This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם למדיניות על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה שנקבע על ידי המשרד למעבדת צער בעלי חיים (NIH), ורק עם אישור מהוועדה המוסדי הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת מרכז לבריאות קונטיקט. .1 הכנת תרבויות גליה מעורבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל המכשירים לפני השימוש. הוסף 3 מ&quot;ל של התמיסה קרה כקרח סטרילי של האנק המאוזן מלח (HBSS) המכילה לא קטיונים (Mg 2 + או Ca 2 +) לשלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילי שמרו על קרח כדי לשמור על הקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את קליפת המוח מגורי עכבר P0-P2 לאחר לידה, כפי שתואר קודם לכן 17,18. הערה: מבנים קורטיקליים, כגון hippocampi, אינם כלולים בתרבויות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את קרומי המוח ולאחר מכן להעביר את קליפת המוח המבודדים לHBSS הטרי ולנתק את רקמות אנזימים, באמצעות neערכה לנתיחה רקמות אוראל על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים לתוך T-175 צלוחיות סטרילי ודגירת הלילה בתקשורת [בינוני הנשר (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) המכיל פניצילין / סטרפטומיצין 1x שונה Dulbecco]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את כל אמצעי התקשורת ביום שלמחרת עם תקשורת טרי. תמשיך לדגור תרבויות, עם שינויי מדיה רגילים, למשך כ 3 שבועות או עד monolayer סלולרי שהוקם. הערה: monolayer זה יהיה מורכב מהאסטרוציטים ומיקרוגליה עם כ 10: 1 יחס 19. </li></ol> .2 אינדוקציה סלולארי Globoid בתרבויות גליה מעורבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips ECM מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים coverslips העגול עם חומצת סטרילי 1 N הידרוכלורית (HCl) בצלחת פטרי סטרילית למשך 30 דקות. לשטוף coverslips עם 3x מים סטריליים ולאחר מכן לטבול ב95% EtOH לפחות 20 דקות. ואז לתת לי אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפות מקום matr תאי המדוללחומרי ix ציפוי (ECM) חלבון על גיליון של Parafilm (למשל 150-250 μl / טיפה של laminin 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל מומס בתמיסת חיץ פוספט סטרילי [PBS]). להפיץ את הטיפות כדי שcoverslips לא לגעת כאשר הניח על גבי הטיפות הללו. מניח בעדינות כל coverslip מיובש על אגל באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את coverslips על הטיפות למשך כ. 4-6 שעות בתוך מכסה המנוע התרבות עם האבנט סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips ECM מצופה (בצד עד מצופה ECM) לכל אחת מהבארות של צלחת 24 גם. לשטוף היטב עם כל PBS 3x סטרילי ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי גלייה לציפוי על coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מתרבויות גליה ולשטוף בעדינות 3x monolayer גליה עם 10 מ&quot;ל של PBS סטרילית. לאחר מכן, להוסיף 8-10 מ&quot;ל פתרון טריפסין-EDTA לT-175, ודגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רוב monolayer כבר מנותק, להוסיף 20 מ&quot;ל של מדיה מלאהלבקבוק כדי להפסיק trypsinization. לאסוף את המדיה המכילה את התאים מנותקים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל וספין 10 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ&quot;ל של מדיה מלאה טרי בעדינות על ידי pipetting הפתרון באמצעות pipet P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן מחדש להשעות תאים בינוניים מלא בצפיפות הרצויה (10 5 תאים / מ&quot;ל לדוגמא). פלייט התאים על coverslips ECM מצופה (למשל 500 μl לבאר כל הצלחת 24 גם). הוסף מדיה שלמה טרי נוספת לכל גם ל3-5 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, או עד שתאים לגדול למפגש החזותי הרצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בPsychosine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את psychosine לריכוז המניה (108.3 מ&quot;מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל מניות זה ב100% EtOH לעשות מניית עובדת שיכולn יתווסף לבאר כל צלחת 24 גם כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הוספת psychosine, בעדינות מערבולת צלחת התרבות לערבב psychosine לתקשורת והתרבות. להשלים את psychosine ידי הוספה המקבילה של 10 מיקרומטר בכל יום אחר במשך שבוע אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימי טיפול psychosine, לאסוף את התקשורת ו500 μl pipet של paraformaldehyde הקר 4% (PFA) לתוך כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, לשטוף היטב 3x כל אחד עם PBS