Yazarlar, histopatoloji yardımı için Jo Hill&#39;e, ameliyat tekniği eğitimi için Dr. John Gleysteen&#39;e, videografi yardımı için Tessa Diebel&#39;e, eleştirel görüş ve tartışmalar için Wong ve Coussens laboratuvarlarının tüm üyelerine ve mali destek için OHSU Knight Cancer Institute&#39;a teşekkür ederler. Yazarlar, T32GM071388-10 ve T32CA106195-11&#39;den CEG&#39;e, NCI / NIH&#39;ye, Savunma Bakanlığı Göğüs Kanseri Araştırma Programı&#39;na, Susan G Komen Vakfı&#39;na, Meme Kanseri Araştırma Vakfı&#39;na ve Bir Kansere Karşı Stand Up - Lustgarten Vakfına verdikleri desteği onaylarlar MHW&#39;ye Vakfı Ödüllendiren Kadın Sağlığı Çemberi olan LMC&#39;ye ve MHW&#39;ye ve LMC&#39;ye Brenden-Colson Pankreas Sağlığı Merkezi&#39;ne Pankreas Kanseri Yakınsama Düşü Ekipleri Translasyonel Araştırma Granti (SU2C-AACR-DT14-14) verdi.

Aşağıdaki protokolde kullanılan hayvanlar, Hayvan Refahı Yasası düzenlemelerine ve Halk Sağlığı Hizmeti (PHS) Politikasına uyumlu olacak şekilde tasarlanan Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi&#39;nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından kapsanmaktadır. Steril koşulların bakımı: Sterilize edilmiş aletler kullanılmalı ve fareler arasında steril gazlı bezle silinmeli, PBS içinde durulanır ve ardından en az 15 dakika dezenfekte edici% 70 etanolle sterilize edilmelidir. Hayatta kalma ameliyatları için cerrahi bir başlık, yüz maskesi, elbise ve eldiven giyilmelidir. Hayatta kalma ameliyatları için hayvanın ameliyat öncesi hazırlığı aşağıdaki protokole dahil edilmiştir. Reaktiflerin ve ekipmanların bir listesi için Tablo 1&#39;e bakın. 1. Primer Memeli Tümörlerden Tek Hücreli Süspansiyonların İzolasyonu ve Hazırlanması <ol><li> Denekli dişi 100 günlük transgenik MMTV-PyMT (FVB / n) farelerde anestezi uygulayın ve c altında tutunAnestezi maskesi vasıtasıyla% 2 izofluran uygulayarak onutuous sedasyon. Farenin, ayak bileği sıkışmayan bir refleksle düzgün şekilde anestezi edildiğinden emin olun. </li><li> Steril bir ortamda meme tümörünü steril makas kullanarak üstteki deri ve çevre doku dokusundan ve / veya lenf düğümlerinden ayırarak 100 günlük transgenik dişi MMTV-PyMT (FVB / n) farelerdeki primer meme tümörlerini rezekte edin. Anestezi uygulanmış fareleri servikal dislokasyonla euthanize edin. </li><li> Steril makas veya bir neşterle, primer tümörleri elle küçük parçalara (~ 1.0 mm 3 ) koyun. Tümör parçalarını 3.0 mg / mL kollajenaz A&#39;ya ve 4.0 U / mL DNase I&#39;e DMEM içerisinde çözündürün. 1.0 cm çaplı tümör için ~ 10 mL yukarıdaki sindirim ortamını kullanın. <ol><li> Steril 25 mL&#39;lik bir şişede ~ 125 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de 40 dakika süreyle steril bir karıştırma çubuğu ile sindirim yapın. </li></ol></li><li> % 10&#39;luk nihai bir seyreltiye fetüs sığır serumu (FBS) ekleyerek sindirimi durdurun ve tüm karışımı wEt buz burada muhafaza edilir. </li><li> Sindirilmiş tümör süspansiyonunu 0,7 μm&#39;lik bir naylon süzgeçten 50 mL&#39;lik bir konik tüpe süzün ve süzgeçte kalan tümörleri atın. Süpernatantı 300 xg&#39;de 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1.0 cm tümör başına pelet 10 mL DMEM&#39;de süspansiyon haline getirin ve 0.7 μm&#39;lik bir naylon süzgeç ile yeniden filtre edin. Hücre konsantrasyonunu sayın, daha sonra 4 ° C&#39;de 300 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 2 x 10 7 canlı hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda% 90 FBS ile% 10 dimetil sülfoksit içinde süspanse edin pelet. Tüm primer tümörün tek hücre süspansiyonlarını -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Anne tümörünün ortotopik enjeksiyonu <ol><li> Donmuş primer tümör süspansiyonlarını 37 ° C&#39;de kısmen çözdürüp dondurulmuş pelet kriyojenik tüpten 20 mL DMEM&#39;ye salınana ve hücreleri sayana kadar eritin. 