחין בבירור כמו טבעת לבנה. אסוף את PBMCs עם טפטפת להעביר צינור סטרילי לרחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שוטף עם פתרון PBS-EDTA ב 250 XG במשך 10 דקות והמשך טיהור של תאים מסוג CD4 + T נאיבי. שיטות מיון או מספר סוגים של ערכות טיהור זמינות למטרה זו. רצוי, להשתמש&gt; 1 x 10 7 PBMCs לטיהור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר נאיבי תאים מסוג CD4 + T על ידי סלקציה שלילית עם חרוזים מגנטיים. בצע סלקציה שלילית עם אנטי CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, אנטי TCRγ / δ, אנטי-HLA-DR, ו CD235a (א glycophorin) נוגדנים. להעריך את אחוז טוהר על ידי קביעת CD4 + CD45RA + תאים עד Fcytometry נמוכה. הערה: אם תרצה, תוכל להמשיך הדגירה של PBMCs לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם צפיפות של 1 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / ב 10 מ&quot;ל של מדיום בתוספת לקדם דבקות מונוציטים ולהמשיך עם טיהור תא נאיבי CD4 + T. ההתאוששות היעילה של תאים מהסוג CD4 + T נאיביים מדם היקפי תלויה במידה רבה על מערכת הטיהור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות תרבית תאי 24 גם על ידי הוספת 250 μl לכל טוב של PBS עם 5 מיקרוגרם / מיליליטר נוגדנים חד שבטיים CD3 אנטי דגירה במשך שעה לפחות 2 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: צלחות עם 96 בארות ניתן להשתמש כאשר מספר קטן יותר מתאי CD4 + T נאיביים משמש (למשל, 2 x10 4 -1 x 10 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דילול נוגדן CD3 אנטי מ -24 היטב או 96 צלחות היטב ולשטוף את הצלחות פעמיים באמצעות PBS 1x סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי CD4 + T הנאיביים עם&gt; 95% של טוהר (CD4 +CD45RA +) לצפיפות של 1 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / במדיום מתקדמים RPMI 1640 בתוספת 3% בסרום שור העובר (או RPMI בתוספת 10% נסיוב), 2 מ&quot;מ גלוטמין ואנטיביוטיקה (1 U / פניצילין מ&quot;ל, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין). הערה: אם לוקליזציה ganglioside נדרשת PBMCs, לעקוב אחר פרוטוקול זהה עבור דילול וגירוי כמתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של דילול התא לבארות אנטי מצופה CD3 ו לבארות הלא מצופה (תאי שליטה) ב 24 את הצלחת היטב. לחלופין, להוסיף 100 μl של דילול התא אל הבארות של 96 את הצלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את התנאים גירוי של תאים נאיביים CD4 + T בבארות אנטי CD3 מצופה על ידי הוספת 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל של נוגדן CD28 אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים מסוג CD4 + T נח כמו שליטה הבארות הלא מצופה ללא תוספת של נוגדנים CD28 אנטי. CD4 + T תא דגירה להשראה והופעל עבור 0 כדי 72 שעות בתנאים סטנדרטיים של 37 מעלותC ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת הפעלה נאותה להעריך על ידי זרימת cytometry הביטוי של סמן ההפעלה מוקדם CD69 (16 שעות שלאחר הפעלה) או סמן הפעלה מאוחר CD25 (48 שעות שלאחר הפעלה) ב מנוחה והופעל תאי CD4 + T נאיביים וטופחו על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 ב היעדרותם ונוכחותם של CD3 אנטי / נוגדנים CD28 9,10. </li></ol> דבקות 2. של מנוחה הופעלו תאים הנאיביים CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר 12 מ&quot;מ עגול coverslips ידי מעוקר וחשיפה לאור UV למשך 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips צלחות תרבית תאים סטריליים 24 גם. הערה: עבור תרבויות עם פחות מ 1 x 10 5 תאים עדיף להשתמש בתאי שקופיות עם בארות קטנות המותאמות למנוע פיזור של תאים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל (או תא שקופיות) עם 200 μl של פולי- L- ליזין (MW 150-300 KDA) 0.1% (w / v) פתרון דגירה במשך 5 דקות ב rטמפרטורת אום (RT), להסיר ויבש לפחות שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב בזהירות ולאסוף להשראה והופעל תאי CD4 + T נאיביים מצלחות 24 גם. ספירת התאים ובמידת הצורך להתאים עם המדיום השלימו טריים להעביר 1 x 10 5 תאים על coverslips מצופה פולי- L- ליזין. דגירה התאים למשך תקופה מינימלית של 6 שעות ב 37 מעלות צלסיוס ו 5% CO 2. </li></ol> 3. איסוף קיבוע של מנוחה הופעלו הנאיבית CD4 + T תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את מדיום מנוחה תרבותית והופעלו תאי CD4 + T נאיביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של RT סטרילי PBS לאט. הערה: בנוסף זהירות והסרת פתרונות מבארות מונע ניתוק של תאים מן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS ולהוסיף עוד 500 μl PBS להסיר תקשורת ותרבות ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי תוספת של 500 μl מסוננים 4% paraformaldehyde (filtמנת מסיר microparticles שיכול להפריע ניתוח מיקרוסקופיה) דגירה במשך 30 דקות ב RT (מועדף) או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. זהירות: Paraformaldehyde הוא תרכובת רעילה ונפיצה. זה ידוע להיות קרצינוגן אדם. השתמש בזהירות עם פרוטוקול בטיחות מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף לפחות פעמיים עם PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב הבא או לשמור על בארות צלחת עם 500 μl של PBS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד מכתים. הערה: עקרות במהלך תהליך זה עוזר למנוע צמיחה מיקרואורגניזם. </li></ol> 4. מכתים, הרכבה ויזואליזציה ידי מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהבארות. הוסף 500 μl של חיץ חסימה קר (PBS 1x, 0.5% אלבומין בסרום תקן כיתה שור, 1% pH בסרום שור עוברי 7.4). דגירה במשך 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ החסימה בזהירות ולהוסיף הנוגדנים הראשוניים (R24 שיבוט אנטי gangliosides GD3, שיבוט GD2 14G2a),PE מצומדות CD25 אנטי APC מצומדות אנטי TCR ו isotypes שולטת מדולל חסימת חיץ 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 2 שעות על הקרח או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: התסיסה מסלולית איטית עדיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן בזהירות ולהוסיף לאט 500 μl של PBS. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (IgG3 אנטי מצומדות FITC עבור GD3 R24 אנטי, Alexa פלואוריד 488 מצומדות או אלקסה פלואוריד 647 מצומדות IgG2a אנטי עבור 14G2a אנטי GD2) מדולל חסימת חיץ 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 על הקרח בחושך בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים PBS כמתואר 4.4). שמור את הבארות עם מספיק PBS כדי למנוע התייבשות של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 333,258 כתם מדולל PBS ל 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות ב RT ולהסיר. לשטוף שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות על מגבת נייר ולהוסיף 20 μl של פתרון גובר (גליצרול 50% ב- PBS) או פתרון גובר מסחריים כדי למנוע דהייה מרווה ממדגמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את coverslip עם פינצטה בסדר ומניח אותו על הפתרון הגובר. ודא שהצד של coverslip שבו התאים מחוברים נמצא בקשר עם הפתרון. חותם את coverslips עם לק ולנתח באמצעות קרינה או confocal. </li></ol> בידוד 5. של RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן נוגדני CD3 אנטי (5 מיקרוגרם / מיליליטר) מצופה 96-גם צלחות. דגירה 4 x 10 4 תאים מסוג CD4 + T נאיבי / גם ב 100 μl של המדיום תרבות בתוספת נוגדנים CD28 אנטי (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי להשלים את הגירוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 0 כדי 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פעמים שלאחר הפעלה שונות למקם את התאים לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף מגיב Trizol 1ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב RT ולשמור המדגם ב -8076; C במשך שעה 24 לפחות. המשך עם בידוד RNA בעת הצורך. הערה: השארת המדגם ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות משפרת תשואת RNA. כמו כן, שימוש בכפפות יד חיוני כדי למנוע שפלת RNA על ידי RNases. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את המדגם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 כלורופורם μl ולנער במרץ ביד במשך 30 שניות (כדי למנוע ערבוב אגרסיבי של RNA על ידי vortexing). דגירה 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את השלב המימי לתוך צינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl isopropanol ו להפוך את הצינור שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 דקות ב RT ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול 75% קר קרח 10 דקות צנטריפוגות ב XG 12,000 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי לבטל את supernatant ומייבשים גלולה RNA על ידי השארת את הכובע של הצינור פתוח. לֹאדואר: בשלב זה הגלול, אינו ברור. המשך בכל זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 20 μl של מי כיתה מולקולריים. חשב את הריכוז וטוהר של חומצות גרעין על ידי מדידת ספיגת 260 ננומטר ו -280 ננומטר באמצעות nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בזהירות סינתזה של cDNA באמצעות כל ערכת transcriptase הפוכה קונבנציונלית בעקבות פרוטוקול manufacturer&#39;s. הערה: כ 0.5-2 מיקרוגרם RNA מתקבל 4 x 10 4 תאים מסוג CD4 + T נאיבי. cDNA ניתן synthetized מ 100 ננוגרם של רנ&quot;א המשמש PCR תגובות בזמן אמת ללא צורך ערכות קלט RNA הנמוך. </li></ol>