ולאחר מכן לשמור על צלחות ב 4 ° C. עד מעובד לimmunocytochemistry (ראה להלן). הערה: תקשורת תרבית תאים ניתן לאסוף להאנזימטית או assay ELISA בשלב זה אם תרצה בכך. </li></ol> .3 Immunocytochemistry (ICC) לדמיין תאי Globoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם חיץ חסימה [+ 0.3% Tween-20 5 +% עזים בסרום נורמלי PBS (NGS)], ודגירת התאים עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בcubate תאים הקבועים בantisera העיקרי נגד איבא-1 [(1: 1,000) בדילול מלא PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף היטב עם כל דקות 3x PBS 5 / לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המשני המתאים כדי לזהות את עיקרי תיוג נוגדן ונגד כתם עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1,000) לזהות גרעינים. דגירה בפתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף עם דקות 3x PBS 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל coverglass לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות הרכבה בינונית. צפה בשקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור ניתוחים חזותיים וכמותית. </li></ol> .4 ניתוח ואפיון של תאי Globoid בתרבות ראשית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשלושה הקריטריונים מורפולוגיים הבאים כדי לזהות תא globoid בתרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי globoid באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי תיוג immunopositive עבור סמן microglial, + איבא-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זההתאי globoid כ( כלומר שתיים או יותר גרעינים חיוביים DAPI המכילים) polynucleated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי globoid ידי מורפולוגיה מעוגלת להבדיל מההופעה מסועפת מאוד של מנוחה תאי microglial. הערה: תאים יכולים להיות גם שנאסף לצורך ניתוח סמן פני תא וכימות על ידי cytometry זרימה מתרבויות אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת הפעלת phagocytic של מיקרוגליה ותאי globoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את פעילות phagocytic של מיקרוגליה טופל psychosine, להוסיף חרוזים לטקס FITC שכותרתו לבארות בהתאם להוראות היצרן. להוסיף חרוזים לטקס ניאון מצומדות- 48 שעות לפני קיבוע עם PFA. תקן תאים שטופלו בחרוזים (כאמור בסעיף 2.4), ותהליך לimmunocytochemistry (כאמור בסעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נוגדנים משני fluorophore מצומדות-, כך שהם אינם חופפים ספקטרום פליטת הניאון של חרוזים fluorophore שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Analyzדואר פרופילי phagocytotic של איבא-1 + מיקרוגליה על ידי זיהוי אותם התאים שישתפו למקם עם חרוזים fluorescently שהכותרת. הערה: Psychosine יפעיל מיקרוגליה. חרוזים phagocytosed יזוהו בתוך איבא-1 תאים + mononucleated וmultinucleated בהגדרת התרבות זו. </li></ol></li></ol> .5 אינדוקציה של תאי Globoid מתרבויות מזוקקים microglial הערה: גישה חלופית לפענח איתות בין תאית בין astrocyte ומיקרוגליה היא יתרון נוסף של במבחנה globoid מודל זה תא. טיהור של תאי microglial העיקריים לreplating או שיתוף culturing יכולה להיות מושגת על ידי רכוש הדבקות הנמוך שלהם בתרבות, כפי שמתוארת בשלבים הבאים (ראה סעיף 5.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התקשורת מתרבויות גליה מעורבות ומחוברות לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ולתחזק אותו על 37 מעלות צלזיוס בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד microglial מתרבויות גליה מעורבות ראשית.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת התקשורת מבקבוק T175 מחוברות מעורבת תרבות גליה, להוסיף מדיה רועדת חמה [בהיקף של מדיה מלאה + 25 מ&quot;מ 4 החומצה (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 סודיום ביקרבונט מ&quot;מ (Sigma)]. לנער את צלוחיות ל3-4 שעות בייקר מסלולית ב100 סל&quot;ד (37 מעלות צלזיוס). לאסוף את המדיה מצלוחיות מזועזעות אלה לתוך 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל. הערה: תקשורת זה תכלול מיקרוגלים פחות חסיד מהצלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התקשורתי XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ&quot;ל של תקשורת מיזוג astrocyte (שנאסף בשלב 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את מספר התאים שנרכש באמצעות hemocytometer ולאחר מכן צלחת תאי microglial על coverslips מצופה מצע (ראה סעיף 2.1) לimmunocytochemistry, או צלחת על גבי צלחות גם דבקות ultralow לאוסף עתידי של תאי