נוגדנים חד-שבטיים נגזרים משמשים בעיקר בריאגנטים חיסוניים טיפוליים אבחנתיים, המדגישים את הצורך לייצר נוגדנים יציבים ואמינים בייצור מוגבל מוכן. השיטות המתוארות כאן הוכיחו כי ייצור נוגדנים רקומביננטיים יכול להגדיל את יעילות ייצור הנוגדנים החד-שבטיים ולמזער את עלויות העבודה והזמן הנלוות. השיטות משמשות לפיתוח תרופות סמיכות אמינופפטידאז ונוגדנים מבוססות נוגדנים ומוצרים טיפוליים אחרים, המסייעים בהבהרת תפקיד APN במניעה וטיפול בזיהומים חיידקיים ונגיפיים.
מי שידגים את ההליך יהיה יאן לי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הזריקו תוך צפקית 100 מיקרוגרם של חלבון APN לנקבות העכברים הבוגרות שנבחרו לקבלת דחיפה סופית של האנטיגן. לאחר שלושה ימים של הזרקה, לאסוף את הטחול מעכברים ולשטוף עם DMEM פעמיים כדי להסיר דם ותאי שומן.
סנן את תרחיף תאי הטחול באמצעות רשת נחושת של 200 רשת כדי להסיר פסולת רקמה וקצור תאי טחול באמצעות צנטריפוגה כדי להסיר את קרום הטחול. זרעו את תאי המיאלומה SP20 של העכבר בבקבוק בגודל 25 ס"מ מרובע המכיל חמישה מיליליטר DMEM בתוספת נסיוב בקר עוברי 6% ותרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-6% פחמן דו חמצני באטמוספירה כדי לשמור על יכולת הקיום של התא. לאחר חמישה עד שישה ימים של תרבית, התאים צריכים להגיע למפגש של 80% עד 90% לאחר החייאה ולהיראות עגולים, בהירים וצלולים מתחת למיקרוסקופ.
יום לפני ההכלאה, אספו מקרופאגים מחללי הצפק של העכברים. זרעים מקרופאגים פריטוניאליים בצפיפות של 0.1 עד 0.2 כפול 10 עד חמישית למיליליטר בצלחות של 96 בארות, שכל אחת מהן מכילה 100 מיקרוליטר של מדיום HAT ודגרים עליהם למשך הלילה. להכלאה, שאפו בעדינות תאי SP20 עם פיפטה מ-8 עד 10 בקבוקים והשהו אותם ב-10 מיליליטר של מדיום DMEM נטול סרום.
לשטוף את התאים עם DMEM טרי צנטריפוגה אותם פעמיים, ולאחר מכן להשעות אותם 10 מיליליטר של DMEM. ערבבו את תאי הטחול המכומתים עם תאי SB20 ביחס של 10:1 והעבירו אותם לצינורות של 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט ואספו את הכדורים בתחתית הצינורות.
הקש על הצינור כדי לשחרר את הכדוריות לפני הכלאה. בעזרת טפטפת, יש להוסיף מיליליטר אחד של פוליאתילן גליקול 1500 שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לגלולת התא המשוחררת במשך 45 שניות תוך סיבוב עדין של תחתית הצינור. לאחר מכן הוסיפו לאט מיליליטר אחד של DMEM שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לתערובת למשך 90 שניות, ואחריו עוד 30 מיליליטר של DMEM טרי והכניסו את צינור ההיתוך לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, לקצור את התאים. יש להשהות מחדש את מדיום ה-HAT ואת התרבית בצלחת בעלת 96 בארות המחוסנת במקרופאגים פריטוניאליים. לאחר חמישה ימים, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום HAT טרי לכל באר.
ושוב לאחר חמישה ימים של דגירה, להחליף את המדיום עם מדיום HAT. השתמש בצלחת מיקרוטיטר המצופה בחמישה מיקרוגרם למיליליטר חלבון APN מדולל ב- PBS מולארי 0.05 כדי לנתח נוגדנים חד שבטיים בסופרנאטנט ההיברידיות באמצעות בדיקת ELISA. לגדל את pET28a בתוספת נוגדנים רקומביננטיים aminopeptidase NBL21 מותמר חיידקים בנוכחות 0.4 מילימולרי beta-d-1-thiogalactopyranoside ב שייקר אורביטלי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות.