4 ° C&#39;de 300 xg&#39;de santrifüjleyin ve hücreleri 1: 1 DMEM&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin: büyüme faktörü azaltılmış çözündürülmüş bazal membran hazırlığı eEngelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan 1 x 10 7 hücre / mL konsantrasyonda çıkarıldı (Bkz . Malzeme Tablosu ). </li><li> Anestezi uygulanmış alıcı dişi syngeneic fare ventral tarafı yerleştirin ve bir anestezi maskesi ile% 2 izofluran uygulayarak sürekli sedasyon altında korumak. </li><li> Sağdaki 4. meme bezi enjeksiyon alanını aerosol haline getirilmiş% 70 etanol kullanarak sterilize edin ve steril bir pamuklu çubuk ile Poli (vinilpirolidon) -İyodan geçirin. </li><li> 29 G 0.3 mL insülin şırıngası kullanılarak, 6 ila 10 haftalık dişi FVB / N fare temizlenmemiş sağ 4 meme bezine 100 uL (dondurulmuş primer tümör süspansiyonlardan, 1 x 10 6 canlı hücreler) konik yan enjekte edilir. </li></ol> 3. Ortotopik meme tümörünün cerrahi rezeksiyonu <ol><li> Tümör hücresi enjekte edildikten sonra 38-60 gün sonra, farelere hacim olarak 3 mm&#39;lik 450-172 arasında [x uzunluğunda uzanan ortotopik tümör hacimleri arzetmeyen ötenazi (genişliği 2 <// 2] (enjekte edilen farelerin yaklaşık% 75&#39;i). </li><li> Bir anestezi maskesi ile% 2 izofluran uygulamak suretiyle sürekli sedasyon altında uygun tümör boyutu ventral tarafı gösteren anestezi uygulanmış fareler yerleştirin ve fare uygunsuz ayak tutam refleksiyle düzgün şekilde anestezi doğrulayın. Sedasyon sırasında kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi uygulayın. </li><li> Primer tümörü çevreleyen cerrahi alanı sterilize etmek için% 70 etanol püskürtün, daha sonra bir steril pamuklu çubuk ile Poli (vinilpirolidon) -İyoden uygulayın. NOT: Cerrahi bölgedeki epilasyon% 5 farelerde deri ekskoriasyonları ve / veya enfeksiyonlarla sonuçlanmıştır ve bu nedenle bu adımdan çıkarılmıştır (veriler gösterilmemiştir). </li><li> Şekil 1C&#39;de gösterildiği gibi, tümörün medial-kaudal künt makas kullanılarak ilk cilt insizyonu yapın. </li><li> Sonra, tümörün medialinde cildin üstün bir eksizyonu yapın ( Şekil 1C ). Herhangi bir vaskülatürü cauterize etme ihtiyacına dikkat edin.Insizyonu uzatmadan önce deride bulunan tümörü düzenleyebilir. </li><li> Deri kesisini lateral olarak (tümörün posterioru) devam edin, daha sonra üstün bir deri eksizyonu (tümöre lateral) ve medial eksizyonu (tümöre üstün) ( Şekil 1C ) yapın. </li><li> Cilt tümör çevresinde çevresel olarak eksize edildikten sonra ( Şekil 1C ), tümörü karın duvar kas sisteminden uzakta keserek ve meme bezlerini sağlam tutarak, forseps kullanarak tümörün üstündeki cildi kaldırın. </li><li> (Künt diseksiyon ile) belirlenmesi ve 4 ve 5. meme bezlerinin içinden geçen büyük gemiler dağlamak. </li><li> Tüketim yaklaşık tümör serbest dağlama sitesinde 4 ve 5. meme bezlerinin yarısı üzerinde bulunan deri ve meme bezleri (Şekil 1C) bölümleri. </li><li> Kanama durumunda, aktif kanamayı tanımlayınGemileri derhal saklayın ve hemen onlara koterleyin. 