globoid לתרבות משותפת עם סוגי תאים אחרים, כגון oligodendrocytes (כיורדribed בסעיף הבא). הערה: ברגע שמצופית המיקרוגלים יכולים להיות מטופלים עם psychosine (10 מיקרומטר) כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף תרבות עם ראשוני Oligodendrocytes לניתוח רעיל. הערה: אוסף של מיקרוגליה טופל psychosine מצלחות ההיענות הנמוכה לתרבות משותפת שלאחר מכן על תרבויות עיקריות של oligodendrocytes, או תאי אב oligodendrocyte, יכולה לשמש כדי לבחון את התפקוד ציטוטוקסיות הפוטנציאל של תאים דמויי globoid אלה במבחנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח תרבויות של oligodendrocytes העיקרית בשיטות הוקמו 18,20. כדי לאסוף את מיקרוגליה טופל psychosine, בעדינות pipet לנתק את התאים חסיד רופף מהחלק התחתון של הבארות. לאסוף את התאים, צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות, ולאחר מכן resuspend בזהירות בתקשורת בידול oligodendrocyte [מורכבת מתקשורת Neurobasal, L-גלוטמין (1x), B-27 תוספת (1x), וtriiodothyronine (T3, 10 ng / ml )]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן זרע מיקרוגליה על תרבות oligodendrocyte ב1 x 10 5 תאים / מ&quot;ל, וכתוצאה מכך 1 משוער: 2 מיקרוגליה / יחס oligodendrocyte. דגירה כשיתוף תרבות לתקופה של עד 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים לimmunocytochemistry (ראה סעיף 2.4). אסוף תקשורת תרבית תאים לELISA או בדיקות כימיות לפי צורך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease.">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease:+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12.">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, 450-454 (2008).</li><li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hunter's+Hope+Krabbe+family+database.">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+screening+for+Krabbe+disease:+the+New+York+State+model.">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li><li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+familial,+infantile+form+of+brain+sclerosis.">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li><li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globoid+cell+leukodystrophy:+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging.">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li><li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li><li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy.">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation.">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li><li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia.">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li><li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+cytoskeleton:+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ.">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li><li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li><li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+globoid+cell+leukodystrophy.">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li><li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases.">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li><li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation:+Implications+for+leukodystrophy+pathology.">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li><li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem/progenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage/microglia+activation.">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li><li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells.">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li><li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+(TIMP-1)+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination.">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li><li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation.">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק מערכת מודל חדשה שבו ללמוד פיתוח ואפיון פונקציונלי של מיקרוגליה מופעלים ותאים globoid. עבודה מוקדמת של אל Im et. באמצעות שורת תאי HEK293 סיפק תבנית לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי לחקר תא globoid היווצרות 21. כמו כן, חשוב להצביע על כך שתאי globoid...

