המחברים מודים לג&#39;ו היל על סיוע בהיסטופתולוגיה, ד&quot;ר ג&#39;ון גלייסטין על הוראה בשיטות כירורגיות, טסה דייבל לסיוע בווידאו, כל חברי המעבדות של וונג וקוזנס על תובנות ודיונים ביקורתיים, ועל מכון OHSU Knight Cancer לתמיכה כספית. המחברים מאשרים תמיכה של T32GM071388-10 ו- T32CA106195-11 ל- CEG, NCI / NIH, המחלקה לחקר סרטן השד תוכנית המחקר, קרן סוזן ג &#39;קומן, הקרן לחקר סרטן השד וקרן לוסטיגרטן סרטן הלבלב התכנסות חלום צוות מענק מחקר תרגום (SU2C-AACR-DT14-14) ל LMC, מענק בריאות האישה של הענקת קרן MHW, ואת מרכז Brenden-Colson לבריאות הלבלב MHW ו LMC.

בעלי חיים המשמשים בפרוטוקול הבא מכוסים על ידי אורגון הבריאות והמדע של אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC), אשר נועד להיות תואם את תקנות רווחת בעלי חיים מדיניות בריאות הציבור (PHS) מדיניות. תחזוקה של תנאים סטריליים: מכשירים מעוקרים יש להשתמש בין העכברים, יש לנגב נקי עם גזה סטרילית, שטופים PBS ואחריו עיקור עם אתנול 70% מחטא במשך 15 דקות לפחות. כובע כירורגי, מסכת פנים, חלוק, כפפות צריך להיות משוחק עבור ניתוחים הישרדות. הכנה טרום אופרטיבית של החיה עבור ניתוחים הישרדות כלול בפרוטוקול הבא. עיין בטבלה 1 עבור רשימה של ריאגנטים וציוד. 1. בידוד והכנת תרחישי תא בודד מגידולי החלב הראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבה התורם 100 יום מהונדס MMTV-PyMT (FVB / N) עכברים ולשמור תחת cעל ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה. ודא כי העכבר הוא הרדים כראוי עם רפלקס הרגל לקוי הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה סטרילית, לגזור את גידולי החלב העיקרי של 100 יום מהונדס נקבה נקבה MMTV-PyMT (FVB / N) עכברים על ידי הפרדת הגידול החלב מן העור מעל הרקמות השומן שמסביב ו / או בלוטות לימפה באמצעות מספריים סטריליים. להרדים את העכברים הרדים על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במספריים סטריליים או באזמל מנתחים גידולים ראשוניים באופן ידני לחתיכות קטנות (~ 1.0 מ&quot;מ 3 ). מקום חתיכות הגידול ב 3.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase A ו 4.0 U / מ&quot;ל ​​DNase אני מומס DMEM. השתמש ~ 10 מ&quot;ל של המדיום העיכול לעיל לכל 1.0 ס&quot;מ קוטר הגידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עיכול בקבוק סטרילי 25 מ&quot;ל עם סט מערבל סטרילי בסל&quot;ד 125 ~ ו 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את העיכול על ידי הוספת בסרום עוברי בסרום (FBS) לדילול הסופי של 10% ומניחים את התערובת כולה על wוקרח שבו הוא מתוחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את ההשעיה הגידול מתעכל באמצעות מסננת ניילון 0.7 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל וזורקים כל גידול שנותר מסננת. צנטריפוגה supernatant ב XG 300 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל DMEM לכל 1.0 ס&quot;מ הגידול מחדש לסנן באמצעות מסננת ניילון 0.7 מיקרומטר. ספירת הריכוז התא, ואז צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 10% דימתיל sulfoxide עם 90% FBS בריכוז של 2 x 10 7 תאים חיים / מ&quot;ל. חנות השעיות תא בודד של הגידול הראשוני כולו ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. הזרקת אורתופטית של גידול החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית להפשיר קפוא המתלים הגידול הראשוני ב 37 ° C עד גלולה קפואה ניתן לשחרר מן