250 μL&#39;den fazla kan kaybederse, fareyi çalışmadan çıkarın ve euthanize edin. </li><li> Yara klipleri ile yara klipi uygulayıcısı kullanarak eksizyon yerlerini kapatın ( Şekil 1C ). NOT: Ameliyattan 10 gün sonra yara klipslerini bir yara klipsi çıkarıcı ile çıkartın. </li><li> Deri altı (hayvanin vücut ağırlığının% 4&#39;ü) sıcak steril salin uygulayın ve hayvanı bir ısı lambası ile sıcak tutun. Anesteziden kurtulma işlemi sırasında 5-10 dakikada bir hayvanları kontrol edin. NOT: Bupivakain veya lidokain uygulaması post-operatif mortaliteyi artırmıştır (veriler gösterilmemiştir). Ameliyattan 1 saat sonra ağrı belirtileri gösteren (ağrıyan, taşımak istemeyen, damat yapamayan) fareler ötenazi görmüştür. <ol><li> Fareler tamamen kurtarıldıktan sonra, diğer farelerin şirketlerine geri gönderin. </li></ol></li></ol> Akım Sitometri ve Histoloji için Kan Akciğerinin İzolasyonu ve İşlenmesi &lt;ol&gt; <li> Çalışma bitim noktalarında, istenirse fareleri çeşitli histopatolojik değerlendirmeler için hazırlayın. Ötenaziden 90 dakika önce, her fareye, 1x PBS&#39;de 6.25 μg / μL&#39;lik bir konsantrasyonda bromodeoksiüridin (BrdU, 50 μg / g fare ağırlığı) intraperitoneal bir enjeksiyonu yapın. NOT: Dondurulmuş çözünmüş bromodeoksiuridin stokları, hazırlandıktan sonraki 1 ay içerisinde kullanılır. </li><li> Anestezi uygulanan fare ile ötenazi uygulamasının başlamasından 10 dakika önce, heparinize kılcal tüpler kullanarak retroorbital kan (&gt; 500 μL) toplayın ve ardından buz üzerinde tutulan dipotasyum EDTA ile kaplanmış tüplere aktarın. </li><li> Göğüs ve periton boşlukları (Şekil 2A) ortaya çıkarmak için ağza alt karın makas ile orta hat kesi yapmak, akciğerler ve geri kalan meme dokusu kaldırmak ve deri soyma için yanal olarak da meme inci kalan sağ 4. ve 5. ortaya çıkarmak için bezleri. </li><li> Geriye kalan meme bezi dokusunu tüketim yapın ve i(FFPE) dokusunu, hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama ile değerlendirerek birincil tümör büyümesini göz önüne almamaktadır ( Ek Şekil 1 ). </li><li> Akciğerleri çıkarmak için abdominal duvarı makasla diyaframa açın, akciğerlerin perfüzyonundan önce kan boşaltmak için karın aortunu keserek hayvanını euthanize edin ( Şekil 2B -2C ). </li><li> Diyaframı, akciğer ve kalpten kaçınmayı sağlayan abdominal bir yaklaşımla kaburga kafesi boyunca kesin. Daha sonra, göğüs kafesini, göğüs kafesinin yan kenarlarını keserek maruz bırakın ( Şekil 2D ). </li><li> 20 mL şırınga üzerinde 23 gauge iğne kullanarak akciğerler tamamen beyaza dönüşene kadar kalp sağ ventrikülünden ~ 5.0 mL DPBS (~ 10 mL / dakika) ile akciğerleri boşaltın ( Şekil 2E -2F ). Ana gemiden kalbi derhal kesYani kan akciğerine yeniden nüfuz etmez. </li><li> Akciğer dokusunun histopatolojik değerlendirmeler için işlenmesi için, 23 gauge iğne ( Şekil 2G - 2H ) kullanarak maruz kalmış trakea şişkin tarafı yukarı doğru akciğerlere doğru ~ 1.0 mL% 10 formalin 4 ° C&#39;de enjekte edin. Akciğerler tamamen genişletilir ve fiksatif ile dolduğunda enjeksiyon kesilir ( Şekil 2I ). </li><li> Trakeadan akciğer loblarını ayırın ve standart histopatolojik prosedürlere göre akupunktur akciğer dokusunu nötral tamponlu formalinde, sonraki parafin yerleştirme veya OCT-dondurucu ortam için düzeltin. </li><li> Akciğerlerdeki metastatik yükü FFPE akciğer dokusunun kesit bölümlemesi ile nicel olarak değerlendırın ve mikrotom kesitlerini (100 μm, on üç bölüm) H &amp; E boyama ile değerlendirin ( Şekil 1B ). </li></ol>