leukodystrophy Globoid התא (GLD), המכונה גם מחלת Krabbe, היא מחלה demyelinating קטלנית כתוצאה מאובדן של מוטציות פונקציה בgalatocerebrosidase הגן (galc) 1. הצורה השכיחה ביותר של GLD היא הגרסה הילדותית המתאפיינת בהתפרצות בילדות מוקדמת ומאופיינת במהלך קליני אגרסיווי של מנוע וירידה קוגניטיבית שמובילה למוות בטרם עת לעתים קרובות לפני חמש שנים בגיל 2,3. בדיקות גנטיות משמשות לאימות אבחנה של 4 GLD. נוירופתולוגיה של GLD חושפת פגיעה במיאלין נפוצה, ניוון עצבי, astrogliosis ונוכחות של מיקרוגליה רב גרעיניים צבה נקרא תאי globoid 5-7. זיהוי של תאי globoid, לעתים קרובות המכיל תכלילים tubulous בהציטופלסמה שלהם, היה תכונה מגדירה של GLD ל97 השנים האחרונות, למרות שהתפקיד הספציפי של תאים הבולטים אלה נותר חמקמק. מעורבותם של הלא myelגליה (מיקרוגליה ואסטרוציטים) inating בפתוגנזה של GLD כבר מזמן נחשבים תגובה משנית לפגיעה במיאלין העמוקה במחלה זו 8. מעניין לציין, כי התיאור הראשון של מחלה זו, שנעשה על ידי Knud Krabbe 1916 5, היווצרות מדווחת של phagocytes multinucleated המכיל פסולת שומנים שכבר בשם &#39;globoid תאים&#39; והוא מאפיין מגדיר של מחלה זו. תאי Globoid הם תכונת סימן ההיכר של פתולוגיה GLD, למרות שהתפקיד שלהם בGLD זכה להתעלמות ארוכה. מעניין, תאים אלה הם בין השינויים האופייניים המוקדמים ברקמת מערכת העצבים המרכזית של GLD. זה חוסר הידע אולי היה בשל ההנחה כי ההיווצרות של phagocytes multinucleated, תאים ענק הנקראים במחלות אחרות, נחשבות בדרך כלל כתוצאה של פתולוגיה ולא כוח פתוגניים ראשוני נהיגה 9. לכן, היו מעט מחקרים החוקרים את המנגנון שבאמצעות WHIתאי globoid ch נוצרים מphagocytes, במיוחד במערכת העצבים המרכזית של GLD. ההליך המתואר בדוח זה מתמקד בחשיבות של היווצרות תאי globoid במערכת העצבים המרכזית וההפגנה הקודמת שלנו שmultinucleation המושרה psychosine של מיקרוגליה במבחנה ותאים אלה הציג רמות גבוהות יותר של פעילות phagocytic. עולה בקנה אחד עם תצפיות אלה, תאי globoid במוח Twitcher לעתים קרובות מכילים פסולת PAS-חיובי, המצביעים על רמות גבוהות של פעילות phagocytic. תאי Globoid גם הם מצאו להיות immunopositive לפריטין (סמן מיקרוגליה) 10, KP-1 / CD68 (סמן מונוציטים), וחלקם גם חיובי עבור vimentin (חלבון ביניים נימה וסמן של האסטרוציטים ומיקרוגליה הופעלו) 11, HLA-DRA (קולטן משטח MHCII), וTNF-α 7, וייבא-1 (חלבון קושר סידן המשמש לזיהוי מיקרוגליה) 12. בהתבסס על אוסף זה של סמנים, תאי globoid מקורן מיקרוגליה המתפתחיםהפנוטיפ ייחודי. למרות הייחוד שלהם, את הפונקציה ותרומתו של GCS לפתוגנזה GLD הספציפיים הוזנחה. תאי Globoid כבר חשבו להיות תוצאה משנית של פגיעה במיאלין הכרונית. עם זאת, המחקרים האחרונים שבחנו את הקשר הזמני של תאי globoid לפתולוגיה בחומר הלבן של GLD זיהו הנוכחות של תאי globoid בסוף העוברי לתקופות לאחר לידה מוקדמת; פעמים הקודמות אפופטוזיס oligodendrocyte ופגיעה במיאלין הגלוי 13. כך, הרצף הזמני של פיתוח בנוירופתולוגיה של GLD מצביע על כך שתאי globoid נוצרים מראש של פגיעה במיאלין במחלה זו 14. זה הוביל להשערה שלנו כי ההיווצרות המוקדמת של תאי globoid בGLD עשויה לייצג אירוע פתוגניים הגדרה ולא תגובה משנית, תגובתי לנזק oligodendrocyte 15. בנוסף, חוסר ויסות של פעילות microglial בGLD כבר נחשב פקטוr הגבלת היעילות ארוך הטווח של טיפולים בתאי גזע hematopeotic לטיפול במחלה זו 16. כך, חוקר את התפקודים התאיים ורגולציה של מיקרוגליה, ותאי globoid, בתגובה לpsychosine צפוי לספק תובנות חדשות בפתוגנזה של GLD. עד לאחרונה, חוסר המודל מתאים שבו תוכל ללמוד היווצרות תא globoid הגביל את ההבנה של התפקיד והתרומה של תאים אלה לפתולוגיה של GLD המדויקים. במחקרים שנעשה לאחרונה, נקבע כי יכולים להיווצר תאי globoid-כמו בתגובה ישירה לpsychosine, רעלן שומנים פתוגניים שמצטבר בGLD. מצאנו מיקרוגליה את זה, אבל לא מקרופאגים, מופעלים ולהפוך לתאי globoid בתרבויות גליה עיקריות בתגובה לpsychosine 15. השינוי הזה לתאי globoid נמצא להיות מתווך על ידי פרוטאז תאי, metalloproteinase מטריקס (MMP) -3 15. לאחרונה, אנוהרחיבו את הממצאים הללו וקבע כי תאי מיקרוגליה וgloboid מופעל psychosine פותחו במבחנת מערכת מודל זה הם בעצמה רעילה לoligodendrocytes ובתאי oligodendrocyte. לפיכך, כאשר נחשבו בהקשר של GLD, ההצטברות המוקדמת של psychosine והיווצרות של תאי globoid לפני הפגיעה במיאלין יתמוך תפקיד עיקרי ואולי פתוגניים המתעוררים למיקרוגליה במחלה זו. אנו מציעים מחקר שהיווצרות תא globoid יחשפו מידע חדש על הפתוגנזה של GLD שיתרום להבנה של מחלה זו שלנו. יתר על כן, מודל הסלולרי החדש של GLD עשוי לספק פורמט חדש שממנו הגישות טיפוליות חדשניות לטיפול בשינויים פתולוגיים במחלה זו יכולים להיבדק. לפיכך, בדוח זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט לפיתוח במבחנה של תאי globoid מושרה psychosine מתרבויות עיקריות של גליה myelinating שאינו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

הפונקציה המדויקת של מיקרוגליה רב גרעיניים, הנקראת תאי globoid, כי הם ייחודיים בשפע במערכת העצבים המרכזית של leukodystrophy תא globoid (GLD) אינה ברורה. פער בידע זה התעכב בשל חוסר מתאים במודל חוץ גופית למחקר. במסמך זה, אנו מתארים מערכת תרבות העיקרית עכברית גליה שבו טיפול עם תוצאות psychosine בmultinucleation של מיקרוגליה הדומים לתאי globoid האופייניים שנמצאו בGLD. שימוש במערכת הרומן הזה, שהגדרנו את התנאים ומצבים של ניתוח למחקר של תאי globoid. פוטנציאל השימוש של מערכת מודל זה קבל תוקף במחקר הקודם שלנו, שזיהה את התפקיד פוטנציאלי לmetalloproteinase מטריקס (MMP) -3 בGLD. רומן במערכת מבחנה זה עשוי להיות מודל שימושי שבו ללמוד את המבנה ותפקוד, אלא גם מניפולציה הטיפולית הפוטנציאלית, של תאים הייחודיים אלה.

פרוטוקול זה, כפי שנכתב, צפוי להימשך כ 36 ימים כדי להשלים מהתחלה ועד הסוף (ראה איור 1: ניסיוני זרימת העבודה Scheme). זה היה הניסיון שלנו כי התפתחותם של תאים &#39;כמו globoid&#39; במערכת התרבות העיקרית זה היא גם אמינה ושחזור: ההיווצרות של תאי multinucleated בתגובה לpsychosine הוא ציינה ב...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy at JoVE.com

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Views.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Video: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...