<ol>
	<li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+tango+to+quadrilla:+current+views+of+the+immunological+synapse.">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li><li>Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+human+CD4++T-cell+population:+two+distinct+CD4++T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms.">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li><li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSOM+/+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+/+CD3+Mediated+T-Cell+Activation.">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498 (2013).</li><li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNAS+Plus:+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation.">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li><li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acids+in+the+brain:+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development,+stability,+disease,+and+regeneration.">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li><li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Mu&#241;oz, M. E., L&#242;pez-Guerrero, D. V., Mart&#236;nez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+na&#239;ve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters.">Activation of human na&#239;ve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li><li>M&#252;thing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids.">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A.">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li><li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation,+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection.">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li><li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients.">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li><li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand.">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li><li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis.">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li><li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex.">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li><li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming:+implications+for+quality+control.">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li><li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(GD3+synthase)+gene+in+human+cancer+cell+lines:+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes.">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li><li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+(CD60b)+and+7-O-acetyl-GD3+(CD60c)+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes.">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li><li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD3,+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody.">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי לבצע לוקליזציה gangliosides או חלבונים השעיות התא של תאי CD4 + T או תאי חיסון אחרים (למשל, PMBCs, איור 5) החל ממספר קטן של תאים. בגלל גודלו הקטן של תאי T ומאפיינים לא חסידים, רכישת תוצאות תמונות מיקרוסקופיות קרינת מידע עני או באיכו?...