הצינור cryogenic לתוך DMM 20 מ&quot;ל לספור את התאים. צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס תאים resuspend ב 1: 1 DMEM: גורם הצמיחה מופחת solobilized המרתף הממברנה הכנהXtracted מ Engelbreth-Holm- נחיל (EHS) סרקומה העכבר בריכוז של 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל ​​(ראה טבלה של חומרים ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרדיד הנמען הנשי סיניגני העכבר בצד הגחון מעלה ולשמור תחת הרגעה רציפה על ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הזכות הזרקה 4 בלוטת חלב באתר באמצעות אתנול 70% Aerosolized וליישם פולי (vinylpyrrolidone) - יוד עם ספוגית כותנה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 μL (1 x 10 6 תאים חיים מן המתלים הקפואים הגידול הראשוני) שפוע בצד כלפי מעלה לתוך בלוטת החלב ימין לא ברור של 6 עד 10 בשבוע FVB / N העכבר בשבוע באמצעות מזרק 29 G 0.3 מ&quot;ל אינסולין. </li></ol> 3. כריתה כירורגית של גידול חזה אורתופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 38-60 ימים לאחר הזרקת תאים סרטניים, עכברים מורדמים לא מציגים כרכים גידול אורטוטופיים הנעים בין 172 ל 450 מ&quot;מ 3 בנפח [אורך x (רוחב 2 </Sup&gt;) / 2] (כ 75% של עכברים מוזרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עכברים מורדמים הצגת גודל הגידול הנכון הגחון בצד תחת הרדמה מתמשכת על ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה לאשר את העכבר הוא הרדים כראוי עם רפלקס הרגל לקוי הרגל. החל משחה וטרינר לעיניים למניעת יובש בזמן תחת סדיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס אתנול 70% לעקר את האזור כירורגית סביב הגידול הראשוני, ולאחר מכן להחיל פולי (vinylpyrrolidone) - יוד עם צמר גפן סטרילי. הערה: הסרת שיער באתר הניתוח גרמה לעורקים ו / או לזיהומים בעכברים של 5%, ולכן לא נכללה בשלב זה (נתונים לא מוצגים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמוצג בתרשים 1C , לעשות חתך ראשוני העור באמצעות מספריים קהה המדיאלי הזנב לגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לעשות כריתה מעולה של העור ( איור 1C ) המדיאלי לגידול. שים לב לצורך לצרוב כל כלי הדםהעורכים את הגידול הממוקם על העור לפני הארכת החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חתך העור לרוחב (האחורי לגידול), ולאחר מכן לבצע חתך העור מעולה (לרוחב הגידול), כריתה המדיאלי (עדיף על הגידול) ( איור 1 ג ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור כבר נכרת סביב סביב הגידול ( איור 1 ג ), להרים את העור המחובר לגידול באמצעות מלקחיים בעוד בוטה לנתח את הגידול הרחק את שרירי דופן דופן הבטן ולשמור על בלוטות החלב ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה (על ידי דיסקציה קהה) ולליבון כלי גדול פועל באמצעות בלוטות החלב 4 וה 5 th. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו כמחצית בלוטות החלב 4 וה 5 th באתר צריבה לשחרר את הגידול, בעור שמעל, ומגזרי של בלוטות החלב (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של דימום, לזהות דימום פעילכלי ומיד לצרוב אותם. אם יותר מ 250 μL של דם הוא איבד, להוציא את העכבר מן המחקר להרדים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור אתרי כריתה עם קליפים הפצע באמצעות applier קליפ הפצע ( איור 1C ). הערה: הסר את קליפי הפצע 10 ימים לאחר הניתוח עם מסיר קליפ הפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול מלוחים סטרילי חם תת עורית (4% ממשקל הגוף של החיה) ולשמור על החיה חם עם מנורת חום. בדוק את החיות כל 5-10 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה. הערה: מינון של bupivacaine או לידוקאין העלה תמותה לאחר הניתוח (נתונים לא מוצגים). עכברים אשר הראו סימנים של כאב (בטן, לא מוכן לזוז, כישלון החתן) 1 שעות לאחר הניתוח היו מורדמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר יש התאושש לחלוטין, להחזיר אותו לחברה של עכברים אחרים. </li></ol></li></ol> 4. בידוד ועיבוד של דם וריאות עבור זרימת cytometry ו היסטולוגיה &lt;Ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב endpoints המחקר, להכין עכברים להערכות שונות histopathologic אם תרצה. 90 דקות לפני המתת חסד, לתת לכל עכבר הזרקה intraperitoneal של bromodeoxyuridine (BrdU, 50 מיקרוגרם / גרם משקל העכבר) בריכוז של 6.25 מיקרוגרם / μL ב 1x PBS. הערה: מלאי קפוא של bromodeoxyuridine מומס משמשים בתוך חודש לאחר ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני המתת חסד, עם העכבר הרדים, לאסוף דם retroorbital (&gt; 500 μL) באמצעות צינורות נימי heparinized, ולאחר מכן להעביר צינורות מצופים dipotassium EDTA שנערך על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר ריאות ורקמות חלב נותרות, לעשות חתך קו אמצע עם מספריים מן הבטן התחתונה אל הפה כדי לחשוף את החזה ואת החללים הצפק (איור 2 א), וכן לקלף את העור רוחבי כדי גם לחשוף את 4 וה 5 הנותרים התקינים ה החלב בְּלוּטוֹת הַרוֹק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו את רקמת הבלוטות החלב הנותרות ולבחון אלא לשלול לצמיחה מחודשת הגידול הראשוני על ידי הערכת סידורי מחולק פורמלין קבוע פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה על ידי hematoxylin ו eosin (H &amp; E) מכתים ( איור משלים 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הריאות, לפתוח את דופן הבטן כדי הסרעפת עם מספריים, ולאחר מכן להרדים את החיה על ידי חיתוך אבי העורקים הבטן לניקוז דם לפני זלוף של הריאות ( איור 2B -2C ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת לאורך כלוב הצלעות מתוך גישה הבטן הקפד להימנע הריאה והלב. לאחר מכן, לחשוף את החזה על ידי חיתוך דרך הצדדים לרוחב של כלוב הצלעות ( איור 2 ד ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 23 מד על מזרק 20 מ&quot;ל, ריאות perfuse עם ~ 5.0 מ&quot;ל DPBS (~ 10 מ&quot;ל / דקה) דרך החדר הימני של הלב עד הריאות להפוך לגמרי לבן ( איור 2E -2F ). מיד לחתוך את הלב מן הספינה הראשיתכל כך דם לא חוזר אל הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רקמת הריאה להיות קבוע ומעובד עבור הערכות histopathologic, להזריק ~ 1.0 מ&quot;ל פורמלין 10% ב 4 מעלות צלזיוס בצד חשוף trachea חשוף כלפי מעלה כלפי הריאות באמצעות מחט 23 מד ( איור 2G - 2H ). להפסיק הזרקת הריאות פעם מורחבות לחלוטין ומלא מקבע ( איור 2I ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות ריאות בלו מ קנה הנשימה, ואת רקמת תיקון רקמת ריאות נייטרלי שנאגרו פורמלין עבור הטבעה פרפין הבאים או בינוני אוקטובר הקפאה, לכל הליכים היסטופתיות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן כמותי להעריך נטל גרתי הריאות על ידי חתך סדרתי של רקמת הריאות FFPE ולהעריך קטעים microtome (100 מיקרומטר, שלושה עשר סעיפים), על ידי H &amp; E מכתים ( איור 1 ב ). </li></ol>