<ol>
	<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).</li><li>Howlader, N. N. A., Krapcho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).</li><li>National Comprehensive Cancer Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).</li><li>Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+recurrent+or+metastatic+breast+cancer:+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis,+treatment+and+follow-up.">Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).</li><li>Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li><li>Kouros-Mehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-3+links+tumor+differentiation+and+dissemination+in+a+luminal+breast+cancer+model.">GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model.</a> Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Nature. 436, 518-524 (2005).</li><li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLT1+signalling+in+metastasis-associated+macrophages+activates+an+inflammatory+signature+that+promotes+breast+cancer+metastasis.">FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis.</a> J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).</li><li>Verkooijen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients'+refusal+of+surgery+strongly+impairs+cancer+survival.">Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival.</a> Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-metastatic+niches:+organ-specific+homes+for+metastasis.">Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).</li></ol>

Yazarlar burada sunulan verilerle çelişen herhangi bir açıklama yapmamıştır.

Değişiklikler ve sorun giderme: Tümör karın duvarından uzak künt diseksiyon yaparken, tümör karın duvarına yapışmış kalabilir. Bu, tümör enjekte edilen farelerin &lt;% 5&#39;inde gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). Karın duvarına yapışık tümörleri olan fareler için, fare, birincil tümör yeniden büyümesi olmaksızın rezeksiyon zor olduğu için ötenazi yapılmalıdır. Model / teknik sınırlamaları...