תאי CD4 + T לתזמר את התגובה החיסונית באמצעות פונקציות המפעיל שלהם לאחר הפעלה על ידי תאי מציגי אנטיגן 1. המחקר של המנגנונים התאיים הם מווסתים במהלך ההפעלה מאפשר תובנה תהליך בסיסי של תפקוד מערכת חיסון. עם זאת, המחקר של תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מסובך, כי הם מייצגים אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים בפריפריה דם 2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספר דיווחים לומדים את הלוקליזציה של מולקולות שונות מעורבים הפעיל תא T מסוג CD4 +, בעיקר חלבונים הקשורים קרום הפלזמה 3. Gangliosides הם המכילים חומצה sialic glycosphingolipids ולמרות שהם נחקרו רבות בתאי עצב היכן הם נמצאים בשפע, תאים אחרים כגון תאי מערכת החיסון גם להביע gangliosides עם פונקציות רלוונטיות מבחינה ביולוגית 4,5. בעבר דיווחנו that במהלך ההפעלה של תאים אנושיים נאיבי CD4 + T קיימת הגברת הביטוי של α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (synthase GD3) ואת synthase GM2 / GD2, כי לגרום neoexpression משטח משמעותי GD2 ואת הגברת הביטוי של GD3 ganglioside 6. מחקר נוסף של GD3, GD2 ו gangliosides האחר בתאי מערכת חיסוניים יש צורך להשלים נוף חלק המבוסס על חלבונים של תפקוד מערכת חיסון. בדרך כלל, המחקר הביטוי ganglioside מבוסס על טכניקות כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 7, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת לוקליזציה המרחבי של gangliosides על הממברנה פלזמה או בתאים subcellular, הגבלת ניתוח ביולוגי. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בתיווך נוגדנים ולוקליזציה של gangliosides GD3 ו GD2 בתאים אנושיים נאיבי CD4 + T ו PBMCs לאחר הפעלת אנטי CD3 / אנטי CD28. עם i זה בפרוטוקול זהגם אפשרי לנתח את הגן והביטוי המולקולרי של gangliosides במספר נמוך של התאים בתרחיף, עם הרכישה של תמונות באיכות גבוהה 6, בהתחשב בגודל קטן של לימפוציטים (9 מיקרומטר).