<ol>
	<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).</li><li>Howlader, N. N. A., Krapcho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).</li><li>National Comprehensive Cancer Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).</li><li>Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+recurrent+or+metastatic+breast+cancer:+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).</li><li>Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li><li>Kouros-Mehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-3+links+tumor+differentiation+and+dissemination+in+a+luminal+breast+cancer+model.">GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model.</a> Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Nature. 436, 518-524 (2005).</li><li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLT1+signalling+in+metastasis-associated+macrophages+activates+an+inflammatory+signature+that+promotes+breast+cancer+metastasis.">FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis.</a> J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).</li><li>Verkooijen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients'+refusal+of+surgery+strongly+impairs+cancer+survival.">Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival.</a> Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-metastatic+niches:+organ-specific+homes+for+metastasis.">Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).</li></ol>

למחברים אין כל גילוי על סתירה לנתונים המוצגים כאן.

שינויים ופתרון בעיות: כאשר בוטה לנתח את הגידול במרחק של דופן הבטן, הגידול עשוי להישאר דבקים בדופן הבטן. זה נצפתה &lt;5% של עכברים מוזרק גידול (נתונים לא מוצג). עבור עכברים עם גידולים הדבקים בקיר הבטן, העכבר צריך להיות מורדמים...

לנשים בצפון אמריקה יש סיכון של 12% לכל החיים לפתח סרטן שד 2 ; רוב האנשים האלה יהיו גידולים ראשוניים הוסרו באמצעות ניתוח, ובהתאם לסוג הסרטן, לאחר מכן יקבלו טיפול ממוקד, אנדוקריני, כימותרפיה ו / או הקרנות בסביבה אדג&#39;ובנטית 3 . דוגמאות לכך כוללות נשים המאובחנות בסרטן חיובי של קולטן הורמון המקבל טיפולים נגד אסטרוגן ונשים עם גידולים חיוביים ל- HER2 המקבלים טיפולים המבוססים על HER2 עם הקרנות / כימותרפיה, בעוד שאף טיפולים ממוקדים אינם זמינים עדיין לגידולים שליליים שליליים 3 . למרות ההתקדמות בקרינה, כימותרפיה, טיפולים מותאמים אישית והורמונים המשלימים כריתה כירורגית, המחלה חוזרת ב -30% -70% מהנשים המאובחנות עם מחלת שלב II או III 4 , מכיוון שהטיפולים אינם יעילים במידה רבה במיגור מחלות גרורות באיברים מרוחקים, כולל ריאה, עצם, bגשם ו / או כבד 5 . זה משמעותי במיוחד בהתחשב בכך שכאשר מחלת גרורות מתרחשת בהעדר גידול מחודש של הגידול, משמעות הדבר היא שתאים ממאירים מופצים היו קיימים כבר באיברים משניים בזמן הניתוח הסופי. לכן טיפולים מסוגלים לחסל או להאט את הצמיחה של גידולים גרורתיים נדרשים בדחיפות. בעוד מודלים העכבר נובו של קרצינוגנזה החלב כבר אינפורמטיבי להפליא מנגנוני חשיפת ויסות התקדמות ניאופלסטית 1 , מודלים קיימים גם מספר מגבלות. אחד מהם הוא העובדה כי דה novo מודלים מהונדס בדרך כלל לפתח גידולים ראשוניים בבלוטות החלב מרובים, שבו הגידול הראשוני נטל מגבלות משך הלימודים. בעוד שתא הגידול העיקרי בתאי הזרע הגרורתי עשוי להתרחש מוקדם בהתקדמות ניאופלסטית במודלים אלו, התפתחות גלויה של גידולים גרמניים מתרחשת מאוחר,N את מודל העכבר ואת רקע זן, הוא לעתים קרובות חלקית החדירה 1 . זה עוד מגביל את התועלת של מודלים של נובו לגילוי של מולקולות המסדירות גרורות באיברים משניים, וכן להערכת יעילות פרה קלינית של טיפולים בסביבה adjuvant. כדי לעקוף את המגבלות הללו, פיתחנו מודל נוטו autochthonous של גרורות קרצינומה החלב לריאות. אמהות מהונדסות מהונדס ( כלומר , MMTV-PyMT על רקע FVB / n זן למחקרים המתוארים כאן) הנושא בשלב מאוחר של גידולי החלב novo הם בגילאי ~ 100 ימים 6 , ובנקודה שבה גידולים העיקריים שלהם הם resected כירורגי ו ניתק באופן אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות. השעיות (1 x 10 6 תאים) הם בתורו autantotopically explanted לתוך 6-7 בן מקבלי נקבה עכברים syngeneic, שבו אחד גידולי החלב העיקרית לפתח על 38-60 יום תקופה ( 3 ), עכברים מקבלים מורדמים וגידולים ראשוניים הם resected כירורגי כך לצמיחה מחודשת של הגידול באתר כירורגית ממוזער, עולה בקנה אחד עם ניתוח בנשים ( איור משלים 1 ). על רקע FVB / n זן, עכברים לפתח foci גרורתי היסטולוגית הריאות עם החדירה 45% על ידי ~ 115 ימים לאחר הניתוח ( איור 1 ב ). עם זמן חביון ממושך זה של גידול גידולי גרורתי, המודל ממוקם באופן ייחודי עבור מתן טיפול אדג&#39;ובנטי, וכן להבהרה והערכת ביולוגיה בסיסית המשפיעים על התקדמות גרורת בעקבות הסרה כירורגית של גידולים ראשוניים.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex bottle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Bio&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &amp;micro;m nylon strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidone)&amp;ndash;Iodine complex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0.3 mL insulin syringe</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip applier&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip remover&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinized capillary tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with dipotassium EDTA&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-freezing medium&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

יותר מ 75% מהעכברים המקבלים שקיבלו 1 x 10 6 תאים מגידולי החלב העיקריים שנגזרו מעכברי MMTV-PyMT, פיתחו אדנוקרצינומות חד-פעמיות בגודל של 172 עד 450 מ&quot;מ 3 בתוך 38-60 ימים (נתונים לא מוצגים). עכברים זכאים אקראיים נרשמות מכן לקבוצות מחקר לאחר כריתה כירורגי...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis at JoVE.com

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג&#39;ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג&#39;ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של<em&gt; דה נובו</em&gt; גרורות סרטן החלב

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

surgical-procedures-methodology-for-preclinical-murine-model-de-novo

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

13.8K Views.  Oregon Health & Science University.  מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג'ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג'ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך א?...

Video: Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

מידול גרורות מוח באמצעות הזרקה תוך גולגולתית והדמיית תהודה מגנטית

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Medicine

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

דגם Murine פרה של גרורות כבדית

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

במודל עכבר orthotopic של שד ספונטני סרטן גרור

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video