זרעו 100 מיקרוליטר 0.5 כפול 10 עד האוגר הסיני החמישי תאי שחלה לכל באר לתוך צלחת של 96 בארות לדגירת 37 מעלות צלזיוס ואטמוספירה של 6% פחמן דו חמצני למשך 18 עד 24 שעות. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80% עד 90%, יש לדלל את הנוגדנים הרקומביננטיים pIRES2-zs Green, aminopeptidase ופלסמיד עם Opti-MEM לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר. לאחר חמש דקות, מערבבים את 50 מיקרוליטר של pIRES2-zs ירוק נוגדנים רקומביננטיים אחד, אמינופפטידאזות ופלסמיד עם מיקרוליטר אחד של Lipofectamine 2000 ו 49 מיקרוליטר של Opti-MEM.
לאחר 20 דקות של דגירה, מוסיפים 100 מיקרוליטר של התערובת לכל באר של צלחת 96 בארות המכילה תאי CHO. בארבע עד שש שעות לאחר ההעברה, החלף את המדיום ב- DMEM F12 בתוספת 10% FBS. לאחר 48 שעות של דגירה, הוסף 400 מיקרוגרם למיקרוליטר G418 לכל באר כדי לבחור את התאים הנגועים ביציבות.
לאחר 10 ימים של בחירה באמצעות מדיום DMEM F12 בתוספת 10% FBS ו 400 מיקרוגרם למיקרוליטר G418, מיין את התאים עם מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. לדלל באופן סדרתי את התאים החיוביים שנקטפו. זרעו אותם בממוצע של 0.5 עד 2 תאים לבאר בצלחת של 96 בארות ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, אינקובטור של 6% פחמן דו חמצני.
באנליזה מיקרוסקופית מייצגת, כל תאי ההיברידיות נראו עגולים, בהירים וצלולים. הנוגדנים החד-שבטיים המטוהרים בעלי שרשראות כבדות של 50 קילודלטון ושרשראות קלות של 25 קילודלטון אושרו על ידי SDS-PAGE ונמצאו במיימת המטוהרת. הטיטרים של נוגדנים חד-שבטיים אנטי-APN אלה בתרבית supernatants ומיימת מוצגים כאן.
איזוטיפ נוגדנים חד-שבטיים בעכברים גילה כי נוגדנים שמקורם בשיבוטים 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 ו-6C56 היו בעלי תת-מחלקות G2B אימונוגלובולינים, בעוד APN 2A20 היה נוגדן מסוג קאפה G2A אימונוגלובולין ונוגדן חד-שבטי APN 3FD9, 3F10 ו-10F3 השתייכו לאימונוגלובולין מסוג M ושרשראות אור קאפה מעובדות. רוב הנוגדנים החד-שבטיים הללו הראו ערכי AV של יותר מ-50%, מה שמצביע על כך שהם התמקדו באפיטופים שונים ב-APN, בעוד שנוגדן APN 5C51 זיהה אפיטופים אנטיגניים כמו אלה שזוהו על ידי נוגדנים חד-שבטיים APN 3C48, 5B31 ו-6C56. הגן המוגבר APN 5B36 VHVL נקשר לווקטור pET28a חיובי או pIRES2-zs ירוק וקטור אחד כדי לבנות את הביטוי הרקומביננטי פלסמידים pET28a חיובי RABS APN ו- pIRES2-zs ירוק אחד RABS APN בהתאמה.
הנוגדנים המבוטאים על ידי pET28a בתוספת נוגדנים רקומביננטיים aminopeptidase NBL21 ו- pIRES2-zs Green נוגדנים רקומביננטיים אחד, תאי aminopeptidase NCHO טוהרו ונותחו באמצעות בדיקות ELISA ו- IFA. עם זאת, רק הנוגדן המתבטא בסופרנאטנט של pIRES2-zs Green נוגדנים רקומביננטיים אחד, aminopeptidase NCHO תאים, לזהות את חלבון APN. קשירה של נוגדנים חד-שבטיים APN 5B36 לחלבוני APN הגיעה לשיווי משקל מוקדם יותר מאשר נוגדנים רקומביננטיים.
טיהור הנוגדנים החד-שבטיים בסופרנאטנט באמצעות חלבון A אגרוז עדיף על שימוש במשקעים רוויים של אמוניה גופרתית.