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&amp;nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3&lt;br/&gt; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

השיטות שתוארו לעיל לצורך הפעלה של תאים נאיביים CD4 + T השעיה ואת דבקותם ב coverslips לניתוח מיקרוסקופיה confocal לאפשר לוקליזציה מרחבים ובראייה של gangliosides מעורב הפעלת תא CD4 + T, כי ביטוי המשלים פרופיל ניסויים כגון cytometry זרימה, מערבי סופג או בזמן אמת PCR. כימות של ביטוי ganglioside דרך cytometry זרימת לוקליזציה הסלולר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה ניתן להשיג על ידי השימוש של נוגדנים נגד ganglioside עם זיקה גבוהה וספציפי. עם זאת, גידול טיפול הולם של תאים בתרחיף כרוך בטיפול צלחות התרבות לקדם את דבקות הנדרשות עבור קרינה או רכישת מיקרוסקופיה confocal. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לקביעת ביטוי ganglioside GD3 ו GD2 ו colocalization עם TCR במהלך הפעלת CD4 + T תאים נאיבית. כמו כן, אמת tIME PCR ניסויים באמצעות &lt;40,000 תאים מתוארים ביחס קביעת GD3 ו GM2 / GD2 גני synthase, הוכחה כי ניסויים בניתוח גנטי יכול להתבצע עם מספר נמוך של תאים וללא הצורך של ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הופך באיכות טובה של בתרבית ולנוח דבקה והופעלו תאים אנושיים נאיביים CD4 + T (איור 1). התאים מופעל CD4 + T להראות את פרופיל שגשוג מאפיין (איור 1B) בהשוואה למצב המנוחה (איור 1 א). סמן ההפעלה מאו...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy at JoVE.com

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 + נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR &lt;40,000 תאים שאינם דורשים ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.5K Views.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos.  אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 + נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR 

Video: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biology

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Biochemistry

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Neuroscience

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

Source: Fouda, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55199">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> J. Vis. Exp., (2017).
This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds&#39; stimulatory and inhibitory effects, respectively.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

1. Preparation of Splenocyte Medium and Flow-cytometry Buffer

	Perform all steps under a 70% ethanol-cleaned biological hood.
	Remove 70 mL of pre-warmed ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Source: Lu, Y., et al.&#160;<a href="https://app.jove.com/v/58087">In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated na&#239;ve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

טכניקת In Vitro להבדיל בין GM-CSF המייצרים תאי T מסייעים לבין תאי T נאיביים

Source: Lu, Y., et al.&#160;In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) ...

הכנת CD4

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video