Name: Video: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 8.4K Views. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Descriviamo un protocollo di colorazione degli anticorpi standard per l'uso in microscopia per determinare l'espressione di membrana e la localizzazione di gangliosidi a riposo e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani. sono descritte anche in tempo reale esperimenti di PCR utilizzando

We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Il sangue periferico da donatori sani di sesso maschile è stato ottenuto con il consenso informato e l&#39;approvazione del Comitato di Bioetica del Centro de Investigación en Dinamica Celular- Universidad Autonoma del Estado de Morelos. 1. L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di cellule T CD4 umana Naïve <ol><li> Raccogliere 2 ml di sangue periferico derivano da donatori umani sani attraverso il consenso informato e diluire con 2 ml di PBS sterile-EDTA (1x tampone fosfato (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Aggiungere il sangue diluito lentamente sulla cima di 3 ml di soluzione di saccarosio con 1.077 densità come precedentemente descritto 8. Nota: migrazione differenziale durante la centrifugazione causata da differenze di densità causerà eritrociti sedimentano completamente e uno strato di cellule mononucleate meno dense formerà sopra. 2 ml di sangue periferico renderanno circa 0,5 x 10 6 ingenui cellule T CD4 + dopo la purificatisui gradini. </li><li> Centrifugare 30 min a 250 xga 21 ° C (rotore uso per i tubi a fondo tondo con angolo fisso di 30 mm) senza interruzione per generare il gradiente di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Dopo centrifugazione, il PBMC può osservare chiaramente come un anello bianco. Raccogliere le PBMC con una pipetta e trasferimento in provetta sterile per il lavaggio. </li><li> Dopo tre lavaggi con soluzione PBS-EDTA a 250 xg per 10 min procedere alla purificazione di cellule T CD4 + naive. metodi di cernita o diversi tipi di kit di purificazione sono disponibili per questo scopo. Preferibilmente, utilizzare&gt; 1 x 10 7 PBMC per la purificazione. <ol><li> Purificare cellule T CD4 + naive per selezione negativa con sfere magnetiche. Eseguire la selezione negativa con l&#39;anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A) anticorpi. Valutare la percentuale di purezza attraverso la determinazione delle cellule CD4 + CD45RA + a Fbasso citometria. Nota: Facoltativamente, procedere alla incubazione delle PBMC notte a 37 ° C e 5% CO 2 con una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in 10 ml di mezzo integrato per promuovere monociti aderenza e continua con la purificazione naif cellule T CD4 +. Il recupero efficiente di cellule naïve T CD4 + da sangue periferico dipende in gran parte il sistema di depurazione. </li></ol></li><li> Preparare 24-pozzetti di coltura cellulare aggiungendo 250 microlitri per pozzetto di PBS con 5 mg / ml anticorpo monoclonale anti CD3 e incubare per almeno 2 ore a 37 ° C. Nota: Piastre con 96 pozzetti possono essere utilizzati quando si utilizzano un numero minore di cellule T CD4 + naive (ad esempio, 2 x10 4 -1 x 10 5). </li><li> Rimuovere l&#39;anti diluizione degli anticorpi CD3 dal 24 bene o 96 pozzetti e lavare i piatti due volte con sterile PBS 1x. </li><li> Diluire le cellule naive T CD4 + con&gt; 95% di purezza (CD4 +CD45RA +) ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in advanced terreno RPMI 1640 supplementato con 3% di siero fetale bovino (o RPMI supplementato con 10% di siero), 2 mM glutammina e antibiotici (1 U / ml di penicillina, 1 ug / ml di streptomicina). Nota: Se è richiesta la localizzazione ganglioside in PBMC, seguire lo stesso protocollo per la diluizione e la stimolazione come descritto di seguito. </li><li> Aggiungere 500 ml di diluizione cella per pozzetti anti-CD3 rivestiti e non rivestiti pozzetti (cellule di controllo) nella piastra 24 pozzetti. In alternativa, aggiungere 100 ml di diluizione cella per i pozzetti della piastra da 96 pozzetti. </li><li> Completare le condizioni di stimolazione delle cellule T CD4 + naive nei pozzi anti-CD3 rivestiti con l&#39;aggiunta di 1 mg / ml di anticorpi anti CD28. </li><li> Mantenere le riposo cellule T CD4 + il controllo nei pozzetti non rivestiti, senza aggiunta di anticorpi anti CD28. Incubare il riposo e attiva cellule T CD4 + per 0 72 ore in condizioni standard di 37 °C e 5% di CO 2. </li><li> Per verificare l&#39;attivazione adeguata valutare mediante citometria a flusso l&#39;espressione del marcatore precoce attivazione CD69 (16 ore post-attivazione) o marcatore di attivazione ritardo CD25 (48 ore post-attivazione) in riposo e attivato ingenui cellule T CD4 + incubate a 37 ° C e il 5% di CO 2 in assenza o presenza di anticorpi anti CD3 / CD28 anticorpi 9,10. </li></ol> 2. L&#39;aderenza del Riposo e Attivato cellule T CD4 Naïve <ol><li> Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave e l&#39;esposizione ai raggi UV per almeno 15 min. </li><li> Luogo coprioggetto in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti sterili. Nota: Per le culture con meno di 1 x 10 5 cellule è preferibile utilizzare camere di scorrimento con pozzetti adattate per evitare la dispersione delle cellule del vetrino. </li><li> coprioggetto Coat (o camera di scorrimento) con 200 ml di poli-L-lisina (MW 150-300 KDa) 0,1% (w / v) e incubare per 5 minuti a rtemperatura OOM (RT), rimuovere e asciugare per almeno 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare con cura e raccogliere il riposo e le cellule T CD4 + naive attivati dalle piastre da 24 pozzetti. Contare le cellule e, se necessario, regolare con terreno fresco integrato per trasferire 1 x 10 5 cellule per i vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Incubare le cellule per un minimo di 6 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. La raccolta e la fissazione di Riposo e attivato cellule naive T CD4 + <ol><li> Rimuovere con attenzione il supporto dal riposo colto e cellule T CD4 + naive attivati. </li><li> Aggiungere 500 ml di RT PBS sterile lentamente. Nota: attenta aggiunta e la rimozione di soluzioni da pozzi impedisce il distacco delle cellule dal vetrino. </li><li> Eliminare il PBS e aggiungere un altro 500 microlitri di PBS per rimuovere completamente terreni di coltura. </li><li> Fissare le cellule mediante aggiunta di 500 microlitri filtrata 4% paraformaldeide (filtrazione rimuove microparticelle che possono interferire con l&#39;analisi al microscopio) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (preferito) o per una notte a 4 ° C. Attenzione: Paraformaldeide è un composto tossico e volatile. E &#39;noto per essere cancerogeno per l&#39;uomo. Usare con cautela con un adeguato protocollo di sicurezza. </li><li> Rimuovere il fissativo e lavare almeno due volte con PBS a temperatura ambiente. </li><li> Procedere alla fase successiva o mantenere i pozzetti della piastra con 500 ml di PBS a 4 ° C per diversi giorni fino a colorazione. Nota: La sterilità durante questo processo consente di evitare la crescita di microrganismi. </li></ol> 4. La colorazione, montaggio e visualizzazione per Microscopia confocale <ol><li> Rimuovere la PBS dai pozzetti. Aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio freddo (1x PBS, 0,5% qualità standard di albumina sierica bovina, 1% di siero fetale bovino pH 7,4). Incubare per 20 min in ghiaccio. </li><li> Rimuovere con attenzione il tampone di bloccaggio e aggiungere gli anticorpi primari (gangliosidi anti-GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),PE-coniugato contro CD25 e APC-coniugato contro TCR e isotipi controlli diluiti in tampone di bloccaggio a 2,5 mg / ml. </li><li> Incubare 2 ore sul ghiaccio o una notte a 4 ° C. Nota: lenta agitazione orbitale è preferibile. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo con attenzione e aggiungere lentamente 500 ml di PBS. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere gli anticorpi secondari (FITC coniugato IgG3 contro per R24 ​​contro GD3, Alexa Fluor 488 coniugato o Alexa Fluor 647 coniugato IgG2a contro per 14G2a anti- GD2) diluito in tampone di bloccaggio a 0,1 mg / ml. </li><li> Incubare per 1 ora in ghiaccio al buio senza agitare. </li><li> Lavare tre volte in PBS come descritto in 4.4). Mantenere i pozzetti con PBS sufficiente per evitare la disidratazione dei campioni. </li><li> Aggiungere Hoechst 333.258 macchia diluito in PBS a 0,1 mg / ml. </li><li> Incubare 15 minuti a temperatura ambiente e rimuovere. Lavare tre volte in PBS. </li><li> Porre i vetrini su un tovagliolo di carta e aggiungere 20 ml di soluzione di montaggio (50% glicerolo in PBS) o soluzione di montaggio commerciales per evitare lo scolorimento e tempra da campioni. </li><li> scegliere con cura il vetrino con le pinzette sottili e posizionarlo sulla soluzione di montaggio. Assicurarsi che il lato del vetrino su cui sono fissati cellule è in contatto con la soluzione. Sigillare il coprioggetto con smalto e analizzare utilizzando la fluorescenza o microscopia confocale. </li></ol> 5. L&#39;isolamento di RNA <ol><li> Preparare anticorpi anti CD3 (5 mg / ml) rivestito in piastre da 96 pozzetti. Incubare 4 x 10 4 cellule T CD4 + naive / e in 100 ml di terreno di coltura integrato con anticorpi CD28 contro (1 mg / ml) per completare lo stimolo. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 0 72 ore. </li><li> Dopo diversi tempi post-attivazione mettere le cellule in una provetta. </li><li> Aggiungere 500 ml di PBS e centrifugare a 250 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di reagente Trizol. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e conservare il campione a -8076; C per almeno 24 ore. Procedere con l&#39;isolamento di RNA quando necessario. Nota: Lasciare il campione a -80 ° C per almeno 24 ore migliora la resa RNA. Inoltre, l&#39;uso di guanti è essenziale per evitare la degradazione dell&#39;RNA da RNasi. </li><li> Scongelare il campione mediante incubazione a 37 ° C per 2 minuti in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio e agitare vigorosamente a mano per 30 sec (per evitare la miscelazione aggressiva di RNA nel vortex). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare 15 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Recuperare la fase acquosa in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 500 microlitri isopropanolo e capovolgere il tubo tre volte. </li><li> Incubare 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante per inversione. </li><li> Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo 75% di etanolo e centrifugare 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Completamente scartare il surnatante e asciugare il pellet di RNA lasciando il tappo del tubo aperto. None: A questo punto il pellet non è chiaramente visibile. Procedere comunque. </li><li> Risospendere il pellet in 20 ml di acqua di grado molecolare. Calcolare la concentrazione e la purezza di acidi nucleici misurando l&#39;assorbanza 260 nm e 280 nm usando NanoDrop. </li><li> Procedere con attenzione per la sintesi di cDNA utilizzando qualsiasi kit trascrittasi inversa convenzionale e seguendo il protocollo del produttore di. Nota: circa 0,5-2 mg di RNA è ottenuto da cellule T CD4 + 4 x 10 4 ingenuo. cDNA può essere sintetizzato da 100 ng di RNA e usati in reazioni di PCR in tempo reale senza la necessità di kit ingresso di basso RNA. </li></ol>

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Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare gangliosidi o proteine in sospensioni cellulari di cellule T CD4 + o altre cellule immunitarie (ad esempio, PMBCs, Figura 5) a partire da un piccolo numero di cellule. A causa delle piccole dimensioni di cellule T e proprietà antiaderenti, l&#39;acquisizione di fluorescenza immagini microscopiche comporta informazioni scarsa o bassa qualità se le cellule non siano rispettati correttamente. Q...

Le cellule T CD4 + orchestrare la risposta immunitaria attraverso le loro funzioni effettrici dopo l&#39;attivazione da parte delle cellule presentanti l&#39;antigene 1. Lo studio dei meccanismi cellulari che vengono modulati durante l&#39;attivazione permette spaccato un processo di base della funzione immunitaria. Tuttavia, lo studio delle cellule T CD4 + naive può essere complicato perché rappresentano una piccola frazione di cellule nella periferia del sangue 2. Attraverso la microscopia a fluorescenza diversi rapporti hanno studiato la localizzazione di diverse molecole coinvolte nella attivazione delle cellule T CD4 +, principalmente proteine associate alla membrana plasmatica 3. I gangliosidi sono glicosfingolipidi acido sialico che contiene e, anche se sono stati ampiamente studiati nelle cellule nervose dove sono abbondanti, altre cellule, come le cellule immunitarie esprimono anche gangliosidi con funzioni biologicamente rilevanti 4,5. Abbiamo precedentemente riportato that durante l&#39;attivazione delle cellule T CD4 + naive umane vi è un up-regolazione del α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 sintasi) e la sintasi GM2 / GD2, che inducono il significativo neoexpression superficie GD2 e l&#39;up-regolazione di GD3 ganglioside 6. Ulteriori studi di GD3, GD2 e altri gangliosidi nelle cellule immunitarie è necessario per completare una vista parziale a base di proteine ​​della funzione immunitaria. Comunemente, lo studio dell&#39;espressione ganglioside si basa su tecniche quali la cromatografia su strato sottile (TLC) 7, ma questa tecnica non consente la localizzazione spaziale dei gangliosidi a livello della membrana plasmatica o in compartimenti subcellulari, limitando analisi biologiche. In questo lavoro, si descrive un protocollo per l&#39;identificazione anticorpo-mediata e la localizzazione di GD3 e GD2 gangliosidi nelle cellule T CD4 + naive umani e PBMC dopo l&#39;attivazione anti-CD28 anti-CD3 /. Con questo protocollo è is anche possibile analizzare l&#39;espressione genica e molecolare di gangliosidi in un basso numero di cellule in sospensione, con l&#39;acquisizione di immagini di alta qualità 6, considerando le piccole dimensioni dei linfociti (9 micron).

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&amp;nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3&lt;br/&gt; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

I metodi qui descritti per l&#39;attivazione delle cellule T CD4 + naive in sospensione e la loro adesione a lamelle per l&#39;analisi al microscopio confocale consentono la localizzazione spaziale e la visualizzazione dei gangliosidi coinvolti nella attivazione delle cellule T CD4 +, che l&#39;espressione di complemento profiling esperimenti come la citometria a flusso, occidentale assorbente o real-time PCR. La quantificazione di espressione ganglioside tramite citometria di flusso e la loro localizzazione cellulare mediante microscopia può essere ottenuta con l&#39;uso di anticorpi anti-gangliosidi con alta affinità e specificità. Tuttavia, una adeguata gestione delle cellule in sospensione comporta il trattamento di piastre di coltura per promuovere l&#39;adesione necessaria richiesta per la fluorescenza o acquisizione microscopia confocale. In questo lavoro, si descrive un protocollo per la determinazione GD3 e GD2 espressione ganglioside e colocalization con il TCR durante l&#39;attivazione ingenuo cellule T CD4 +. Inoltre, real-tesperimenti ime PCR utilizzando &lt;40.000 cellule sono descritti per la determinazione del GD3 e geni sintasi GM2 / GD2, dimostrando che gli esperimenti di analisi gene possono essere eseguite con un basso numero di cellule e senza la necessità di ulteriori kit bassa RNA ingresso.

Il protocollo descritto in questo manoscritto rende una buona qualità di colto e di riposo aderito e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani (Figura 1). Le cellule T CD4 + attivate mostrano la caratteristica profilo proliferativa (Figura 1B) rispetto alla condizione di riposo (Figura 1A). Il marcatore di attivazione ritardo CD25 è utile per valutare l&#39;attivazione efficiente a 72 h osservato mediante microscopia...

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Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Descriviamo un protocollo di colorazione degli anticorpi standard per l&#39;uso in microscopia per determinare l&#39;espressione di membrana e la localizzazione di gangliosidi a riposo e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani. sono descritte anche in tempo reale esperimenti di PCR utilizzando &lt;40.000 cellule che non necessitano di ulteriori kit a basso RNA ingresso.

Preparazione di CD4<sup&gt; +</sup&gt; Le cellule T per l&#39;analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.4K Views.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos.  Descriviamo un protocollo di colorazione degli anticorpi standard per l'uso in microscopia per determinare l'espressione di membrana e la localizzazione di gangliosidi a riposo e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani. sono descritte anche in tempo reale esperimenti di PCR utilizzando 

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Ricerca

Biologia

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Immunologia e infezioni

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Estrazione, purificazione e profilatura del ganglioside

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Biochimica

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Neuroscienze

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

Source: Fouda, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55199">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> J. Vis. Exp., (2017).
This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds&#39; stimulatory and inhibitory effects, respectively.

Un test basato sulla fluorescenza che utilizza linfociti ingegnerizzati per lo screening di composti immunomodulatori

1. Preparation of Splenocyte Medium and Flow-cytometry Buffer

	Perform all steps under a 70% ethanol-cleaned biological hood.
	Remove 70 mL of pre-warmed ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Source: Lu, Y., et al.&#160;<a href="https://app.jove.com/v/58087">In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated na&#239;ve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

Una tecnica in vitro per differenziare le cellule T helper produttrici di GM-CSF dalle cellule T naive

Source: Lu, Y., et al.&#160;In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) ...

Preparazione di CD4

Riepilogo

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