Kuzey Amerika&#39;daki kadınların yaşam boyu% 12 oranında meme kanseri riski 2 vardır ; Bu kişilerin çoğunluğunun ameliyat yoluyla primer tümörler çıkarılacağı ve kanser alt tipine bağlı olarak adjuvan ortamında hedefe bağlı, endokrin, kemo ve / veya radyoterapi alacağı 3 . Örnekler, anti-östrojen terapileri alan hormon reseptörü pozitif kanserler tanısı konan kadınlar ve radyasyon / kemoterapi ile HER2 hedefli terapiler alan HER2 pozitif tümörleri olan kadınlar olmakla birlikte, üçlü negatif tümörler için henüz hedeflenmiş tedaviler mevcut değildir 3 . Radyasyon, kemoterapi, kişiselleştirilmiş ve hormonal esaslı cerrahi rezeksiyon eklemelerindeki ilerlemelere rağmen, evre II veya III hastalık 4 olarak teşhis edilen kadınların% 30-70&#39;inde hastalık tekrar eder; çünkü terapiler uzak organlarda metastatik hastalığın ortadan kaldırılmasında büyük ölçüde etkisizdir; Akciğer, kemik, bYağmur ve / veya karaciğer 5 . Metastatik hastalık primer tümör yeniden büyümesinin olmaması durumunda ortaya çıktığı zaman bu, özellikle önemli bir konudur; bu da, kesin ameliyat sırasında, dissemine malign hücrelerin muhtemelen ikincil organlarda zaten mevcut olduğunu ima eder. Bu nedenle, metastatik tümörlerin yok olmasını veya yavaş büyümesini sağlayabilen terapilere acilen ihtiyaç vardır. Meme karsinogenezisin de novo fare modelleri, neoplastik ilerlemesinin 1 düzenleyen mekanizmaların açığa dikkat çekecek derecede bilgilendirici olmuş olmakla mevcut modeller ayrıca çeşitli sınırlamalara sahiptir. Bunlardan biri, de novo transgenik modellerin tipik olarak birden fazla meme bezi içerisinde primer tümörler geliştirdiği gerçeğidir; burada primer tümör yükü çalışma sürelerini sınırlar. Primer tümör hücresi kaçışı ve metastatik tohumlama, muhtemelen bu modellerde neoplastik progresyonun erken döneminde ortaya çıkarken, metastatik tümörlerin açık gelişimi geç ortaya çıkar veFare modeli ve gerinim arka planı, çoğunlukla kısmen penetrantır 1 . Bu ayrıca, ikincil organlarda metastazı düzenleyen moleküllerin keşfi için de novo modellerin kullanımını sınırlar ve adjuvan ortamında önleyici etkinliğin değerlendirilmesi için sınırlandırılır. Bu kısıtlamaları ortadan kaldırmak için, akciğerlere yönelik meme kanseri metastazının de novo otonom modeli geliştirdik. Son evre de novo meme tümörleri taşıyan ebeveyn transgenik dişiler (diğer bir deyişle , burada açıklanan çalışmalar için FVB / n suşu zemininde MMTV-PyMT) yaklaşık 100 gün 6 yaşlandırılır ve bu noktada primer tümörler cerrahi olarak rezeke edilir ve enzimatik olarak Tek hücreli süspansiyonlar. Süspansiyonlar (1 x 10 6 hücre) sırayla ortotopik olarak 6-7 haftalık alıcı eş merkezli dişi farelere eksplane edilir ve burada tekli primer meme tümörleri 38 ila 60 günlük süre boyunca gelişir ( 3 mm), alıcı farelere anestezi yapılır ve primer tümörler cerrahi cerrahi alanda tümörün yeniden büyüdüğü kadınlarda cerrahi (Ek Şekil 1) ile uyumlu, en aza inecek şekildedir çıkartılmaktadır. Fareler, FVB / n suşu zemininde, ameliyat sonrası ~ 115 gün boyunca% 45 penetransli akciğerlerde histolojik olarak saptanabilir metastatik odak gelişir ( Şekil 1B ). Metastatik tümör büyümesinin uzatılmış gecikmesi ile model, adjuvan tedavi sunumu için ve primer tümörlerin cerrahi olarak çıkarılmasını takiben metastatik ilerlemeyi etkileyen biyolojiyi aydınlatmak ve değerlendirmek için benzersiz bir şekilde konumlandırılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex bottle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Bio&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &amp;micro;m nylon strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidone)&amp;ndash;Iodine complex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0.3 mL insulin syringe</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip applier&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip remover&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinized capillary tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with dipotassium EDTA&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-freezing medium&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Daha MMTV PyMT farelerden türetilen primer meme tümörlerinden, 1 x 10 6 hücre alan alıcı farelerin% 75, daha 172 ila 450 mm3 38-60 içinde gün arasında değişen tek bir meme adenokarsinomu geliştirmek (veriler gösterilmemiştir). Daha sonra randomize edilmeye uygun olan fareler, gösterildiği gibi primer tümörlerin cerrahi rezeksiyonunu takiben çalışma gruplarına alınır ( Şekil 1C ). Primer tümör yeniden büyümes...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis at JoVE.com

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir.

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

surgical-procedures-methodology-for-preclinical-murine-model-de-novo

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

13.8K Görüntüleme.  Oregon Health & Science University.  Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir. 

Video: Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Kanser Araştırmaları

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

İntrakraniyal Enjeksiyon ve Manyetik Rezonans Görüntüleme Ile Beyin Metastazlarının Modellenmesi

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Tıp

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Karaciğer metastazları Klinik öncesi fare modeli

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Fare Orthotopic metastatik meme kanseri Model oluşturma ve fare radikal mastektomi gerçekleştirme

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler